专利名称：Fkbp52-tau相互作用作为新颖治疗靶点用于治疗涉及tau机能失调的神经障碍的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及神经障碍(包括阿尔茨海默病)的神经保护和修复，该神经障碍涉及Tau机能失调。本发明描述了蛋白FKBP52和Tau之间的直接相互作用。本发明涉及作用于FKBP52-Tau相互作用的分子的筛选方法，从而调节病原性Tau的有害影响。最后本发明涉及神经障碍的治疗性诊断、预后和监测分析，该神经障碍涉及Tau机能失调。
背景技术：
Tau蛋白是在中枢神经系统(主要是神经元)中广泛表达的主要微管相关蛋白 (MAP)，其中它在调节微管动力学、轴突运输和神经突生长(neurite outgrowth)中起关键作用。Tau蛋白以位于染色体17上的单一基因初级转录物的外显子2、3和10的可变剪接产生的六种不同的异形体存在于成人脑中。它们的序列长度为352到441个氨基酸不等。 越来越多的证据提示“聚集的”Tau的异常装配(天然未折叠蛋白)是涉及Tau机能失调的总称为tau蛋白病或神经障碍的一系列人类认知疾病的标志，其包括阿尔茨海默病、皮克病、皮质基底节退化症、轻度认知损害、进行性核上性麻痹和具有染色体17-连锁的震颤麻痹的额颞痴呆。Tau的异常(例如高磷酸化、突变、截断和“缠结1集)可能是致病过程的起作用的因素。迄今为止，Tau改变在诱导神经变性疾病中的作用尚未完全了解，因此译解控制Tau结构/功能的分子机制是非常重要的，并可以有助于发现这些疾病的新的治疗方法。本发明基于Tau蛋白(所有6个异形体)特异性且直接地与亲免素 FKBP52(H(506-结合蛋白)结合的发现。FKBP是强力免疫抑制药物Π(506和雷帕霉素的普遍表达的细胞内受体家族，且因此发生于在称为亲免素的一大组蛋白质中。这些蛋白质显示大的分布，且在神经系统中尤其丰富，提示显著不同于其免疫调节作用的新颖和意外的功能。此外，已报道了冊506的神经保护作用。这些后来的观察提供了 FKBP蛋白家族的新前景，以及Π(506及其非免疫抑制性衍生物分子作为设计用于治疗神经系统损害和疾病的新治疗试验的特别关注。最初鉴定并克隆为与类固醇受体相关(Lebeau等.，1992)的FKBP52呈现�？榛橹浒ㄋ母龅ザ赖墓δ芙峁褂�(Callebaut等.，1992)。定位于蛋白质的N末端部中的 FKBP52的Π(506结合位点(结构域I) (aa 1到149)包含所有亲免素蛋白家族特征性的肽基脯氨酰基异构酶(PPI酶)活性(Chambraud等·，1993)。而第二结构域(aa 149到267) 与结构域I具有共同的结构同源性，PPI酶活性是剩留的且其不结合1^506(14，15)；结构域 II的显著方面是共有的ATP-GTP-结合序列(16)。覆盖结构域III和IV的C末端结构域包括假定的钙调素结合位点(Massol等.，1992)，且通过它的三个三十四肽重复序列(TPR) (aa 273到389)调节该蛋白质与HSP90的相互作用(Radanyi等.，1994)，后者也是类固醇受体复合物的组分(Catelli 等·，1980，Tai 等.，1986 ；Renoir 等·，1990)。此外，FKBP52 与HSP90的结合活性也通过特异性地磷酸化FKBP52的酪蛋白激酶II来调节(Myata等.， 1997)。
最近报道，FKBP52与微管相互作用并阻止微管蛋白聚合(Chambraud等.，2007)。 迄今为止获得的结果表明微管蛋白聚合被FKBP52抑制可能不仅是由微管蛋白的隔离产生或由FKBP52对其结构的改变(例如弯曲)产生，而且可能涉及微管蛋白组装成微管所需的另一个重要因素。现在发明人在此假设，对一种或多种微管稳定因子，例如微管相关蛋白(MAP)的干预可以解释微管蛋白聚合被FKBP52抑制。采用典型的生物化学和细胞学方法，他们确定了 FKBP52对Tau功能的作用的牢固基�。⒎⑾諪KBP52和Tau之间的直接和特异性的相互作用。这种FKBP52-Tau相互作用导致已知的Tau介导的细胞功能的调节，例如微管蛋白聚合(FKBP52抑制这种功能)、Tau积累(FKBP52抑制这种积累)和神经突生长(neurite outgrowth)ο发明简述发明人已发现亲免素FKBP52和微管相关蛋白Tau(以所有其已知异形体形式， 高磷酸化或未高磷酸化的)之间的直接和特异性的蛋白-蛋白相互作用。本发明确认 FKBP52-Tau相互作用提供可有利地用于涉及Tau机能失调的神经障碍(尤其是阿尔茨海默病)的新颖治疗方法的新靶点。因此本发明提供用于鉴别分子的方法，所述分子调节FKBP52_Tau相互作用，从而有利地作用于涉及Tau机能失调的神经障碍的有害影响。经由本发明方法鉴别其调节Tau和FKBP52之间相互作用的能力的分子是用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍(且尤其是阿尔茨海默病)的药物候选物。