专利名称：一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药材指纹图谱的建立方法，尤其是红花药材高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的红花药材标准指纹图谱，属于药物分析技术领域。
背景技术：
红花为菊科植物红花的花。红花为一年生草本，我国东北、华北、西北及山东、浙江、贵州、四川、西藏等地广泛栽培。红花性温，味辛，活血通经、散瘀止痛。用于经闭、痛经、恶露不行、症瘕痞块、跌打损伤。古人常有於血在体内时，常加红花一小把。纱布包煮开可用一天两次泡脚，适用各种静脉曲张，末梢神经炎，血液循环不好，腿脚麻木或青紫等淤血症。红花中成分比较复杂，含有红色的和黄色的色素红花甙、前红花甙、红花黄色素A及B、红 花明甙A。又含多酚类成分绿原酸、加啡酸、儿茶酚、焦性儿茶酚、多巴。还含挥发性成分八十余种，以及红花多糖等。由于受产地、气候和生态环境等的影响，不同红花药材所含的成分也存在着一定差异。《中国药典》对红花药材的质量控制仅限于红花黄色素A和山奈素含量的测定，不能系统、完整地反映红花的内在质量。要控制红花及其成方制剂功效，就不能只针对其中1、2个化学成分，必须对它的物质群整体予以控制。中药指纹图谱特指中药材或中成药经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体共有特征的图谱或图象。目前指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一。中药指纹图谱经过了数十年的研究，使用了包括紫外、红外、气相、高效液相、薄层、核磁共振、扫描电子显微镜、计算机图像分析、电泳技术、同功酶分析法、分子生物学技术、聚类分析技术等许多现代分析测试手段，为中药的物质鉴定和成分分析积累了大量的数据。但从中药全面质量控制的角度看，还远未达到有效地反映和控制中药的整体质量的目的。高效液相色谱(HPLC)指纹图谱在国际上容易获得认可，包括美国、英国、法国、加拿大、德国、日本和印度在内的许多国家更愿意接受HPLC指纹图谱。而且，目前还没有红花药材的指纹图谱。现有的红花药材质量控制方法，存在质量控制技术的不足的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种红花药材指纹图谱的建立方法。本发明的一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括以下步骤—、供试品溶液的制备称取红花药材粉末，置于具塞容器中，按质量体积比为Ig : IOOlOOmL的比例将红花药材粉末与水混合均匀，在室温条件下，超声震荡45min，取上清液用微孔滤膜过滤，收集滤液作为供试品溶液；二、指纹图谱的制作将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以质量百分含量为O. 2%磷酸水溶液为A相，乙腈为B相进行梯度洗脱；其中，高效液相色谱条件为色谱柱填料Phenomenex C18,规格为 250X4. 6mm, 5 μ m ;柱温为 25°C 35°C ;流动相为B相乙腈和A相质量百分含量为O. I O. 2%磷酸水溶液，流速O. 8^1. 2mL/min，检测波长370nm，进样量20 μ L ;在此条件下分析供试品溶液，得到红花药材的指纹图谱。本发明采用红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的红花药材的指纹图谱。本发明包含以下有益效果(I)将红花药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的
细微差异；(2)供试品制作简便，色谱条件容易实现；(3)方法的稳定性和重现性都比较好；(4)适于对红花药材真伪、产地和品质的鉴别和控制，弥补了现有质量控制技术的不足，使红花药材的质量控制更加完善和科学。
图I为本发明提供的红花药材的标准指纹图谱；其中，I至10为红花药材共有特征峰。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式的一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括以下步骤一、供试品溶液的制备称取红花药材粉末，置于具塞容器中，按质量体积比为Ig : IOOlOOmL的比例将红花药材粉末与水混合均匀，在室温条件下，超声震荡45min，取上清液用微孔滤膜过滤，收集滤液作为供试品溶液；二、指纹图谱的制作将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以质量百分含量为O. 2%磷酸水溶液为A相，乙腈为B相进行梯度洗脱；其中，高效液相色谱条件为色谱柱填料Phenomenex C18,规格为 250X4. 6mm, 5 μ m ;柱温为 25°C 35°C ;流动相为B相乙腈和A相质量百分含量为O. I O. 2%磷酸水溶液，流速O. 8^1. 2mL/min，检测波长370nm，进样量20 μ L ;在此条件下分析供试品溶液，得到红花药材的指纹图谱。本实施方式包含以下有益效果(I)将红花药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的
细微差异；(2)供试品制作简便，色谱条件容易实现；
(3)方法的稳定性和重现性都比较好；(4)适于对红花药材真伪、产地和品质的鉴别和控制，弥补了现有质量控制技术的不足，使红花药材的质量控制更加完善和科学。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是所述的流动相梯度洗脱过程中，洗脱液A、B相变化为(T30min，B相 15% 25% ;3(T40min，B相 25% 50% ;4(T50min，B相50% 80% ;5(T60min，B相80%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中所述的按质量体积比为Ig 200mL的比例将红花药材粉末 与水混合均匀。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中所述的微孔滤膜过滤是采用O. 45 μ m微孔滤膜进行过滤的。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式采用红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的红花药材的指纹图谱。本实施方式包含以下有益效果(I)将红花药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的
