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一种五味子有机酸分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种五味子有机酸分析方法。本发明提供了采用GC-MS分析五味子炮制品中有机酸的分析方法，同时提供了五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量测定方法。该分析方法是：取五味子粉加入硫酸甲醇、NaCl及乙醚-氯仿混合液、无水硫酸钠，干燥，制得样品；进行GC-MS分析。本发明针对五味子炮制品的有机酸的分析方法具有较强的专属性和良好的重现性，为五味子炮制前后有机酸的质量控制提供了依据。
【专利说明】一种五味子有机酸分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药饮片的质量控制领域，具体涉及五味子饮片有机酸的分析方法及其中代表性物质4-氧代戊酸的质量控制方法。
【背景技术】
[0002]五味子是木兰科五味子Schisandra Chinese (Turcz.) Baill.的干燥成熟的果实，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之效。临床用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠。《中国药典》2010版收载的五味子的炮制品种是五味子及醋蒸五味子，在五味子的临床应用上亦以此两种为主，醋蒸后酸涩作用增强，涩精止泻作用增强。五味子中主要成分包括木脂素、挥发油、有机酸类等。其中，木脂素的成分主要为联苯环辛烯型木脂素，现代研究多认为其为五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化等药理作用，以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等为代表，挥以油主要以a-菔烯，莰烯，(6-菔烯，月桂烯，a-萜品烯，柠檬烯，Y -萜品烯等为主，而有机酸多以小分子有机酸为主，如枸橼酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸等。
[0003]目前药典及各研究报道主要集中在对其所含木脂素成分的研究，有较多的文献对五味子炮制前后的木脂素含量进行了分析，其结果说明五味子经醋蒸后木脂素含量稍有增加，但基本无显著性差异，现版药典中关于五味子饮片及醋五味子饮片的质量控制均只以木脂素代表性成分五味 子醇甲作为其指标性成分，且限度相同。但五味子在醋蒸前后的药效作用及临床运用有较大的差异，且五味子醋蒸后主要体现的是止泻作用增强，尚无其增强止泻的相关成分的文献报道。因此对五味子炮制品进行全面的质量评价，特别是选择与药效作用相关成分并确定其限度，才能更加有效地保证五味子炮制品的质量，以保证其在临床上发挥最大的功效。
[0004]作为收敛固涩药的代表，五味子中的有机酸成分亦不容忽视。五味子的药效作用应是多成分的综合作用，不仅仅体现在其主要的木脂素类成分，因此对五味子中有机酸的化学成分、药理作用亦应深入研究，特别是炮制前后在有机酸上的差异。文献上对五味子有机酸的分析主要采取的是电位滴定法测定其所含的总有机酸含量，而对其具体的有机酸成分报道较少，特别是醋蒸后有机酸成分的变化无文献报道。
[0005]本发明针对现有研究的空白，采用新的手段对五味子中的有机酸进行了质量评价，特别是对生五味子及醋五味子有机酸采取了直接甲酯化的方法，并采用气质联用的方法进行了全面的分析，研究过程中发现五味子醋蒸后4-氧代戊酸的含量明显增加，通过药理实验证明4-氧代戊酸具有止泻的作用，测定了其中4-氧代戊酸的含量并规定了限度，解决了五味子炮制品有机酸质量控制的难题，充分体现了与药效相关的指标来控制饮片质量的要求，提高后的有机酸质量检测能更好地控制五味子炮制品中的有机酸的质量，本方法具有较强的专属性和良好的重现性。
【发明内容】

[0006]为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种五味子有机酸分析检测的方法，并建立五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量测定方法。为了达到这个目的，采用如下技术方案:
[0007]—种五味子炮制品有机酸的分析方法，包括以下步骤:
[0008](I)样品制备方法:取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各约0.2g，精密称定，置具塞试管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒温振荡器中35°C振荡24h( 150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,离心5min(3000r/min)，取上清液，加适量无水硫酸钠，干燥，即得。