本发明也确认FKBP52_Tau相互作用提供可能涉及诊断、预后、临床随访的生物标志物。发明详述本发明的筛选方法本发明的第一个目的是筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，包括以下步骤a)测定候选化合物调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力，和b)正向选择调节所述相互作用的候选化合物。如此处所使用，术语“涉及Tau机能失调的神经障碍”包括但不限于阿尔茨海默病、额颞痴呆、皮质基底节退化和额颞叶退化(也称为皮克病)、以及将来也许证实为涉及 Tau的所有神经障碍，例如帕金森病。在本发明上下文中，如此处所使用的术语“治疗(treating)，，或“治疗 (trerment)”是指逆转、缓解或抑制该术语适用的疾病或病症的发展，或该疾病或病症的一种或多种症状。如本发明所使用，术语“预防”是指防止还没有诊断为患病的受试者发生该疾病或病症。如本发明所使用，“调节FKBP52和Tau之间的相互作用的化合物”的表达是指具有抑制、降低或增强蛋白Tau和蛋白FKBP52之间相互作用的能力的任何化合物。步骤a)中，适于筛选蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法是合适的。不管筛选方法的步骤a)的实施方式，完整的Tau蛋白和完整的FKBP52蛋白可用作结合伴体。或者，包括相互作用位点的Tau蛋白和FKBP52蛋白的片断可用作结合伴体。因此，在一个实施方式中，本发明筛选方法的步骤a)由以下步骤组成al)使待测试候选化合物与第一 Tau多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列和( 第二 FKBP52多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列的混合物接触，a2)测定所述候选化合物调节所述Tau多肽和所述第二 FKBP52多肽之间的结合的能力。术语“多肽”在此处是指没有特定长度的氨基酸聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白质包括在“多肽”的定义中，且这些术语在整个说明书以及权利要求书中可互换使用。术语“多肽”不排除翻译后修饰，其包括但不限于磷酸化、乙酰化、糖基化等。尤其是，该术语包括多肽的所有磷酸化形式(例如Tau或Π(ΒΡ的所有磷酸化形式)。该“多肽”定义也包括其同系物。因此，术语“Tau多肽”是指包括与FKBP52蛋白相互作用的位点的Tau蛋白或其片段。以相同方式，术语“FKBP52多肽”是指包括与Tau蛋白相互作用的位点的FKBP52蛋白或其片段。当大于80 %，优选大于85 %，优选大于90 %的氨基酸是相同的，或大于约90 %， 优选大于95%的氨基酸是相似的(功能相同)时，两个氨基酸序列是“基本上同源”或“基本上相似”的。术语“序列同一性”是指两条肽之间的同一性。序列之间的同一性可通过比较可为比较目的而对准的各序列的位置来确定。当比较序列中的某位置被相同碱基或氨基酸占据时，则该序列在该位置是同一的。核酸序列之间的序列同一性程度是这些序列共有的位置上具有相同核苷酸的数目的函数。氨基酸序列之间的同一性程度是这些序列共有的相同氨基酸序列的数目的函数。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，序列进行对准从而进行最佳比较。例如，可在第一氨基酸序列或第一核酸序列的序列中引入空位以与第二氨基酸序列或第二核酸序列进行最佳对准。然后比较位于相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被和第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，该分子在该位置是同一的。两条序列之间的同一性百分比是由该序列共有的相同位置的数目的函数。在该比较中，所述序列的长度可以相同或不同。用于确定比较窗的序列最佳对准可通过Smith和Waterman的局部同源性算法 (J. Theor. Biol. ,91(2)pgs. 370-380(1981)进行，通过 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法(J. Miol. Biol.，48(3)pgs. 443-453(1972))进行，通过经由 Pearson 和 Lipman 的方法来寻找相似性(PNAS，USA，85(5)pgs. 2444-2448(1988))来进行，通过这些算法的计算机化 Α^Τ (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wis.)