专利名称：基于mosfet结构的dna电化学传感器及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于MOSFET结构的DNA电化学传感器及其制备方法。
背景技术：
传感器与通信系统和计算机共同构成现代信息处理系统。传感器相当于人的感官，是计算机与自然界及社会的接ロ，是为计算机提供信息的工具。传感器通常由敏感(识别)元件、转换元件、电子线路及相应结构附件组成。生物传感器是指用固定化的生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本 身(细胞、细胞器、组织等)作为感元件的传感器。电化学生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。ー些研究成果已在生物技术、食品エ业、临床检测、医药エ业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。电化学DNA传感器是近几年迅速发展起来的一种全新思想的生物传感器。其用途是检测基因及一些能与DNA发生特殊相互作用的物质。电化学DNA传感器是利用单链DNA(ssDNA)或基因探针作为敏感元件固定在固体电极表面，加上识别杂交信息的电活性指示剂(称为杂交指示剂)共同构成的检测特定基因的装置。其工作原理是利用固定在电极表面的某一特定序列的ssDNA与溶液中的同源序列的特异识别作用(分子杂交)形成双链DNA(dsDNA)(电极表面性质改变)，同时借助一能识别ssDNA和dsDNA的杂交指示剂的电流响应信号的改变来达到检测基因的目的。电化学DNA传感器离实用化还有相当距离，主要是传感器的稳定性、重现性、灵敏度等都还有待于提高。有关DNA修饰电极的研究除对于基因检测有重要意义外，还可将DNA修饰电极用于其它生物传感器的研究，用于DNA与外源分子间的相互作用研究，如抗癌药物筛选、抗癌药物作用机理研究；以及用于检测DNA结合分子。无疑，它将成为生物电化学的ー个非常有生命力的前沿领域。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于MOSFET结构的DNA电化学传感器,解决了现有技术中生物传感器技术不能进行检测DNA的合成和测序等问题。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种基于MOSFET结构的DNA电化学传感器，包括CMOS衬底，所述CMOS衬底上沉积有氮化硅层，所述氮化硅层上覆盖ニ氧化硅绝缘层；其特征在于所述ニ氧化硅绝缘层为具有微孔结构的微孔阵列，所述微孔侧壁上SiO2绝缘层通过羧基偶联有DNA探针作为敏感元件。优选的，所述DNA探针具有SEQ No : I 3的连续核苷酸序列。
典型的，连续核苷酸序列列表如下SEQ No I5'-GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3'
SEQ No 25，-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3，
SEQ No 3 5，-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3，~这些DNA探针是通用接头的互补序列，可以检测DNA的合成和测序。优选的，所述氮化硅层的厚度为100-300纳米。优选的，所述Si02绝缘层的厚度为1-10微米。本发明的另ー目的在于提供一种所述的基于MOSFET结构的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(I)采用低压化学气相淀积方法在CMOS衬底上沉积形成氮化硅层，井根据微孔阵列的排布在所述氮化硅层上覆盖正性光刻胶，通过正胶显影溶解已曝光的光刻胶，然后采用低压化学气相淀积方法生长SiO2绝缘层；(2)进行正性光刻胶的剥离，并暴露作为衬底的氮化硅层，即在氮化硅层上形成微孔结构；(3)将SiO2绝缘层的微孔侧壁采用羧基化方法进行羧基化处理，然后使将氨基化的DNA探针与SiO2绝缘层表面的羧基进行键合偶联形成敏感元件。优选的，所述方法步骤(I)中采用低压化学气相淀积方法在CMOS衬底上沉积形成氮化硅层的方法是以ニ氯ニ氢硅和氨气为反应原料在压カ为O. I 10托范围内，温度为700-800 V的条件下进行沉积获得氮化硅层。优选的，所述方法步骤(I)中在所述氮化硅层上覆盖正性光刻胶的方法为旋转涂胶方法。优选的，所述方法步骤(I)中正性光刻胶的曝光条件为光的波长是248nm，光源是氟化氩激光光源；曝光剂量为lOOmJ/cm2，曝光后正胶显影所用的正胶显影液为四甲基氢氧化铵，所述四甲基氢氧化铵的当量浓度为O. 2-0. 3。优选的，所述方法步骤(3)中羧基化方法采用的试剂为丁ニ酸，羧基化方法的温度控制在75で。优选的，所述方法步骤(3)中偶联反应中以I-こ基-3-(3-ニ甲基氨丙基)-碳化ニ亚胺(EDC)为羧基的活化试剂。优选的，所述方法步骤(3)中氨基化的DNA探针具有氨基化处理的SEQ No : I 3的连续核苷酸序列。典型的，氨基化的DNA探针序列选自以下的任意ー种
5 '-Nh2-Gaggatccagaattctcgagtw;
5，-NH2-CC ATCTC ATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3，；
