专利名称：微生物的检测的制作方法
微生物的检测本申请是申请日为2002年2月5日、发明名称为“微生物的检测”的中国发明专利申请02805705. 8的分案申请。本发明涉及检测胶态混合物如啤酒中的微生物尤其是酵母和细菌的改进方法。还涉及在空气和可以处在液相悬浮物或可以被溶解的固体试样(如食物或细菌孢子)中检测微生物。在食品和饮料如啤酒的生产过程中，伴随着检测是否存在某些微生物以确保最终产品的质量。例如酿造过程中可能需要每隔几个小时就对至少25ml的试样进行在线测试，试样体积优选为250ml。必须先将可能包含微生物如酵母和细菌的颗粒物质从试样中分离出来，然后再对其进行检测从而确定其中是否存在特定微生物。用于实现该目的的装置包括Bibby —次性真空过滤器单元和Nalgene过滤器固定器，前者带有一个平均孔径为 0. 45 μ m的平面过滤器，后者带有接收器和一个平均孔径为0. 45 μ m或0. 2 μ m的平面过滤器(例如Merck实验室供应目录1998，p482)。此类装置允许过滤最大体积为IOOml的试样，其平面积为50cm2，由于使用复杂，所以检测一个试样可能需要30分钟。一旦过滤完最大体积的试样，过滤器就会被试样液体(例如贮藏啤酒、麦芽酒和其它胶状溶液)中的颗粒物质如蛋白质堵塞，而任何随后的过滤都将需要很大压力，容易导致细胞溶解，从而防碍微生物的检测，产生错误的结果。相对于应用本发明的装置和方法的要求而言，现有技术的装置基本上要求更长的时间从试样中分离和检测微生物。WO 01/11006在现有技术的基础上提出了一些改进，不仅可对微生物进行更快速的分离和检测，并使随后的微生物回收较为简单和容易，从而使微生物的测定也较为简单和容易。本发明的装置和方法与WO 01/11006公开的技术方案有着显著的区别，尤其(如下详述)是本发明的方法还包括一洗涤步骤而不仅仅是再悬浮步骤。本发明的装置和方法还通过提供一种更快速和简单的分离和检测试样中微生物的方法，从而在WO 01/11006和其它现有技术的基础上作了进一步的改进。具体而言，已发现本发明的装置可对只包含少至1-3种细菌的IOOml体积的测试溶液中的全部细菌进行快速检测。使用含1-3种细菌的更大体积的IOOOml贮藏啤酒也可获得类似的结果。根据本发明，提供一种检测液体试样中是否存在一种微生物的方法，包括以下步骤i)使所述试样通过过滤装置的试样入口，该过滤装置包括大量中空纤维滤过膜， 膜上附着有一种特异性结合对的第一成员，所述微生物显示该特异性结合对的第二成员， 该膜具有第一和第二末端、外表面和界定一个腔的内表面，每一个该膜的第一末端是开放的并与试样入口相通，每个该膜的该第二末端中的流动受到限制，以使该流动仅发生在该第一末端和该膜的孔，试样混合物通过膜孔过滤，而滤渣留在该膜的该腔内；ii)洗涤来自该膜内的该腔的该滤渣的未结合部分；iii)检测是否存在任何附着于膜上的该特异性结合对；iv)把检测步骤(iii)的结果与该液体试样中是否存在该微生物联系起来。
试样的体积可以至少是25、50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900 或 IOOOml0“一种特异性结合对的成员”是指这样的两种不同分子中的一种所述分子在其表面或一个腔中具有一个区域，该区域特异性地与另一分子特异性结合，因而被定义为具有特定空间和极性结构的另一分子的补充物。通常把特异性结合对的成员称之为配体和受体 (抗配体)、Sbp成员和Sbp配体、Sbp成员等。这些是常见的免疫对如抗原-抗体的成员， 虽然所述术语确实还具有包含其它特异性结合对的更广泛的含义。本文所使用的各种语法形式的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，也就是包含一种抗体结合部位或互补位的分子。这种分子也可称之为免疫球蛋白分子的“抗原结合片段”。“附着”是指特异性结合对的第一成员被物理束缚并防止或阻止其与膜分离。这种附着可以通过与膜的共价结合，例如通过抗体与膜的共价结合，或者可以通过其它方式如范德华力。因此，一种特异性结合对的第一成员如抗体可以简单地被一个膜上的纤维截留而不需要将与膜共价结合。具体而言，抗体和特异性结合对的其它第一成员可通过与戊二醛交联而与聚丙烯膜共价结合。交联方法对本领域技术人员而言是显而易见的，例如可通过对反应单体的聚丙烯基团进行氧化或商化来实现。为了测试不处在液相的试样，例如空气试样、颗粒物质或其它固体如食品，就必须先将其置于悬浮液中。这种测试的完成有两种基本情况测试空气或其他气体试样中微生物的存在，测试固体试样如粉末和食品中微生物的存在。