[0009](2)GC-M S分析条件:质谱条件:EI离子源；电子能量70eV ;离子源温度230°C;四级杆温度150°C;检测电压1235V ;溶剂延迟3.2min。色谱条件:HP_5色谱柱(30mX 250 u m,0.5 u m);氦气(99.999%)为载气，流速 1.0mL/min ;柱前压 0.17IMPa ;进样 口温度 250°C ；分流进样(分流比15:1);程序升温:初始温度40°C，以5°C /min的速率升至260°C (恒温lOmin)。
[0010]采用上述方法分析五味子炮制品有机酸，结果表明:五味子醋蒸后，4-氧代戊酸在生五味子饮片中其相对含量为0.692%，而在醋五味子饮片中相对含量达到1.653%，醋五味子中4-氧代戊酸相对含量是生五味子中的2.38倍。
[0011]本发明还公开一种利用上述有机酸分析方法的4-氧代戊酸的含量测定方法，该方法包括以下步骤:
[0012](I)对照品溶液的制备:分别精密吸取4-氧代戊酸对照品适量置5mL量瓶中，各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度。
[0013](2)内标溶液的配制精密称取水杨酸甲酯适量至IOOmL量瓶中，用乙醚-氯仿混合液(2:1)溶解并稀释至刻度。
[0014](3)供试品溶液的制备取五味子饮片粉末(60目)0.2g，精密称定，置具塞试管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液，置于恒温振荡器中35°C振荡24h (150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1) 2mL,混旋3min,离心5min(3000r/min)，精密吸取上清液lmL，加入水杨酸甲酯内标溶液lmL，加适量无水硫酸钠，干燥，即得。
[0015](4) GC-MS分析条件质谱条件:EI离子源；电子能量70eV;离子源温度230°C ；四级杆温度150 °C ;检测电压1235V ;溶剂延迟3.2min。色谱条件:HP_5色谱柱(30mX250umX0.5um);氦气(99.999%)为载气，流速 1.0mL/min ;柱前压 0.17IMPa ;进样口温度250°C ;分流进样(分流比15:1);程序升温:初始温度40°C，以5°C /min的速率升至140。。。
[0016](5)含量测定:精密吸取对照品及供试品溶液I U 1，注入气相色谱仪，测定(n=3)，即得。
[0017]本发明还公开了一种五味子质量控制方法，是用上述方法测定五味子中4-氧代戊酸含量，按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量计，结果不少于设定值。生五味子与醋五味子的设定值分别为0.28%,0.60%。本发明对五味子有机酸进行了全面的分析并提出了质量控制方法，该方法提供了气相色谱法测定药物中4-氧代戊酸成分的含量，本发明的质量控制方法具有较强的专属性和良好的重现性。【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1为五味子炮制品有机酸甲酯化GC-MS总离子流色谱图。
[0019]图2为五味子炮制品有机酸部位甲酯化GC-MS总离子流色谱图。
[0020]图3为4-氧代戊酸甲酯质谱图。
[0021]图4为4-氧代戊酸含量测定标准曲线图。
[0022]图5为五味子炮制品4-氧代戊酸含量测定GC-MS总离子流图。
【具体实施方式】
[0023]结合【具体实施方式】，对本发明进一步说明如下:
[0024]实施例1、五味子不同炮制品有机酸的分析比较
[0025]1.1仪器与试药
[0026]1.1.1 仪器
[0027]美国Agilent GC6890-MS型气相色谱-质谱联用仪(配有NIST2005标准谱库)，LXJ-2B多管离心机(上海安亭科学仪器厂)，METTLER AE240电子分析天平(梅特勒托利多仪器有限公司)，THZ-D台式恒温振荡器(太仓市实验设备厂)。
[0028]1.1.2 试剂
[0029]甲醇、浓硫酸、氯仿、乙醚、无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯。
[0030]1.2样品的制备
[0031]1.2.1五味子饮片甲酯化样品的制备
[0032]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各约0.2g，精密称定，置具塞试管中，精密加A 10%的硫酸甲醇1.0mL于恒温振荡器中35°C振荡24h( 150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,离心5min (3000r/min),取上清液,力口适量无水硫酸钠，干燥，即得。
[0033]1.2.2饮片试样空白的制备
[0034]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各约0.2g，精密称定，置具塞试管中，精密加入甲醇1.0mL于恒温振荡器中35°C振荡24h (150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,离心5min(3000r/min),取上清液,加适量无水硫酸钠，干燥，即得。
[0035]1.2.3醋甲酯化试样的制备