来进行或通过检查来进行。术语“序列相似性”是指氨基酸可以修饰但保持相同功能。已知氨基酸根据其侧基的性质来分类，且一些氨基酸例如碱性氨基酸可以彼此交换，但仍保持它们的基本功能。在一个实施方式中，步骤在于产生说明所述候选化合物是否具有调节所述第一多肽和所述第二多肽之间的相互作用的能力的物理值，并将所述值与不存在所述候选化合物时进行的相同试验中获得的标准物理值相比较。取决于所进行的结合试验，上述“物理值”可以是各种各样的，但特别包括吸光度值、放射性信号和荧光信号强度值。如果在比较物理值与标准物理值后确定所述候选化合物调节所述第一多肽和所述第二多肽之间的结合，则在步骤b)正向选择该候选化合物。调节(i)Tau多肽和(ii)FKBP52多肽之间相互作用的化合物包括与Tau多肽或与 FKBP52多肽结合的那些化合物，条件是所述目标化合物的结合然后调节Tau和FKBP52之间的相互作用。本发明多肽可通过本身是本领域已知的任何技术产生，例如但不限于，单独或组合使用的任何化学、生物学、遗传学或酶学技术。知道所需序列的氨基酸序列后，本领域技术人员可以容易地通过产生多肽的标准技术来制备所述多肽。例如，它们可以通过用众所周知的固相法，优选用可商购的肽合成仪器(例如由Applied Biosystems, Foster City，California制备的那些)并根据厂商指导来合成。或者，本发明的多肽可通过本领域众所周知的重组DNA技术来合成。例如，在将编码所需(多)肽的DNA序列引入表达载体并将这种载体引入表达所需多肽的适当的真核或原核宿主后，这些片断可作为DNA表达产物获得，随后可以用众所周知的技术将它们从宿主中分离出来。多种宿主/表达载体组合可用于表达编码本发明多肽的核酸。可使用的有用的表达载体包括例如染色体片断、非染色体和合成DNA序列。适当的载体包括但不限于SV40和 pcDNA 的衍生物；和已知的细菌质粒，例如 col EI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9 及其衍生物；质粒，例如RP4 ；噬菌体DNA，例如噬菌体I的众多衍生物，例如NM989，以及其他的噬菌体DNA，例如M13和细丝状单链噬菌体DNA ；酵母质粒，例如2微米质粒或2微米质粒的衍生物，以及着丝�：驼辖湍复┧笤靥澹挥糜谡婧讼赴械脑靥澹缈捎糜诶コ婊虿溉槎锵赴械脑靥澹焕丛从谥柿：褪删錎NA的组合的载体，例如已修饰以使用噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等等。因此，哺乳动物和典型的人细胞，以及细菌、酵母、真菌、昆虫、线虫和植物细胞可用于本发明中，且可通过此处定义的核酸或重组载体来转染。适当细胞的实例包括但不限于，VERO 细胞；HELA 细胞，例如 ATCC No. CCL2 ；CHO 细胞系，例如 ATCC No. CCL61 ；COS 细胞， 例如 C0S-7 细胞和 ATCC No. CRL 1650 细胞；W138、BHK、!fepG2、3T3，例如 ATCC No. CRL6361 ； A549、PC12、K562 细胞、293T 细胞、Sf9 细胞，例如 ATCC No. CRL1711 和 Cvl 细胞，例如 ATCC No. CCL70。可用于本发明的其他适当的细胞包括但不限于原核宿主细胞菌株，例如大肠杆菌(例如菌株DH5_[ α ])、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的菌株。可用于本发明的其他适当的细胞包括酵母细胞，例如酵母属细胞，例如酿酒酵母。在一个实施方式中，本发明的任何Tau衍生的多肽或FKBP52多肽可检测分子标记以用于筛选目的。根据本发明，所述可检测分子可以由能通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的任何化合物或物质组成。例如，有用的可检测分子包括放射性物质(包括含有32P、25S、3H或1251的那些)、荧光染料(包括5-溴脱氧尿苷、荧光素、乙酰氨基芴或毛地黄毒苷)、荧光蛋白(包括GFP和YFP)或可检测的蛋白或肽(包括生物素、多组氨酸尾部或其他的抗原标签，如HA抗原、FLAG抗原、c-myc抗原和DNP抗原)。根据本发明，所述可检测分子位于或结合至位于目标氨基酸序列外部的氨基酸残基上，从而最小化或阻止任何对所述多肽之间或所述候选化合物和或任何所述多肽之间的结合产生人为影响。在另一个具体实施方式
中，本发明多肽与GST标签(谷胱甘肽S-转移酶)融合。 在该实施方式中，所述融合蛋白的GST部分可用作可检测分子。在所述融合蛋白中，GST可以位于N末端或C末端。当GST可检测分子随后与抗GST抗体接触(包括与标记的抗GST 抗体接触)时，可以检测到该分子。用各种可检测分子标记的抗GST抗体可容易地商购得到。在另一个具体实施方式