1.气体试样的测试为了测试气体试样如空气中是否存在一种特殊的微生物，就要使用具有足以截留所选微生物的孔径的空气(也就是气体)过滤装置。例如炭疽(Bacillus anthracis)直径为1 μ m，那么就要使用孔径为0. 2 μ m的过滤装置。空气过滤装置还可包括一个鼓风机以促进空气流过过滤器，而大量的空气就可在相对短的时间内通过过滤器，所有尺寸大于孔径的颗粒物质则留下来。然后将过滤器与一种微生物可悬浮或溶解于其中的试样液体(例如一种缓冲溶液或其它溶液、液体或混合物，其中特定微生物可悬浮或溶解)相接触，如果合适的话可以将任何截留的微生物置于悬浮液中或将其溶解(也就是液相)。一旦捕获微生物并将其置于悬浮液/溶解的初始步骤完成，就可以实施本发明的方法中剩下的步骤(也就是如上所述的步骤(i)-(iv))。可以溶解或悬浮特定微生物的试样液体如缓冲液或其它溶液、液体或混合物的确切性质取决于微生物本身和该步骤(i)中所用特异性结合对的第一成员的性质。试样液体的作用就是使特定微生物和特异性结合对的第一成员相互作用，从而可以合适地形成该特异性结合对，以允许进行特定微生物的检测。例如，特异性结合对的第一成员可以和该微生物或一种特定微生物形成一种特异性结合对，从而可以进行微生物检测，一种特异性结合对的形成与特定微生物的存在有关。2.固体的测试为了测试固体试样如食品(如蛋糕或面包)中是否存在一种特定微生物，该固体就必须与一种该微生物可悬浮或溶于其中的试样液体相接触，如果合适的话可以将所有截留下来的微生物置于悬浮液中或将其溶解。如前所述，一旦捕获微生物并将其置于悬浮液 /溶解的初始步骤完成，就可以实施本发明的方法中剩下的步骤(也就是如上所述的步骤 (i)"(iv))。因此，根据本发明，还提供一种检测固体试样中是否存在一种微生物的方法，该方法包括以下步骤a)使该固体试样与一种试样液体相接触，以使该微生物处在液相，从而得到一种液体试样；b)使该液体试样完成步骤(i)-(iv)的方法。测试固体试样的另一例子就是测试包装如信中的内容物。实施该方法，也就是使该固体与一种试样液体相接触，然后采用步骤(i)-(iv)来确定特定微生物的存在与否。然而，必须首先去除包装的内容物。为了实现这一目的，本发明提供一种装置，该装置包括可放置该包装的第一室、含有试样液体的第二室、用于改变第一、二室相对压力的装置(如泵或注射器)，其中第二室通过带腔的穿刺器具与第一室相通，由此可使流动发生。为了确定是否存在某种特定的微生物，本发明还提供一种测试包装内容物的方法，包括将该包装置于第一室，改变第一、二室的相对气压，并使该包装与该穿刺器具相接触，从而将该包装刺破，并使包装中的固体物质，尤其是颗粒物质从该包装流进所述试样液体，并悬浮或溶于该试样液体，从而得到一种液体试样。然后使该液体试样完成步骤 (i)-(iv)的方法，并检测任何微生物。为了确定是否存在某种特定的微生物，本发明还提供一种测试包装中内容物的方法，包括如下步骤a)将该包装置于第一室中，该室通过一穿刺器具与盛有试样液体的第二室相通；b)使该包装与穿刺器具相接触，从而使该包装中的任何固体物质能够经该穿刺器具通入该第二室的该试样液体，以得到一种液体试样；和c)使该液体试样完成步骤(i)-(iv)的方法。该方法还包括改变第一、二室相对气压以使第一室压力高于第二室压力的步骤。 如此促进或完成任何固体物质如颗粒物质从第一室的包装到第二室的移动。为了将该包装从该装置中安全除去，可以采用一种自封垫与穿刺器具相接触，包装从穿刺器具中一旦取出，衬垫就会自封，从而阻止任何其它固体继续从包装中漏出，包装则得以安全取出。穿刺器具可以是密封的，包装一被刺破，密封就打开。第二室的压力相对于第一室低，通过这种方法可以保持第一、二室的压力差。也或者，刺穿以后再改变室中的压力。穿刺器具也可以是自封式的。因此根据本发明，还提供一种测试包装中内容物的方法，用以确定其中是否存在某种特定微生物，包括将该包装置于所述的第一室中，使包装与穿刺器具相接触，使包装被刺穿，包装中的固体物质尤其是颗粒物质能够穿过包装进入到试样缓冲剂(或者所述的另外一种溶液、液体或混合物，特定微生物可悬浮或溶于其中)，然后降低第二室相对于第一室的压力，使该固体物质从包装进入试样缓冲剂并悬浮或溶于其中(或者所述的另外一种溶液、液体或混合物，特定微生物可悬浮或溶于其中)。当然也可以选择不采用第一、二室的压力差而通过重力来实现固体物质在两室间的移动。