5’ -NH2-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-35 ο
本发明的另ー目的在于提供一种所述的基于MOSFET结构的DNA电化学传感器在DNA测序方面的应用一般的DNA电化学传感器可以检测DNA之间的相互结合。本发明提出了ー种DNA电化学传感器结构可以检测DNA的合成和测序。这种DNA电化学传感器结构是在MOSFET结构的基础上，构建百万个微孔阵列，微孔的结构是三明治式的三层结构，并且在中间层进
行羧基化。其可以按照如下步骤进行制备(I)在CMOS的基础上用LPCVD (低压化学气相淀积)方法生长出ー层100-300纳米的Si3N4。(2)在Si3N4上将要形成微孔底部的部分用正性光刻胶覆盖，那样在要形成微孔侧壁的地方生长SiO2大约1-10微米。(3)用紫外光将正性光刻胶剥离，这样会露出底部的Si3N4层。(4)用羧基化方法将SiO2进行羧基化(5)将氨基化的引物与SiO2的羧基进行键合。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是本发明DNA电化学传感器采用具有微孔结构的微孔阵列作为敏感元件，在微孔结构内设置DNA探针。这种微孔结构不但可以检测DNA探针与DNA靶标之间的结合而且可以在微孔中进行模板扩增有利于利用PH检测功能来检测DNA的合成，进而具有DNA测序功倉^:。
下面结合附图及实施例对本发明作进ー步描述图I为Si3N4的形成；图2为Si3N4上的光刻胶；图3为光刻和显影后的光刻胶；图4为SiO2的生成；图5为光刻胶剥离后SiO2形成的微孔结构示意图；图6为DNA探针与羧基的偶联后的微孔结构示意图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进ー步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进ー步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例基于MOSFET结构的DNA电化学传感器制备示例一、在CMOS结构上生长Si3N4用LPCVD (低压化学气相淀积)可以获得就有良好覆盖能力和高度均匀性的Si3N4膜。在减压和温度在700-800°C的条件下，用ニ氯ニ氢硅(SiCl2H2)和氨气(NH3) LPCVD淀积制作Si3N4。反应方程式如下3SiCl2H2 (气态)+4NH3 — Si3N4 (固态)+6HC1 (气态)+6 (气态)；
形成厚约100_300nm的氮化硅层(如图I所示为Si3N4的形成)。
ニ、用旋转涂胶方法在Si3N4上铺ー层正性化学放大深紫外光刻胶(CADUV胶)(I)滴胶。当硅片静止或旋转的非常缓慢时，光刻胶被分滴在硅片上。(2)旋转铺开。快速加速硅片的旋转到一高的转速(rpm)使光刻胶伸展到整个硅片表面。光刻胶的厚度正比于I/(RPM)1/2。(3)旋转甩棹。甩去多余的光刻胶，在硅片上得到均匀的光刻胶胶膜覆盖层。(4)溶剂挥发。以固定转速继续旋转ー涂胶的硅片，直至溶剂挥发，光刻胶胶膜几乎干燥。如图2所示为获得的1-5 的光刻胶层。三、光刻胶的曝光及显影在曝光过程中，从光源发出的光通过对准的掩膜版。版上有不透明和透明区域，这些区域形成了要转移到硅片表面的图形。曝光的目的就是要把版上图形精确的复制成光刻胶上的最终图像。所用的光的波长是248nm，光源是氟化氩(ArF)激光光源。曝光剂量为IOOmJ/cm2。正胶显影包含显影液和光刻胶之间的化学反应从而溶解已曝光的光刻胶。所用的正胶显影液为四甲基氢氧化铵(TMAH)。TMAH显影液的当量浓度为0. 2-0. 3时，选择性比较好且使光刻胶对比度高。百万分之几的表面活性剂通常被添加到TMAH显影液中，減少了光刻胶表面的任何残留。TMAH显影液的清洗仅需要去离子(DI)水。经曝光和显影后的图形如图3所示。四、SiO2的生长采用LPCVD方法制备SiO2的做法是低压650_750°C下，热分解TE0S，可以加入02。由于气体分子在表面的扩散速度快，这种方法可以制作均匀性优异的Si02。液态的TEOS源通常用载流气体鼓泡方式携帯(例如以N2、O2或者He)。液态源被其自身的独立的温度源加热。进入反应器的液态源的浓度受到载流气体的速率和液态源温度的控制。也可以采用在较低温度下(约450°C )氧化硅烷的方法LPCVD淀积SiO2,如图4所示。五、光刻胶的剥离去胶是通过氧原子与光刻胶在等离子体环境中发生反应来去除光刻胶的。原子氧