中，本发明多肽与多组氨酸标签融合。所述多组氨酸标签通常包括至少四个连续的组氨酸残基，且通常包括至少六个连续的组氨酸残基。这种多肽标签也可以包括高达20个连续的组氨酸残基。所述多组氨酸标签可以位于N末端或C末端。在该实施方式中，当所述多组氨酸标签与抗多组氨酸抗体接触(包括与标记的抗多组氨酸抗体接触)时，可以检测到该标签。用各种可检测分子标记的抗多组氨酸抗体可容易地商购得到。在进一步的实施方式中，本发明多肽与由转录因子的DNA结合域或激活剂域组成的蛋白质部分融合。转录因子的所述蛋白部分结构域可以位于N末端或C末端。这种DNA 结合域可以由来源于大肠杆菌的LexA蛋白的公知的DNA结合域组成。此外，转录因子的所述激活剂域可以由来源于酵母的公知的蛋白的激活剂域组成。在本发明筛选方法的一个实施方式中，上面描述的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽包括转录因子的部分。在所述试验中，第一和第二部分结合在一起产生与特异性的调控 DNA序列结合的功能性转录因子，其再诱导报告DNA序列的表达，所述表达进一步进行检测和/或测定。所述报告DNA序列的表达的阳性检测意味着由于所述第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽结合在一起，活性转录因子形成。通常，在双杂合测试中，转录因子的第一和第二部分分别由(i)转录因子的DNA结合域和(ii)转录因子的激活剂域组成。在一些实施方式中，DNA结合域和激活剂域均来源于相同的天然存在的转录因子。在一些实施方式中，DNA结合域和激活剂域来源于不同的天然存在的因子，而当结合在一起时，这两个部分形成活性的转录因子。此处转录因子所使用的术语“部分”包括涉及多个蛋白转录因子的完整蛋白，以及完整的转录因子蛋白的特异性功能蛋白结构域。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明筛选方法的步骤a)包括以下步骤(1)提供宿主细胞表达-⑴以上定义的Tau多肽和(ii)转录因子的第一蛋白部分之间的第一融合多肽，-⑴以上定义的FKBP52多肽和(ii)转录因子的第二部分之间的第二融合多肽，当所述第一和第二蛋白部分结合在一起时，所述转录因子在DNA靶调控序列上是活性的，和所述宿主细胞还包含核酸，其含有(i)可由所述活性转录因子活化的调控DNA序列和(ii)可操作地与所述调控序列连接的DNA报告序列，(2)使步骤1)提供的所述宿主细胞与待测试候选化合物接触，
(3)测定所述DNA报告序列的表达水平。由上述步骤(3)测定的所述DNA报告序列的表达水平与当步骤⑵省略时所述 DNA报告序列的表达相比较。存在所述候选化合物时所述DNA报告序列的不同表达水平意味着所述候选化合物有效调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的结合，以及所述候选化合物可以通过筛选方法的步骤b)正向选择。适当的宿主细胞包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。然而优选的宿主细胞是酵母细胞，更优选是酿酒酵母细胞或粟酒裂殖酵母细胞。双杂合测试的类似系统是本领域熟知的，因此可用于进行本发明筛选方法(参见 Fields 等.1989 ；Vasavada 等.1991 ；Fearon 等· 1992 ；Dang 等.，1991，Chien 等.1991，US 5，283，173，US 5，667，973，US 5，468，614，US 5，525，490 和 US5, 637，463)。例如，如这些文献中所描写的，Gal4激活剂域可用于进行本发明的筛选方法。Gal4由两种物理学上离散的模块化结构域组成，一种作为DNA结合域发挥作用，另一种作为转录-活化域。以上文献中描述的酵母表达系统利用了这种性质。在Gal4-活化的启动子控制下的Gall-LacZ报告基因的表达依赖于经由蛋白质-蛋白质相互作用的活性的重建。用β —半乳糖苷酶的显色底物检测含有相互作用多肽的集落。用于鉴别蛋白质-蛋白质相互作用的竞争试剂盒(MATCHMAKER，TM)可从 Clontech 商购。因此在一个实施方式中，以上定义的第一 Tau多肽与的DNA结合域融合，且以上定义的第二 FKBP52多肽与的激活剂域融合。所述可检测的标志物基因的表达可通过定量所产生的相应的特异性mRNA的量来评估。然而，通�？杉觳獾谋曛疚锘蛐蛄斜嗦肟杉觳獾鞍祝佣隹杉觳獾谋曛疚锘虻谋泶锼酵ü克南嘤Φ鞍字实牧坷雌拦�。用于定量mRNA或蛋白质的量的技术是本领域熟知的。例如，在调控序列控制下的可检测的标志物基因可由上述半乳糖苷酶组成。在另一个实施方式中，步骤a)包括在存在或不存在待测试候选化合物的情况下使如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽的混合物进行凝胶移位分析，然后通过进行所述多肽之间形成的复合物的检测来测定所述多肽一起的结合的步骤。