在测试气体和固体试样中是否存在某种特定微生物的所有实例中，本发明提供了检测快速、结果准确的显著优点。测定一个试样所用的时间相对于其它可比较的检测如 ELISA和PCR少很多倍。使用本发明的标准的检测时间为15分钟。当进空气试样的时候，可能会有大量的气体经过过滤器(例如10、25、50、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500 或10000升空气)，并在极短的时间内测试残留颗粒物质-通常测试时间也是15分钟。因此，这些微生物的测试方法采用了前所未有的手段，并且非�？斓夭峁馐且郧安豢赡苁迪值�。测试液体试样中是否存在微生物的本发明当然也可用于测试液体试样中炭疽的存在与否，其中以抗炭疽抗体作为特异性结合对的第一成员。除了炭疽以外，本发明还可测试可能用于生物战争的其它任何微生物。在允许该特异性结合对的第一和第二成员结合的条件下使试样通过滤膜。如果希望或需要降低特异性结合对上除第二成员以外的部分与其第一成员结合的可能性，那么就需要更严谨的结合条件(也被称为“严谨杂交”)。例如可以调节温度或PH值以提供严谨的杂交条件。合适的杂交条件取决于特异性结合对组分的性质，且它们对本领域有经验的技术人员而言是显而易见的。在洗涤步骤(ii)中，很明显不能将已结合的特异性结合对从膜腔中洗出，所以除已与附着于膜上的特异性结合对的第一成员相结合的第二成员之外，洗涤步骤除去了任何滤渣。当然也有可能偶尔会有部分特异性结合对从膜上脱离而与未结合的滤渣一起从膜腔被洗掉。虽然如此，但是大体上(也就是基本上)所有的已被其第二成员结合的特异性结合对的第一成员还是附着在膜上。检测步骤(iii)可采用多种形式。例如可通过与结合对或一种标记探针的微生物的结合来检测特异性结合对，该标记探针可以是例如与掺入酶的检测抗体(传统的酶联免疫吸附剂测定，EIA)。还可以选择性的是一种放射性标记的抗体或荧光标记的抗体。采用其它探针对本领域有经验的技术人员而言也是显而易见的。还可以将微生物从特异性结合对的第一成员洗脱(也就是分离)，然后实施分离检测步骤。例如，使该洗脱的微生物溶解，然后采用荧光素酶分析检测任何释放ATP。或者还可以选择利用微生物特异性抗体，或者在常规(如微生物特异性)营养培养基上平板接种洗脱物并检测任何微生物菌落的生长。还可以在常规PCR试验中使用对微生物具有特异性的寡核甘酸探针测试洗脱物。可用于本发明的检测步骤的范围还意指可以将大量特异性结合对的第一成员附着在膜上。不同的第一成员可能混合在一起并附着在整个膜上，或者一种特定特异性结合对的第一成员可能在某个特定的部位附着在膜上。实施的检测步骤可允许对该特异性结合对进行常规检测和/或定量检测，也可允许对所选定的特异性结合对进行常规检测和/或定量检测。例如，利用第一荧光团就可检测出第一特异性结合对的存在，利用放射性标记或具有激发和/或发射谱显著区别于第一荧光团的第二荧光团检测出第二特异性结合对的存在。现有技术的设备通常使得已过滤的颗粒物质成为一种硬“饼”(颗粒物质的一种相对高度压实的高密度块)存在于膜的表面上，微生物和其它颗粒物质阻塞并被截留在膜的空隙中。这种饼不易去除，也难以处理以使其能够检测是否存在微生物。
本发明装置的结构则会形成一种可分散的“蛋糕”，然后可被洗脱，并允许低压过滤，进而阻止了致密饼的形成和对高压的需求。如果在更高压力下进行过滤，可能会出现细菌溶解，从而产生不正确的结果。高压也可能导致细菌变形而通过过滤膜，从而得到错误的结果。现有技术的过滤装置和方法包括GB2135902、EP302949、W094/00222、W084/00015、 US5863501、US5814179、US4501793、JP4-135478(WPI 摘要 1992-205001)、JP63-104615 (WPI 摘要 1988-165566)，JP63-088007 (WPI 摘要 1988-145060)、JP61-133105 (WPI 摘要 1986-200908)。但是没有一篇公开或暗示了本发明的方法，而本发明的方法包括了获得现有技术可提供的结果的所有必要步骤。特别是现有技术没有暗示形成一种可分散的“蛋糕” 状滤渣而非更密实的“饼”，也没有提示把从膜上洗脱滤渣作为后面加工步骤的一部分。例如，JP63-104615公开了一种用于分离的装置，如从液体中分离病毒，其中包括多个多孔中空纤维素纤维，该纤维的一端包埋在填料中和大气相通，另一端则是密封的。 然而该文献既未提示本发明的具体方法也未显示其优点。另一种已知的过滤装置如来自 Cole Parmer (www. coleparmer. com)的"CultureGard Hollow Fiber Filter，，,产品型号为 Eff-29510-50o有利地，已发现还可使用聚丙烯纤维膜(Cole Parmer产品使用纤维素中空纤维膜)。