细微差异；(2)供试品制作简便，色谱条件容易实现；(3)方法的稳定性和重现性都比较好；(4)适于对红花药材真伪、产地和品质的鉴别和控制，弥补了现有质量控制技术的不足，使红花药材的质量控制更加完善和科学。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五不同的是所述的图谱有10个共有特征峰，保留时间分别为8. lmin、9. 7min、10. 5min、10. 9min、12. 9min、13. 7min、14. 6min、22. 0min、24. 3min和38. 2min,这些共有特征峰构成了红花药材的指纹特征,可作为红花药材的标准指纹图谱。其它与具体实施方式
五相同。通过以下试验验证本发明的有益效果试验II.仪器和药品使用Agilent-1100型高效液相色谱仪，配有在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器；红花药材共10批，均购于中草药市�。黄渌约廖状炕蚍治龃�。2.供试品溶液的制备精密称取红花药材粉末O. 5g，置于具塞容器中，加水IOOmL,超声震荡45min，冷却后取上清液用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。3.高效液相色谱分析色谱分离柱填料5 μ m Phenomenex C18, 250 X 4. 6mm ;流动相O. 2%磷酸水溶液-乙腈；采用梯度洗脱方式Omin — 30min — 40min — 50min — 60min,乙腈 15%— 25%- 50%- 80%- 80% ;流速 I. OmL/min ;检测波长 370nm ;柱温 30°C ;进样量20 μ I ;在此条件下分析供试品溶液，得到红花药材的指纹图谱。4.按照本发明提供的方法，对10批红花药材建立了 HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了 10个共有特征峰，保留时间分别为:8. lmin、9. 7min、10. 5min、10. 9min、
12.9min、13. 7min、14. 6min、22. 0min、24. 3min、38. 2min,这些共有特征峰构成了红花药材的指纹特征，可作为红花药材的标准指纹图谱。本试验得到的红花药材的标准指纹图谱如图I所示。由图I可以看出，通过本方法可以清晰地得到具有10个共有特征峰的红花药材的标准指纹图谱，为整体评价红花药材的质量提供了良好的依据。5.方法学考察5. I精密度考察取同一批样品，按试验I的方法进行供试品溶液制备，连续进样测定5次，将数据输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算，得到精密度匹配数据和精密度匹配的相似度数据，结果见表I和表2所示。表I精密度匹配数据
权利要求
1.一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤 一、供试品溶液的制备称取红花药材粉末，置于具塞容器中，按质量体积比为IgIOOlOOmL的比例将红花药材粉末与水混合均匀，在室温条件下，超声震荡45min，取上清液用微孔滤膜过滤，收集滤液作为供试品溶液； 二、指纹图谱的制作将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以质量百分含量为O. 2%磷酸水溶液为A相，乙腈为B相进行梯度洗脱； 其中，高效液相色谱条件为 色谱柱填料Phenomenex C18,规格为250X4. 6mm, 5 μ m ;柱温为25°C 35°C ;流动相为B相乙腈和A相质量百分含量为O. I O. 2%磷酸水溶液，流速O. 8^1. 2mL/min,检测波长370nm，进样量 20 μ L ； 在此条件下分析供试品溶液，得到红花药材的指纹图谱。
2.根据权利要求I所述的一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于所述的流动相梯度洗脱过程中，洗脱液Α、Β相变化为(T30min，B相15% 25% ;3(T40min，B 相 25% 50% ;4(T50min，B 相 50% 80% ;5(T60min，B 相 80%。
3.根据权利要求I所述的一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤一中所述的按质量体积比为Ig 200mL的比例将红花药材粉末与水混合均匀。
4.根据权利要求I所述的一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤一中所述的微孔滤膜过滤是采用O. 45 μ m微孔滤膜进行过滤的。
5.如权利要求I所述的一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的红花药材的指纹图谱。
6.根据权利要求5所述的红花药材的指纹图谱，其特征在于所述的图谱有10个共有特征峰，保留时间分别为8. Imin、9. 7min、10. 5min、10. 9min、12. 9min、13. 7min、14. 6min、22. 0min、24. 3min和38. 2min,这些共有特征峰构成了红花药材的指纹特征,可作为红花药材的标准指纹图谱。
全文摘要
一种红花药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，它涉及中药材指纹图谱的建立方法，本发明提供一种红花药材指纹图谱的建立方法。本发明的方法为一、供试品溶液的制备将红花药材粉末与水混合均匀，超声震荡，微孔滤膜过滤；二、指纹图谱的制作将供试品溶液注入高效液相色谱仪；色谱条件为色谱柱填料Phenomenex C18，规格为250×4.6mm，5μm；柱温为25℃~35℃；流动相为B相乙腈和A相质量百分含量为0.1～0.2％磷酸水溶液，流速0.8~1.2mL/min，检测波长370nm，进样量20μL。本发明的红花药材指纹图谱适于对红花药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。
文档编号G01N30/02GK102944625SQ20121048255
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者秦绪江, 单钰毓, 赛春梅, 刘文亮, 曲林, 凌雪宇, 李殿明 申请人:哈药集团中药二厂
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