[0036]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工艺，常压蒸5h后，加水定容至25mL,精密吸取0.1mL溶液(相当于0.2g药材中加入的辅料醋的量)，置具塞试管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒温振荡器中35°C振荡24h (150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,离心5min (3000r/min),取上清液,加适量无水硫酸钠，干燥，即得。
[0037]1.2.4醋试样空白的制备
[0038]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工艺，常压蒸5h后，加水定容至25mL,精密吸取
0.1mL溶液(相当于0.2g药材中加入的辅料醋的量)，置具塞试管中，精密加入甲醇1.0mL于恒温振荡器中35°C振荡24h (150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,离心5min (3000r/min),取上清液,加适量无水硫酸钠,干燥，即得。
[0039]1.2.5试剂甲酯化空白的制备
[0040]精密吸取10%的硫酸甲醇1.0mL溶液置具塞试管中，于恒温振荡器中35°C振荡24h( 150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1)2mL,混旋3min，离心5min(3000r/min),取上清液,加适量无水硫酸钠,干燥，即得。
[0041]1.2.6试剂空白的制备
[0042]精密吸取甲醇1.0mL置具塞试管中，于恒温振荡器中35°C振荡24h( 150r/min)后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2: l)2mL,混旋3min,离心5min(3000r/min)，取上清液，加适量无水硫酸钠，干燥，即得。
[0043]1.3GC-M S 分析条件
[0044]质谱条件:EI离子源；电子能量70eV ;离子源温度230°C ;四级杆温度150°C ;检测电压1235V ;溶剂延迟3.2min。
[0045]色谱条件:HP-5色谱柱(30mX250iim，0.5iim);氦气(99.999%)为载气，流速
1.0mL/min ;柱前压0.17IMPa ;进样口温度250°C ;分流进样(分流比15:1);程序升温:初始温度40°C，以5°C /min的速率升至260°C (恒温IOmin)。
[0046]将各供试品溶液1.0 ii L按1.3项下条件进行GC-MS分析。
[0047]1.4 结果
[0048]在实验过程中，对甲酯化反应条件进行了优选:分别比较了甲酯化试剂10%硫酸甲醇溶液和苯-10%硫酸甲醇溶液(1: 1)，硫酸浓度8%硫酸-甲醇、10%硫酸-甲醇、12%硫酸-甲醇，甲酯化试剂的用量lmL、2mL、3mL，甲酯化时间12小时、24小时、36小时，根据GC分析结果，以出峰的个数与丰度为指标，确定10%硫酸-甲醇ImL振荡24小时甲酯化基本完全；对萃取溶剂苯和氯仿-乙醚进行比较，发现以苯为提取溶剂的色谱图，溶剂出峰时间晚，为了避免对有机酸成分的干扰，选用氯仿-乙醚(2:1)作为萃取溶剂；为促进甲酯化液分液，在其中加入了饱和氯化钠溶液，并对其的用量比例进行了为1、1.5mL、2mL考察，确定2mL饱和氯化钠符合酸度要求。
[0049]将五味子炮制品有机酸甲酯化物及空白样品用气质联用仪进行分离、鉴定，经与NIST2005标准谱库对比检索，结果从生、醋五味子饮片中检出69、70种成分，分别占其总量的93.360%、92.226%。具体结果见表I及图1。
[0050]从表I检出的结果可以看出，生五味子与醋五味子的有机酸在化学成分组成有一定的相似性。同时，两者在化学成分的种类及成分组成的相对比例上均有一定的差别。
[0051]有些成分在五味子醋蒸后已无法检测到，即生五味子饮片中有，而对应的醋品中未检测到，如9.478min的丙二酸二甲酯(生五味子中的百分含量为0.033%)。
[0052]但同时在醋蒸后，有一些新的化合物的被检测到，如4.522min的2-羟基丙酸甲酯为醋的特征峰，醋五味子及辅料醋中均检出此物，而在对应的生品中均无此物。22.807min的a -羟基苯丙酸甲酯(醋五味子中的百分含量为0.041%), 32.89min的未知物(醋五味子中的百分含量为0.029%), 39.148min的未知物(醋五味子中的百分含量为0.076%)，以上物质在生五味子中均未检测到，因此说明此物质可能是醋蒸加热过程所产生。