凝胶移位分析可如本领域技术人员已知的方法进行。因此在本发明的一个实施方式中，本发明筛选方法的步骤a)包括以下步骤(1)提供如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽，(2)使待测试候选化合物与所述多肽接触，(3)用适当的移位底物与所述多肽和步骤( 获得的所述候选化合物进行凝胶移位分析，(4)检测并定量步骤( 进行的移位分析上所述多肽之间形成的复合物。然后将多肽之间形成的复合物的存在或量与当不存在待测试候选化合物时进行的分析所获得的结果相比较。所述两种多肽之间形成的复合物的检测可通过以下步骤容易地进行用适当的染料染色移位凝胶，然后测定对应于所分析蛋白质的蛋白质带，因为第一和第二多肽之间形成的复合物具有特定的表观分子量。凝胶中蛋白质的染色可采用本领域熟知的方法进行。适当的凝胶是本领域熟知的，但优选使用非变性凝胶。以通用方式，western印迹分析是本领域熟知的并被广泛描述(Rybicki等·，1982 ；Towbin等· 1979 ；Kurien等· 2006)。在具体实施方式
中，对应于进行凝胶移位分析的多肽的蛋白质带可通过特异性抗体检测。可使用抗Tau多肽的抗体和特异性地抗FKBP52多肽的抗体。在另一个实施方式中，如上所述用可检测抗原标记所述两种多肽。因此，蛋白质带可通过抗所述可检测抗原的特异性抗体来检测。优选地，与Tau多肽偶联的可检测抗原和与FKBP52多肽偶联的抗原不同。例如，第一 Tau多肽可以与GST可检测抗原融合，且第二 FKBP52多肽可以与HA抗原融合。然后两种多肽之间形成的蛋白复合物可分别用抗GST和 HA抗原的抗体来定量并测定。在另一个实施方式中，步骤a)包括利用例如Edwards等(1997)或也如等 (1995)所描述的光学生物传感器。该技术允许实时检测分子之间的相互作用而不需要标记的分子。事实上该技术是基于表面等离子体共振(SPR)现象。简言之，第一蛋白伴体与表面(例如羧甲基右旋糖酐基质)连接。然后在存在或不存在待测试候选化合物的情况下， 第二蛋白伴体与之前固定的第一伴体一起孵育。然后检测结合，包括结合水平，或所述蛋白伴体之间结合的不存在。为此目的，使光束指向在不含有待测试样品的基质的表面区域侧， 并由所述表面反射。随着角度和波长组合的变化，sra现象引起反射光强度的降低。第一和第二蛋白伴体的结合引起基质表面上折射指数的变化，这种变化检测为SH 信号的变化。在本发明的另一个实施方式中，筛选方法包括采用亲和层析。用于上述筛选方法的候选化合物也可通过任何免疫亲和层析技术使用如上定义的(i)第一 Tau多肽或(ii)第二 FKBP52多肽预先固定在其上的任何层析基质根据本领域技术人员熟知的技术来选择。简言之，如上定义的Tau多肽或FKBP52多肽可采用常规技术结合至柱上，包括化学偶合至适当的柱基质(例如琼胶糖、Affi Gel 或本领域技术人员熟知的其他基质)上。在该方法的一些实施方式中，亲和柱包含嵌合蛋白，其中如上定义的 Tau多肽或FKBP52多肽融合至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)上。然后使候选化合物与所述第一和第二多肽中的另一种多肽预先地、同时地或随后地与亲和柱的层析基质接触。洗涤后， 对层析基质进行洗脱，且通过检测和/或定量所述较晚施加的第一或第二多肽来分析收集的洗脱液，从而确定候选化合物是否调节(i)第一 Tau多肽和(ii)第二 FKBP52多肽之间的结合和/或调节到何种程度。本发明筛选方法的另一个实施方式中，用荧光分子或底物标记如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽。因此，待测试候选化合物对如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽之间的结合的潜在改变效应通过荧光定量来测定。例如，如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽可以与自动荧光多肽(如上述 GFP或YFP)融合。如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽也可用适于荧光检测和/ 或用荧光能量转移(FRET)分析进行所述多肽之间结合的定量的荧光分子来标记。如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽可通过与如GFP或YFP的荧光分子的共价化学结合来用荧光分子直接标记。如上定义的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽也可例如通过所述多肽和所述荧光分子之间的非共价结合来用荧光分子间接标记。