特别地，可以利用润湿剂如异丙醇和/或清洁剂如Tween-20对膜进行处理使其具有更好的亲水性，并使特异结合点的第一成员更容易地附着其上。下面将会说明在抗体附着之前采用异丙醇对膜进行处理后所取得的意外的有益效果。例如在用Tween-20(标准的，0. 1% )和抗体处理之前可将膜浸泡在异丙醇中，然后干燥。已发现采用润湿剂如醇对膜进行预处理可大大提高试样混合物通过膜的流动速率。将经预处理的干燥膜和未经处理的干燥膜进行对比时，结果尤为明显。该提高的流动速率可确保完整地收集微生物而不会出现细胞溶解或强制透膜。有用的清洁剂包括非离子清洁剂，特别是Tween 20，更好的是5%的Tween-20溶液。相对于差不多大小(如尺寸)但只有一个平面膜的单个装置而言，大量中空纤维滤过膜的使用也为过滤提供了相对大的表面积(典型的至少是其三倍)。这也使得在发生任何孔堵塞之前可过滤相对大体积的试样。这对于其中包含大量颗粒物质可能会很快地堵塞平面滤过膜的浑浊试样(如烈性黑啤酒)尤其有用。还已发现过滤器膜材料的确切性质是重要的-已发现用异丙醇预处理的平均孔径为0. 2 μ m的可商购得到的聚丙烯中空纤维膜与即使作相同处理的平均孔径为0. 2 μ m的聚砜膜相比，允许更大的流动速率。因此在本发明优选的实施方案中，中空纤维膜是一种聚丙烯膜。当然也可以使用其它的膜，尤其是具有相似物理性质的膜，例如单位面积的膜表面具有类似的平均孔径、孔面积以及类似于聚砜、醋酸纤维素和尼龙的膜。本发明所用的中空纤维膜的平均孔径可为0. 2 μ m。本发明还提供一种装置，该装置包括试样入口和大量中空纤维滤过膜，该膜上附着有一种特异性结合对的第一成员，该特异性结合对的第二成员由特定的微生物显示，该膜具有第一和第二末端、外表面和界定一个腔的内表面，每个该膜的该第一末端是开放的并与试样入口相通，每个该膜的该第二末端中的流动受到限制，以使该流动仅发生在该第一末端和该膜的孔，使得通过所述样本入口进入装置的试样混合物通过膜孔过滤，而滤渣留在该膜的该腔内。如从实验结果可以看出，使用本发明的方法和装置由于其过滤速度而使微生物测试容易进行，对于检测一定体积试样液体中的特定微生物，本发明只需要其它装置所需时间的几分之一，通常至少要快十倍。本发明还提供另一个重要的优点，就是即使在过滤一种高度浑浊的混合物的时候，对一个特定试样也提供稳定的结果-在不同组的结果中很容易获得至少99%的一致性。这与使用平面膜所获得的较不一致的结 果形成有利的对比。在本发明的各种实施方案中，中空纤维膜由聚丙烯组成，由于其具有低的蛋白吸收能力而被应用于许多生物医学领域。以前从未提示过聚丙烯膜应该具有附着它们的抗体或其它特异性结合对的成员。特别是本发明表明按照本文所述的方法，采用异丙醇对聚丙烯膜进行处理，可使特异性结合对在用清洁剂如SDS和Tween-20洗涤的时候也仍然附着在膜上。这种方法先前未曾建议过。通过以下的描述，参照附图中的几个图，本发明将会更加清楚，这些附图仅显示一种过滤器装置的实例。附图中
图1表示本发明的第一装置及其在检测微生物方法中的应用；图2表示图1所示装置中端盖的剖面图和轴环的俯视图；图3表示一张有抗体附着其上的聚丙烯膜的图片，通过在碳酸盐/重碳酸盐的缓冲溶液中浸泡一夜实现预处理的一个膜(试管A，左边)，通过在异丙醇中浸泡一夜实现预处理的另一个膜(试管B，右边)；图4表示本发明中可选择使用的一个过滤装置。除非另外说明，实施的所有步骤均使用标准协议和根据适用的制造厂商的说明书。各种技术的标准协议包括PCR、分子克隆法、操作处理和序列测定、抗体的制备、表位作图和模拟设计、细胞培养和噬菌体展示，在很多书中均有记载，如McPher s on, Μ. J. et al. (1991, PCR :A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. et al. (1989, Molecular cloning :a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York), Huynh and Davies (1985, " DNA Cloning Vol I-A Practical Approach “，IRL Press, Oxford, Ed. D. M. Glover), Sanger, F. et al. (1977，PNAS USA 74(12) :5463_5467) , Harlow, E. and Lane, D. ( " Using