(0)通过微波或RF能量分解氧分子产生。常常加入N2或H2来提高去胶性能并加强对残留聚合物的去除。因而典型的去胶机气体使用的是02/N2。因为光刻胶的基本成分是碳氢聚合物。氧原子很快与光刻胶反应生成挥发性的一氧化碳、ニ氧化碳和水等主要生成物。这些生成物被真空系统抽走。如图5为光刻胶剥离后SiO2形成的微孔。六、微孔侧壁SiO2的羧基化取50ml的こ腈于烧杯中，再取3g 丁ニ酸，加入到盛有50mlこ腈的烧瓶中，连续搅拌，回流加热到60°C，直到丁ニ酸完全溶解。在真空条件下，将烧杯中的溶液倒入微孔阵列中，回流升温至75°C，连续震荡保温24小吋。将产物冷却到65°C，热抽滤后，用无水こ醇和去离子水的混合液离心洗涤3次，120°C真空干燥，即得到羧基化的Si02。七、DNA探针与羧基的偶联在10mg/mL I-こ基-3_ (3_ ニ甲基氨丙基)-碳化ニ亚胺(EDC)存在下，5’-NH2末端DNA探针(由金斯瑞合成)0.5 PM与微孔表面羧基发生偶联反应，使得DNA探针通过化学键在微孔表面进行结合。偶联方法是加入IOOiiLO. lmol/L 2-吗啉代こ基磺酸(MES pH4. 6)缓冲溶液、适量DNA探针溶液和3. 6 ii L 10mg/mL新配制EDC水溶液，漩涡混匀后在暗处使用旋转混合器反应lh。然后姆0. 5h补加I. 8 ii L lOOmg/mL新配制的EDC水溶液。反应总时间为2h。结束反应后加入I. OOmL 0. 02% Tween 20，混匀后离心沉降，弃去上层清液(对没有荧光标记的DNA探针)。再加入I. OOmL 0. I % SDS溶液洗涤微孔并弃去离心清液，在4°C储存。如图6为DNA探针与羧基的偶联后的微孔结构。其中5’_NH2末端DNA探针(由金斯瑞合成)的连续核苷酸序列选自:5, -NH2-GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3';或 5 ’ -NH2-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG_3 ’ ；或 5 ’ -NH2- CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3，。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种基于MOSFET结构的DNA电化学传感器，包括CMOS衬底，所述CMOS衬底上沉积有氮化硅层，所述氮化硅层上覆盖二氧化硅绝缘层；其特征在于所述二氧化硅绝缘层为具有微孔结构的微孔阵列，所述微孔侧壁上SiO2绝缘层通过羧基偶联有DNA探针作为敏感元件。
2.根据权利要求I所述的基于MOSFET结构的DNA电化学传感器，其特征在于所述DNA探针具有SEQ No r3的连续核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述的基于MOSFET结构的DNA电化学传感器，其特征在于所述氮化硅层的厚度为100-300纳米。
4.根据权利要求I所述的基于MOSFET结构的DNA电化学传感器，其特征在于所述Si02绝缘层的厚度为1-10微米。
5.—种权利要求I所述的基于MOSFET结构的DNA电化学传感器的制备方法,其特征在于所述方法包括以下步骤 (1)采用低压化学气相淀积方法在CMOS衬底上沉积形成氮化硅层，并根据微孔阵列的排布在所述氮化硅层上覆盖正性光刻胶，通过正胶显影溶解已曝光的光刻胶，然后采用低压化学气相淀积方法生长SiO2绝缘层； (2)进行正性光刻胶的剥离，并暴露作为衬底的氮化硅层，即在氮化硅层上形成微孔结构； (3)将SiO2绝缘层的微孔侧壁采用羧基化方法进行羧基化处理，然后使将氨基化的DNA探针与SiO2绝缘层表面的羧基进行键合偶联形成敏感元件。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中采用低压化学气相淀积方法在CMOS衬底上沉积形成氮化娃层的方法是以二氯二氢娃和氨气为反应原料在压力为0. riO托范围内，温度为700-800°C的条件下进行沉积获得氮化硅层。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中在所述氮化硅层上覆盖正性光刻胶的方法为旋转涂胶方法。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中正性光刻胶的曝光条件为光的波长是248nm，光源是氟化氩激光光源；曝光剂量为lOOmJ/cm2，曝光后正胶显影所用的正胶显影液为四甲基氢氧化铵，所述四甲基氢氧化铵的当量浓度为0. 2-0. 3。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步骤(3)中羧基化方法采用的试剂为丁二酸，羧基化方法的温度控制在75°C。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步骤(3)中偶联反应中以I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)为羧基的活化试剂。
全文摘要
本发明公开了一种基于MOSFET结构的DNA电化学传感器，包括CMOS衬底，所述CMOS衬底上沉积有氮化硅层，所述氮化硅层上覆盖二氧化硅绝缘层；其特征在于所述二氧化硅绝缘层为具有微孔结构的微孔阵列，所述微孔侧壁上SiO2绝缘层通过羧基偶联有DNA探针作为敏感元件。该微孔结构不但可以检测DNA探针与DNA靶标之间的结合而且可以在微孔中进行模板扩增有利于利用pH检测功能来检测DNA的合成，进而具有DNA测序功能。
文档编号G01N27/26GK102628827SQ201210103139
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者何越, 杨楠, 臧伯玮, 艾洪新 申请人:凯晶生物科技(苏州)有限公司
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