事实上，如上定义的所述第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽可与受体或配体融合，且所述荧光分子可与相应配体或受体融合，这样荧光分子可与所述第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽非共价地结合。适当的受体/配体偶可以是生物素/抗生蛋白链菌素配对成员或可以选自抗原/抗体配对成员。例如，本发明多肽可以与多组氨酸尾融合，且荧光分子可以与抗多组氨酸尾的抗体融合。如已说明的，本发明筛选方法的步骤a)包括用FRET通过荧光分析测定候选化合物调节如上定义的Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力。因此，在一个具体实施方式
中，如上定义的第一 Tau多肽用第一荧光团物质标记，且第二 FKBP52多肽用第二荧光团物质标记。第一荧光团物质的波长值基本上等于第二荧光团的激发波长，其中所述第一和第二多肽的结合通过测定第二荧光团物质的发射波长处发射的荧光信号强度来检测。或者，第二荧光基团质也可以具有第一荧光团的发射波长，从而所述第一和第二多肽的结合通过测定第一荧光团物质的波长处发射的荧光信号强度来检测。所使用的荧光团可以是各种适当的种类，例如众所周知的镧族元素螯合物。这些螯合物已被描述为在特异性生物亲和试验的生物缀合和显著能量迁移后具有化学稳定性、 长效荧光(持续时间大于0. lms)。文献US 5，162，508公开了二吡啶穴状化合物。具有 TEKES型光敏剂(EP0203047A1)和三吡啶型光敏剂(EP0649020A1)的聚羧酸盐螯合物也是已知的。文献W096/00901公开了二乙烯基三胺五乙酸(DPTA)螯合物，其使用喹诺酮作为敏化剂。具有其他敏化剂和其他示踪金属的另外的DPT螯合物对于诊断或成像应用也是已知的(例如，EP0450742A1)。在优选的实施方式中，筛选方法的步骤a)中进行的荧光分析包括均相时间解析荧光(HTRF)分析，例如文献WO 00/01663或US6，740，756中所描述的，该两个文献的全部内容以引用方式合并于此。HTRF是基于TR-FRET的技术，其采用TRF(时间解析荧光)和 FRET两者的原理。更具体地说，本领域技术人员可采用基于如Leblanc等^00 描述的时间解析扩增穴状化合物发射(TRACE)技术的HTRF分析。HTRF供体荧光团是铕穴状化合物，其具有与穴状化合物包封的稳定性结合的镧系元素的长效发射。XL665，由红藻纯化得到的修饰的别藻青蛋白，是HTRF主要受体荧光团。当这两种荧光团通过生物分子相互作用组合在一起时，在激发期间由穴状化合物捕获的一部分能量通过620nm处的荧光发射释放，同时将其余能量转移给XL665。然后该能量作为在665nm处的特定荧光由XL665释放。 665nm处的光仅通过具有铕的FRET来发射。因为铕穴状化合物始终存在于该分析中，即使当生物分子相互作用不能使XL665紧密接近时，仍能检测到620nm处的光。因此，在一个实施方式中，筛选方法的步骤a)可以包括以下步骤(1)使包含以下组分的分析前样品形成接触-与第一抗原融合的第一Tau多肽，-与第二抗原融合的第二FKBP52多肽，-待测试候选化合物，(2)将以下组分加入步骤(2)所述的分析前样品中-特异性抗所述第一抗原的用European穴状化合物标记的至少一种抗体，-抗第二所述抗原的用XL665标记的至少一种抗体，(3)在所述European穴状化合物的激发波长处照射步骤O)的分析样品，(4)检测和/或定量XL665发射波长处发射的荧光信号，(5)将步骤(4)获得的荧光信号与当不存在待测试候选化合物时制备的步骤(1) 的分析前样品获得的荧光进行比较。
如果在上述步骤(5)中，荧光信号强度与当不存在待测试候选化合物时制备的步骤(1)的分析前样品获得的荧光信号强度不同(更低或更高)，则可在筛选方法的步骤b) 中正向选择该候选化合物。用European穴状化合物标记或用XL665标记的抗体可以抗不同的目的抗原， 包括GST、多组氨酸尾部、DNP、c-myx、HA抗原和其包含的FLAG。这些抗体包括可从 CisBio (Bedfors，MA，USA)商购得到的那些，以及特别地分别称为61GSTKLA或61HISKLB的那些。在一个具体实施方式