Antibodies :A Laboratory Manual " , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,1998), Jung, G. and Beck-Sickinger, A. G. (1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng. ,31 :367_486), Harris, M. A. and Rae, I. F. ( " General Techniques of Cell Culture " , 1997, Cambridge University Press,ISBN 0521 573645)," Phage Display of Peptides and Proteins :A Laboratory Manual" (Eds. Kay, B. K. , Winter, J. , and McCafferty, J. , Academic Press Inc. ,1996, ISBN0-12-402380-0)。用于本文详述的方法中有用的试剂和设备都可以得自=Amersham(驟w. amersham. co.uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim. com), Clontech(www. c Ion tech. com)，Genosys (www. genosys. com)，Millipore (www. milllpore. com)， Novagen (www. novagen. com)，Perkin Elmer (www. perkinelmer. com)，Pharmacia (www. pharmacia. com)，Promega (www. promega. com)，Qiagen (www. qiagen. com)，Sigma (www. si gma-aldrich. com) and Stratagene (www. stratagene. com)等。其中“PMID ”是给公开出版物的索引号，是美国国家医学图书馆分配给他们的标识号，据此可在www, ncbi. nlm. nih. rov获得每一篇公开出版物的全部文献情报和摘要。尤其是对于PNAS、JBC和MBC出版物，还可提供直接访问该出版物的全文电子版。本领域中Iactobacillus brevis的特异抗原众所周知，例如可从下面的文献中得以了解，如 Yasui T, and Yoda K. (Appl Environ Microbiol. 1997Nov ；63(11) 4528-33 ；PMID 9361439), Yasui T， Yoda K. (FEMS Microbiol Lett. 1997Jun 15; 151(2) 169-76 ；PMID 9228750), and Shimohashi H, Kodaira S, and Suegara N. (Jpn J Microbiol. 19760ct ；20(5) 405-13 ；PMID 62862)，抗 Lactobacillus brevis 的抗体也同样如此(参看如 Youichi Tsuchiya, Yasukazu Nakakita, Junji ffatari, and Ken Shinotsuka,1999American Society of Brewing Chemists (ASBC) Annual Meeting in Phoenix, Arizona, June 19-23, Abstract 0-17).抗体的制备室温条件下，向L. brevis微生物的高浓度溶液中加入8%的甲醛溶液2_3小时杀灭微生物。12000rpm下离心分离10分钟获得细胞沉淀。除去液体将细胞沉淀进行洗涤并在消毒的去离子水中再悬浮。反复离心分离和洗涤直至所有的甲醛完全除去。将最终获得的细胞沉淀(免疫原)重新悬浮在0. 5mlPBS中，冻存待用。在注射免疫原之前，还需将 0. 125ml的免疫原用等量的弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich Inc，编号为F5881)稀释。由此提供初始注射和随后的三次调压注射，其中包含由等量弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich Inc，编号为F5506)稀释过的免疫原。