专利名称：Ngal检测的上转发光快速定量试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及临床医学检验领域，具体涉及一种基于上转发光技术免疫层析快速、定量检测NGAL试剂盒。
背景技术：
上转发光颗粒(Up-Converting Phosphor, UCP)是一种可对能量进行上转的稀土金属合成物，即UCP可吸收低能量的(长波长)红外光，但却发出高能量的(短波长)可见光。UCP是由几种稀土金属元素参杂于某些晶体的晶格中构成的。在这种材料中有三种主要的成分:主基质、吸收子和发射子。作为主基质的晶体材料有:氧硫化物(如Y202S、Gd02S、La2O2S等)、氟化物(如YF3、GdF3、LaF3等)、镓酸盐(如YGaO3'Y3Ga5O12等)以及硅酸盐(YSi205、YSi3O7等)等；常用作吸收子的稀土金属离子有:镱离子(Yb3+)、铒离子(Er3+)、钐离子(Sm3+)等；常用作发射子的稀土金属离子有:铒离子(Er3+)、钦离子(Ho3+)、铥离子(Tm3+)、铽离子(Tb3+)等。吸收子和发射子这一离子对在主基质晶格内适宜的空间取向和距离，是产生上转发光的基础。上转发光颗粒UCP所具有的这种独特光学特性，使其在床边快速诊断领域发挥巨大的潜能:(I)高度的灵敏性:独有的上转发光现象确保了 UCP在检测过程中不存在来自外界的背景干扰；(2)高度的稳定性:UCP的发光现象是产生于结构内部的纯粹物理过程，因而完全避免了来自检测样品腐蚀及自身衰变导致的发光淬灭；(3)高度灵活性:UCP具有的可自由组合的多样化特征光谱，使其适用于多重分析；(4)高度的安全性:无机惰性、红外光激发、可见光发射使得基于UCP检测对于检测者、被检测样品、环境均无�：�。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin, NGAL)是1993年在中性粒细胞内首次被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生于发展等过程相关。近年来国内外研究表明，NGAL蛋白在多种疾病发生过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。近年美国临床化学协会(AACC)年度会议的研究结果发表得知检测尿中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白可能有助于临床医生检测心脏移植患者环孢霉素诱导的毒性，以及调节环孢霉素剂量以预防其对肾脏造成的不可逆伤害。中国专利200580048175研究在急性肾衰竭(ARF)、急性肾小管坏死(ATN)和急性肾小管间质性肾病(ATIN)发病的早期，尿液和血液中NGAL水平显著增加，因此NGAL是早期检测肾脏对缺血性损伤的标志物。目前，检测NGAL方法主要有酶联免疫法(中国专利200810237423.X)、基于抗体免疫的微型柱测试法(中国专利200580048175)和胶乳免疫比浊法(中国专利20101036227.0)。酶联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确；胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。因此，应用上转发光免疫分析技术开发NGAL快速检测试剂应用于床边快速诊断具有重要的临床应用价值。
发明内容为了克服上述现有技术中的不足，本实用新型提供一种基于上转发光法的测定NGAL免疫层析定量试剂盒，具有准确、快速的特点。本实用新型的试纸条检测原理是通过一系列表面修饰与活化，上转发光颗粒UCP可与生物活性分子相结合，利用UPT生物传感器，对在层析过程中通过特异免疫反应结合于检测区与质控区上的UCP颗粒进行扫描分析，从而利用由UPT快速定量检验系统实现精确定量或定性。本实用新型的提供的技术方案是:一种NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒，包括在底衬上依次粘贴的样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸，所述结合垫上包被有上转发光UCP颗粒标记的NGAL抗体I，所述分析膜上设有平行的检测区和质控区，所述检测区包被有NGAL抗体II或NGAL抗原，所述质控区包被有羊抗鼠IgG。所述上转发光UCP颗粒的直径为50_350nm。所述NGAL抗体I和NGAL抗体II为配对单抗或单抗-多抗配对。所述NGAL抗原为人NGAL。本实用新型NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒的制备方法为: (I)结合垫制备:将UCP-NGAL抗体I用ρΗ7.5的0.03Μ PBS缓冲液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀释至终浓度为2mg/ml，充分混匀后喷于结合垫上，37°C烘干备用；(2)分析膜制备:用点样仪在分析膜上不同位置分别喷点NGAL抗体II (或NGAL抗原)和羊抗鼠IgG抗体，作为检测区和质控区，37°C烘干备用；(3)样品垫制备:将样品垫放入pH 7.2的0.03M PBS缓冲液(含5mg/mlBSA和0.l%TritonX-100)中浸泡l_2h，然后37°C烘干备用；⑷试剂盒组装:将样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸依次粘贴在底衬上，切割成指定宽度试纸条即可。与现有技术相比，本实用新型具有以下有益技术效果:本实用新型检测试剂盒基于转发光技术与免疫层析技术结合在定量检测NGAL的应用，使得NGAL检测无本底干扰、检测结果更加灵敏；与现有技术相比，该试剂盒稳定性更闻。