中，本发明方法还可以包括测定候选化合物调节淀粉样前体蛋白(APP)多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力的步骤。事实上，最近研究表明， FKBP52通过其Π(506相互作用域与APP形成稳定的复合物。该研究确定了 FKBP52在调节 A β 肽的毒性中的新作用(Sanokawa-Akakura R, Cao W, Allan K, Patel K, Ganesh A, Heiman G,Burke R,Kemp FW,Bogden JD,Camakaris J,Birge RB,Konsolaki Μ. Control of Alzheimer' s amyloid beta toxicity by the high molecular weight immunophilin FKBP52and copper homeostasis in Drosophila. PLoS One. 20IOJan 13 ；5 (1) :e8626)。因此，调节Tau和FKBP52之间的相互作用和APP和FKBP52之间的相互作用的化合物可用于治疗阿尔茨海默病。本发明的细胞水平(in cellulo)筛选方法本发明说明书之前描述的体外筛选的任何一个实施方式结束时正向选择的候选化合物可进行进一步的选择步骤以进一步测定其对Tau介导的细胞功能(例如微管蛋白聚合)、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的性能。为此目的，可进一步选择根据如上所述的一般体外筛选方法正向选择的候选化合物调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau 聚集和所有翻译后Tau修饰的能力。因此本发明的另一方面涉及筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，其中所述方法包括以下步骤i)通过进行权利要求1到6任一项所述的体外筛选方法来筛选调节Tau和FKBP52 蛋白之间的相互作用的化合物，和ii)对步骤i)结束时正向选择的化合物的Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰进行筛选。在上述筛选方法的某些优选实施方式中，所述筛选方法的步骤ii)包括以下步骤(1)使细胞与步骤i)结束时正向选择的化合物接触，(2)测定该化合物调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau 修饰的能力，(3)将步骤( 测定的Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau 修饰与当不存在所述正向选择的化合物的情况下进行步骤(1)时测定的Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰进行比较。为进行步骤(1)，任何细胞可能是合适的，但优选神经元。上述步骤(1)可通过将一定量待测试候选化合物加入培养基来进行。通常，制备多个培养物样品，从而将增加量的待测试候选化合物加入不同的培养物样品中。通常，也制备至少一个不含候选化合物的培养物样品，其作为阴性对照来进行进一步比较。任选地，也制备至少一个含有调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的已知试剂的培养物样品，其作为阳性对照来使所述方法标准化。因此，步骤C3)可通过将与待测试候选化合物一起孵育的细胞培养物所获得其中 Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比与用不含所述候选化合物的阴性对照细胞培养物所获得的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比进行比较来进行。例证性地，候选化合物的效力可通过将(i)与其一起孵育的细胞培养物所测定的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比与(ii)与调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的已知试剂一起孵育的细胞培养物的上清液所测定的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比进行比较来评估。进一步例证性地，候选化合物的效力可通过测定其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节细胞的百分比接近于或高于用调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的已知试剂所测定的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比所需加入细胞培养物中的候选化合物的量来评估。本发明的候选化合物根据本发明的一个实施方式，候选化合物可选自下组肽、拟肽、有机小分子、抗体、适体或核酸。例如本发明候选化合物可以选自之前合成的化合物文库，或数据库中结构确定的化合物的文库，或选自已经从头合成的化合物的文库。在一个具体的实施方式中，候选化合物可以选自有机小分子。如此处所使用的，术语“有机小分子”是指大小与通常用于药物的有机分子相当的分子。该术语排除生物大分子(例如蛋白质、核酸等)；优选的有机小分子的大小范围为最高2000Da，最优选最高约lOOODa。本发明候选化合物可选自通过干扰其合成、翻译和配体/底物/产物结合来中和 FKBP52的PPI酶活性的分子。在优选的实施方式中，所述分子选自蛋白FKBP52的结构域I的PPI酶配体，优选阻止、阻断或抑制FKBP52的结构域I的PPI酶活性的PPI酶配体。有利地，本发明分子可在不诱导免疫抑制活性的情况下阻止/抑制/阻断蛋白 FKBP52的结构域I的PPI酶活性。第一系列的分子是缺乏免疫抑制活性的Π(506衍生物。FK506由以下结构式表示