该重悬抗原制剂中的一个试样还通过平板接种计数方法进行测试以确保没有细胞存活。采用由Sigma-Aldrich Inc提供编号为PURE-1A的蛋白A亲合色谱法将免疫球蛋白从血清中提纯出来。中空纤维膜的预处理将标称孔径为0. 2 μ m、长为55cm的中空纤维聚丙稀膜(Membrana，wuppertal， Germany ；编号为PP Q3/2)在异丙醇中浸泡一夜。然后将膜干燥，再将其浸入 Tween-20(5% )中20分钟后干燥。中空纤维膜的制备将35段预处理的中空纤维膜(如上所述)在一端集成一束。然后将紫外固化粘合剂应用到膜的小断面上，再使5mm的轴环在粘合剂表面移动。照射紫外线至粘合剂固化 (45秒)。检查所有的膜确保膜腔都是完全开通的。将带有注射器装置盖安装在轴环上，并使用UV固化粘合剂固定。将5ml抗L. brevis的抗体1 10，000的稀释溶液(在0. IM碳酸/重碳酸缓冲溶液(Sigma，编号为C3041)中的稀释)放入注射器中，然后将注射器连接到膜的帽上。膜的另一端已被镊子封闭并用该稀释溶液使膜腔润湿。当在膜的外表面上可看到溶液时表明全部的膜表面已被溶液涂覆，结束该操作。然后将膜密封在杂交试管中室温下温育15分钟。
然后向膜腔通入空气，再用包含0. 1% Tween 20 (每次应用约50ml)磷酸缓冲溶液 (PBS)洗涤膜腔几次，除去未结合的抗体。然后使经过涂覆的膜完全干燥。中空纤维膜的测试
为了证明采用异丙醇进行预处理对抗体在聚丙烯中空纤维膜上附着的影响，准备了两支试管(见图3)，其中一支(试管A，300)包含聚丙烯中空纤维膜301，该膜301在已连接到HRP(horse radish peroxidase,Dako)上的猪抗体中浸泡60分钟之前已在碳酸盐/ 重碳酸盐缓冲溶液中浸泡了一夜。另一支(试管B，310)包含聚丙烯中空纤维膜311，该膜在已连接到HRP (horse radish peroxidase, Dako)上的猪抗体中浸泡60分钟之前已在异丙醇中浸泡了一夜。两种膜301和311均放入含0. 1% Tween 20的缓冲溶液中进行粗洗。为了检测附着抗体的含量，将两滴TMB (四苯甲酸甲酯，tetra methyl benzadine) 显色试剂分别加入到装有1.5mlHRP底物的两玻璃瓶(未示出)中，再将每一个膜301或 311蘸其中的一个玻璃瓶，膜上就会出现颜色变化从而表明抗体的存在与否。结果如图3所示。膜301和311上更暗的区域就表示由HRP也就是膜上抗体的附着引起的颜色变化。膜311基本上比膜301更暗，就表明有更多的抗体附着其上。结合的定量测试为了量化微生物与附着在中空纤维膜上抗体的结合，先使100ml包含已知浓度 L. brevis的试样通过过滤装置，再用含0. 1 % Tween-20 (如上所述)的PBS洗涤以除去未结合的微生物，然后用缓冲溶液(标准的0. IM柠檬酸，pH值为3. 0)洗脱已结合的微生物。 最后将洗脱的微生物接种于微生物平板中确定捕获的数量。结合的特异性为了显示膜的特异性，先使100ml包含已知浓度混合的微生物的试样通过过滤装置，随后采用如上所述的步骤。在微生物平板中仅仅目标微生物也就是L. brevis可被检测，而其它的微生物先前就已从膜上洗掉了。过滤装置过滤装置100包括一个具有Luer锁件21并与35个中空聚丙烯纤维膜30连通的试样入口 20，该膜30的平均孔径为0. 2 μ m。在试样入口 20处，膜30的第一端包埋在可紫外固化的粘合剂中，该粘合剂将该膜端固定在适当位置上并使其与试样入口 20相通。在出口 110处，膜30的第二端包埋在紫外固化粘合剂中，该粘合剂将该膜端固定在适当位置上并使其与试样出口 110相通，出口被管塞120封闭，从而限制在膜30的第二末端中流动。膜 30采用该“中空纤维膜的制备”部分描述的方法制备而得。在使用过程的第I阶段，通过Peri泵130以100ml/m的速率将100ml贮藏啤酒60 经过管140泵送入装置100 (通过简单调节膜的表面积，通过装置100滤过的试样如贮藏啤酒的体积就可增至1000ml甚至更大)。当装置100充满了贮藏啤酒60的时候，塞120堵塞出口 110使装置100的出口只能是膜30的孔，因此贮藏啤酒60就从膜30过滤，滤液收集在废物收集容器150中废弃。在第II阶段，除去塞120，泵送50ml洗液160通过管140，该洗液160由含0. 01 % Tween 20的磷酸缓冲溶液组成，流经膜30的腔(也就是不通过膜30的孔)被收集于废物容器150中废弃。