图1 NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒结构示意图。其中，1、底衬；2、样品垫；3、结合垫；4、分析膜；5、吸水纸；6、检测区；7、质控区。
具体实施方式
[0029]
以下结合附图对本实用新型进一步详细描述，所述是对本实用新型的解释而不是限定。如图1所示，一种NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒，包括在底衬I上依次粘贴的样品垫2、结合垫3、分析膜4和吸水纸5，所述结合垫3上包被有上转发光UCP颗粒标记的NGAL抗体I，所述分析膜4上设有平行的检测区6和质控区7，所述检测区6包被有NGAL抗体II或NGAL抗原，所述质控区7包被有羊抗鼠IgG。所述上转发光UCP颗粒的直径为50_350nm。所述NGAL抗体I和NGAL抗体II为配对单抗或单抗-多抗配对。所述NGAL抗原为人NGAL。实施例1本实用新型NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒的制备方法1:(I)结合垫3制备:将50nmUCP颗粒与NGAL单克隆抗体I共价偶联得到UCP-NGAL单克隆抗体I，然后用PH7.5的0.03M PBS缓冲液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀释至终浓度为2mg/ml，充分混匀后喷于结合垫上，37°C烘干备用；⑵分析膜4制备:以pH 7.2的PBS缓冲液将NGAL单克隆抗体II或NGAL多克隆抗体和兔抗鼠IgG抗体分别配置成0.2mg/ml和0.3mg/ml的溶液,再用喷膜仪在分析膜4上以I μ 1/cm的量分别划线作为检测区6和质控区7，37°C烘干备用；(3)样品垫2制备:将样品垫2放入pH 7.2的0.03M PBS缓冲液(含5mg/mlBSA和
0.l%TritonX-100)中浸泡30min，然后37°C烘干备用；⑷试剂盒组装:将样品垫2、结合垫3、分析膜4和吸水纸5依次粘贴在底衬I上，切割成指定宽度试纸条即可。方法2: (I)结合垫3制备:将350nmUCP颗粒与NGAL单克隆抗体I共价偶联得到UCP-NGAL单克隆抗体I，然后用PH7.5的0.03M PBS缓冲液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀释至终浓度为2mg/ml，充分混匀后喷于结合垫上，37°C烘干备用；(2)分析膜4制备:以pH 7.2的PBS缓冲液将人NGAL和兔抗鼠IgG抗体分别配置成0.2mg/ml和0.3mg/ml的溶液，再用喷膜仪在分析膜4上以I μ 1/cm的量分别划线作为检测区6和质控区7，37°C烘干备用；⑶样品垫2制备:将样品垫2放入pH 7.2的0.03M PBS缓冲液(含5mg/mlBSA和
0.l%TritonX-100)中浸泡30min，然后37°C烘干备用；⑷试剂盒组装:将样品垫2、结合垫3、分析膜4和吸水纸5依次粘贴在底衬I上，切割成指定宽度试纸条即可。实施例2样品检测将被检测尿液滴加100-120 μ I于样品垫2上，溶液将溶解结合垫3上标记好的UCP颗粒，并在分析膜4上发生层析，然后在5-10min内用UPT生物传感器对试纸条进行扫描，根据信号得出待测样品中的NGAL的含量进行定量或定性检测。
权利要求1.一种NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒，包括在底衬(I)上依次粘贴的样品垫(2)、结合垫(3)、分析膜(4)和吸水纸(5)，其特征在于所述结合垫(3)上包被有上转发光UCP颗粒标记的NGAL抗体I，所述分析膜(4)上设有平行的检测区(6)和质控区(7)，所述检测区(6 )包被有NGAL抗体11或NGAL抗原，所述质控区(7 )包被有羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒，其特征在于所述上转发光UCP颗粒的直径为50-350nm。
3.根据权利要求1所述NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒，其特征在于所述NGAL抗体I和NGAL抗体II为配对单抗或单抗-多抗配对。
4.根据权利要求1所述NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒，其特征在于所述NGAL抗原为人NGAL。
专利摘要本实用新型公开了一种NGAL检测的上转发光快速定量试剂盒，属于临床医学检测领域。该试剂盒包括在底衬上依次粘贴的样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸，所述结合垫上包被有上转发光UCP颗粒标记的NGAL抗体I，所述分析膜上设有平行的检测区和质控区，所述检测区包被有NGAL抗体II或NGAL抗原，所述质控区包被有羊抗鼠IgG。本试剂盒采用上转发光技术与免疫技术结合，具有准确、快速、定量检测的特点。
文档编号G01N33/558GK202956384SQ20122049740
公开日2013年5月29日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者苏恩本, 颜彬, 沈小娟, 王勇 申请人:南京基蛋生物医药有限公司
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