权利要求
1.筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，包括以下步骤a)测定候选化合物调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力，和b)正向选择调节所述相互作用的候选化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)由以下步骤组成al)使待测试候选化合物与第一 Tau多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列和第二 FKBP52多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列的混合物接触，a2)测定所述候选化合物调节所述Tau多肽和所述第二 FKBP52多肽之间的结合的能力。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述Tau多肽或FKBP52多肽用可检测分子标记。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述Tau多肽用第一荧光团物质标记，和所述 FKBP52多肽用第二荧光团物质标记。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一荧光团物质的发射波长值基本等于第二荧光团物质的激发波长值，以使得所述Tau多肽和所述FKBP52多肽的结合通过测量第二荧光团物质的发射波长值处发射的荧光信号强度来检测。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述候选化合物选自下组肽、拟肽、有机小分子、抗体、适体或核酸。
7.筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，其中所述方法包括以下步骤i)通过进行权利要求1到6任一项的体外筛选方法来筛选调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用的化合物，和 )对步骤i)结束时正向选择的化合物进行Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的筛选。
8.用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用的化合物。
9.测试被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的方法，其包括分析从所述受试者获得的目标样品的步骤，该步骤用于i)测量FKBP52蛋白和Tau蛋白的复合物的水平；和/或 )检测编码FKBP52蛋白的基因和/或其相关启动子中突变的存在；和/或iii)分析编码FKBP52蛋白的基因的表达；iv)测量FKBP52蛋白的浓度；和/或 ν)检测FKBP52蛋白的翻译后修饰。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述目标样品选自任何细胞样品；生物流体，包括血液、血清、尿、脊髓液；或从受试者的组织中获得的任何活检样品。
全文摘要
本发明一般涉及神经障碍(包括阿尔茨海默病)的神经保护和修复，该神经障碍涉及Tau机能失调。本发明描述并包括蛋白FKBP52和Tau之间的直接相互作用。更特别地，本发明涉及筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，包括以下步骤a)测定候选化合物调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力，和b)正向选择调节所述相互作用的候选化合物。最后本发明涉及神经障碍的诊断、预后和监测分析，该神经障碍涉及Tau机能失调。
文档编号G01N33/68GK102549438SQ201080044098
公开日2012年7月4日 申请日期2010年9月24日 优先权日2009年9月24日
发明者艾蒂安·博利安, 贝亚特丽斯·尚布罗 申请人:国家健康与医学研究院
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