当洗液160完全通过装置100的时候，使泵130继续运转10秒，以便泵送空气通过管140和膜30以除去膜30中过量的液体。然后关闭泵130，并将装置100与管140和泵130拆开。在第III阶段，将装有0. 5ml洗液161 (含0. 2M NaOH的细胞溶解缓冲液)的Iml 消毒的注射器和试样入口 20相连，充分推压注射器50的塞55使洗液161经过膜30。然后回抽塞55，洗液161也从膜30的腔返回。再重复两次该操作，确保所有结合的微生物全部溶解。然后再完全推压塞55将洗液161注入注射器1. 5ml的管170。在第IV阶段，将等量的中和缓冲液(0.2M四磷酸盐)加入到管170中，盖上盖，将管170倒置2-3次使管170中的溶液充分混合。最后，在第V 阶段，使用 Biotrace Unilite 发光计和 Sigma Bioluminescence 试剂对试样进行ATP测定。
显然可使用的微生物检测手段范围很广，如PCR和平板接种(如上所述)，因此步骤III-V可作相应的调整。例如，洗涤步骤III中可以不用溶解的情况下使用pH值为3. 0 的0. IM的柠檬酸将完整的微生物洗进管170。ATP 测定确定微生物污染最快捷常规的方法就是测定细胞的ATP。这需使细胞膜/壁破裂 (细胞溶解)以释放出细胞中存在的ATP。再利用酶反应使底物(萤光素)和ATP转变成大量包括发光体的产物，就可测定所释放的ATP。采用标准的发光计可对发光体的量进行测试。市场有许多ATP测定法。但是细胞的完全溶解从而释放出全部细胞的ATP的能力取决于微生物的种类。如第二个过滤装置(图2)所示的过滤装置的结构，该装置如下1.平均孔径为0. 2 μ m的聚丙烯中空纤维膜(经5% Tween 20预处理)2.带有手持敷料器和脚动开关的Loctite (RTM) 21半自动控制器，压力设置为0. 2 巴，数字输出设定为35.0。3. Bondmatic 850紫外线光源，定时器设置为40秒。4.内径为7. 0mm、外径为12. 4mm的轴环(图2，200)(聚碳酸酯棒)。5.用2mm聚丙烯聚合物制备的Y型端盖(图2，210)，其中有一容纳轴环的宽端 (内径为12. 4mm)和一个与Luer注射器喷嘴相连的窄端(内径为4. Imm)。过滤装置制备如下1.用IPA(异丙醇)清洗所有的工作表面。2.取一束由一定量聚丙烯中空纤维膜组成的纤维膜，在其周围放置多个轴环。3.在距该束中空纤维膜的末端大约30mm处，将粘合剂敷料器的喷嘴置于膜束中间，喷涂粘合剂使其渗透过膜束，操控喷嘴使粘合剂喷涂到该区域的所有膜上。此外还要将粘合剂涂覆于该位置上膜束的外表面。然后滑动一个轴环并在该位置上绕膜转动，使其接触粘合剂。4.将膜束涂覆有粘合剂的断面置于紫外线光源下，以固化粘合剂。5.沿膜束距前一个轴环大约30mm处，按照步骤3 (如上所述)喷涂粘合剂。先滑动旋转第一个轴环，再滑动旋转第二个轴环使其相互接触，然后再将它们分开l_2mm，并重复步骤4。6.重复步骤5直至整个膜段的适当位置上都有轴环。7.在一对轴环之间l_2mm的间隙处切断纤维，得到多个的中空纤维装置，该纤维的其中任一端都有开口腔，另一端用轴环在其外侧密封。 8.取其中一个装置和一对端盖，在端盖内侧边缘和装置轴环外侧周围涂敷少量 loctite primer 770。放置约1分钟，然后再在每个轴环的外测周围涂敷Loctite fast set 粘合剂403，紧压端盖和轴环至完全粘接。如上所述，使用本发明的装置和方法获得的结果表明可对大体积试样液体中的少量微生物进行简单、快速和准确的检测。如图4所述，过滤装置500包括20个装在过滤体520中、长为40mm的中空纤维聚丙烯膜510，每个膜510均独立放置在过滤体520的槽中并由粘合剂530将其一端固定在适当位置，该粘合剂530仅涂覆在膜510的外表面而未进入膜510的腔和末端。搭扣配合 (snap-fit)端盖540有一个连接管541的连接器，因此试样可直接从试样池进入装置500。 搭扣配合端盖550包含一个箔片密封帽，该帽带有一个连接管(未示处)的连接器，如果密封垫是完整的，就意味着从装置500流出的液体只能通过膜510。密封垫被注射器551 —刺穿，液体就可不经过滤，意味着未与附着在膜510上的抗体结合的微生物可被洗脱。装置500的外壳体520包括一个端口 560，可将真空装置连接到该端口上从而加速通过膜510的过滤。采用可紫外固化粘合剂和敷料器(如注射器)，需与膜相接触，容易导致污染，为了简化对中空纤维膜涂敷粘合剂的该步骤，可选择采用胶水(如环氧树脂)与离心机的组合代替该方法。简而言之，可将一束中空纤维膜和一种环氧树脂一起置入池中离心(例如 750rpm)，使得环氧树脂仅在中空纤维膜束的一端形成密封，继续离心直到树脂固化。可将膜束倒置，重复操作使膜的另一端也被密封。还可采用烘烤使另外的粘合剂完全固化。为了不使粘合剂和膜在离心机中被粘�。鞑考刹潦猛涯＜寥鏟romol K502 进行预处理。凿通密封膜末端的环氧树脂塞，从而获得一束一端被环氧树脂塞封闭的未堵塞的中空纤维膜。这也可以采用与使用可紫外固化粘合剂制备膜束的相同方法来进行实施。有用的环氧树脂可以是例如Pur System Adhesive 725A 和 System Adhesive 725BF。
权利要求
1.一种检测液体试样中是否存在微生物的方法，该方法包括以下步骤i)使所述试样通过过滤装置的试样入口，该过滤装置包括大量中空纤维滤过膜，膜上附着有一种特异性结合对的第一成员，所述微生物显示该特异性结合对的第二成员，该膜具有第一和第二末端、外表面和界定一个腔的内表面，每一个该膜的第一末端是开放的并与试样入口相通，每个该膜的该第二末端中的流动受到限制，以使该流动仅发生在该第一末端和该膜的孔，试样混合物通过膜孔过滤，而滤渣留在该膜的该腔内； )洗涤来自该膜内的腔的滤渣的未结合部分；iii)检测是否存在任何附着于膜上的该特异性结合对；iv)把检测步骤(iii)的结果与该液体试样中是否存在该微生物联系起来；和在使该特异性结合对的第一成员附着于膜上之前，用润湿剂和清洁剂的至少一种处理该膜。
2.根据权利要求1的方法，该试样的体积至少为25、50、100、200、250、300、400、500、 600、700、750、800、900 或 1000ml。
3.根据权利要求1或2的方法，该特异性结合对的第一成员是一种抗体或其抗原结合片段。
4.根据前述权利要求之任一项的方法，该膜选自聚丙烯、聚砜、醋酸纤维素和尼龙膜。
5.根据前述权利要求之任一项的方法，该方法在步骤(i)之前还包括步骤a)使气体试样通过含一气体过滤器的气体过滤装置；b)使该气体过滤装置中的该过滤器与一种试样液体接触，以使截留在该过滤器中的任何一种所述微生物悬浮或溶解以产生一种液体试样。
6.一种测试包装中的内容物中是否存在某种特定的微生物的方法，该方法包括步骤a)将该包装置于第一室中，该室通过一穿刺器具与盛有试样液体的第二室相通；b)使该包装与穿刺器具相接触，从而使该包装中的任何固体物质能够经该穿刺器具通入该第二室的试样液体，以得到一种液体试样；和c)使该液体试样完成权利要求1-4之任一项的方法。
7.根据权利要求6的方法，该还包括步骤改变该第一、二室中的相对气压，以使该第一室中的压力大于该第二室中的压力。
8.根据权利要求6或7的方法，该方法还为该包装提供一种自封垫片，该垫片通过该穿刺器具连接。
9.一种检测固体试样中是否存在微生物的方法，包括以下步骤a)使该固体试样与一种试样液体相接触，以使该微生物处在液相，从而得到一种液体试样；b)使该液体试样完成权利要求1-4之任一项的方法。
10.根据前述权利要求之任一项的方法，检测步骤(iii)选自酶联免疫吸附测定、放射标记检测、荧光检测、ATP测定、平板接种或PCR。
11.根据前述权利要求之任一项的方法，该膜上覆盖大量特异性结合对的第一成员。
12.根据前述权利要求之任一项的方法，在使该特异性结合对的第一成员附着于膜上之前，用异丙醇处理该膜。
13.根据前述权利要求之任一项的方法，在使该特异性结合对的第一成员附着于膜上之前，用Tween-20处理该膜。
14. 一种装置，该装置包括试样入口和大量中空纤维滤过膜，该膜上附着有一种特异性结合对的第一成员，该特异性结合对的第二成员由特定的微生物显示，该膜具有第一和第二末端、外表面和界定一个腔的内表面，每个该膜的该第一末端是开放的并与试样入口相通，每个该膜的该第二末端中的流动受到限制，以使该流动仅发生在该第一末端和该膜的孔，使得经所述样本入口进入所述装置的试样混合物通过膜孔过滤，而滤渣留在该膜的该腔内；在使该特异性结合对的第一成员附着于膜上之前，用润湿剂和清洁剂的至少一种处理该膜。
全文摘要
本发明涉及检测在液体、气体和固体试样中是否存在某种微生物的方法及其应用的装置。本发明包括使用多个中空纤维过滤液体，并通过特异性结合对在膜上捕获微生物。
文档编号G01N33/48GK102353779SQ20111019616
公开日2012年2月15日 申请日期2002年2月5日 优先权日2001年2月5日
发明者E·A·基南, M·S·布伦南德 申请人:米利波尔公司
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