[0053]但较多的是成分在醋蒸后含量上产生了变化差别。醋蒸后，有的含量增高，如10.184min的2，2-二甲氧基丙酸甲酯(生药0.016%，醋药0.084%，);11.46min4_氧代戊酸甲酯(生药0.692%，醋药1.653%)； 14.409min的未知物(生药峰量小未积分，醋药0.021%,)；16.631min的未知物(生药1.67%，醋药3.284%) ；19.646min的未知物(生药0.213，醋药0.323%) ；21.536min 的未知物(生药 0.006%,醋药 0.019%) ；21.598min 的未知物(生药0.016%，醋药 0.024%)；29.71min 的未知物(生药 0.031%，醋药 0.043%)；31.163min 的 12-甲基十三酸甲酯(生药0.068%，醋药0.105%) ;33.063的未知物(生药0.199%，醋药0.516%);33.316min的十五酸甲酯(生药0.067%，醋药0.11%) ；33.473的未知物(生药0.013%，醋药0.031%) ；37.371min的十七酸甲酯(生药0.021%,醋药0.038%) ；39.711min的未知物(生药0.366%，醋药0.533%)。也有醋蒸后含量降低的，主要是一些非酸的化合物及未知化合物，且这些化合物的相对含量均小于0.2%，如22.431min的未知物、24.372min的1-丙烯-1，2，3-三羧酸三甲酯、25.732min 的 I, 2，3，4，4a, 5，6，8a_八氢_4a，8-二甲基-2-( 1-甲乙基)-萘；25.87min的2-十三烷酮；26.461min的1-甲基-4- (1，2，2-三甲基环戊基)苯；26.812min 的 1，6_ 二甲基-4- (1-甲基乙基)_1，2，3，4-四氢萘、27.326min 的 a -白菖考烯、29.187min 的 I, 2, 4a, 5，8，8a_ 六氢-4，7-二甲基-1-(1-甲乙基)-萘；29.483min的香橙烯；29.925min的1A, 2，3,4, 4A, 5,6, 7B-八氢化_1，1,4, 7-四甲基-1H-环丙烯并奥；30.096min 的 2,6,6,9-四甲基-三环[5.4.0.0 (2, 8)] ^^一 _9_ 烯；30.251min 的未知物；30.427min 的 6- 二甲基-4- (1-甲基乙基)萘；30.669 的 2,4a, 5，6，9a_ 六氢-3,5,5,9-四甲基(IH)苯并环庚烯；30.872min的1，5，5，9-四甲基-1，8-二烯-螺[55] 十一烷；32.171min的未知物；32.514min的未知物；33.563的未知物；33.96的未知物；36.907min的未知物；39.064的未知物。
[0054]从五味子样品甲酯化后GC-MS总离子流图可见，五味子醋蒸后，4-氧代戊酸在生五味子饮片中其相对含量为0.692%，而在醋五味子饮片中相对含量达到1.653%，醋五味子有机酸相对含量是生五味子有机酸相对含量有2.38倍，提示其可能与醋蒸后五味子的药效作用相对应。
[0055]表1五味子不同炮制品有机酸GC-MS分析结果
[0056]
【权利要求】
1.一种五味子有机酸分析方法，其特征在于包括以下步骤: (1)样品制备方法:取五味子粉末约0.2g，精密称定，置具塞试管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒温振荡器中35°C振荡24h后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,离心5min,取上清液,加适量无水硫酸钠，干燥，即得； (2)GC-M S分析条件:质谱条件:EI离子源；电子能量70eV ;离子源温度230°C ;四级杆温度150°C ;检测电压1235V ;溶剂延迟3.2min ;色谱条件:HP_5色谱柱；氦气为载气，流速1.0mL/min ;柱前压0.17IMPa ;进样口温度250°C ;分流进样；程序升温:初始温度40°C，以5°C /min的速率升至260°C，再保持lOmin。
2.一种测定4-氧代戊酸含量的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)对照品溶液的制备分别精密吸取4-氧代戊酸对照品适量置5mL量瓶中，各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度； (2)内标溶液的配制精密称取水杨酸甲酯适量至IOOmL量瓶中，用乙醚-氯仿混合液溶解并稀释至刻度； (3)供试品溶液的制备取五味子粉末0.2g，精密称定，置具塞试管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液，置于恒温振荡器中35°C振荡24h后，精密加入饱和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,离心5min,精密吸取上清液ImL,加入水杨酸甲酯内标溶液lmL，加适量无水硫酸钠，干燥，即得； (4)GC-MS分析条件 质谱条件:EI离子源；电子能量70eV ;离子源温度230°C ;四级杆温度150°C;检测电压1235V ;溶剂延迟3.2min。色谱条件:HP_5色谱柱；氦气为载气，流速1.0mL/min ;柱前压0.17IMPa ;进样口温度250°C ;分流进样；程序升温:初始温度40°C，以50C /min的速率升至140°C ； (5)含量测定精密吸取对照品及供试品溶液IU 1，注入气相色谱仪，测定，即得。
3.—种五味子质量控制方法，其特征在于，用权利要求2的方法测定五味子中4-氧代戊酸含量，按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量计，结果不少于设定值。
4.根据权利要求3所述4-氧代戊酸的含量测定方法，其特征在于按照五味子炮制品干燥品中4-氧代戊酸含量计，生五味子与醋五味子的设定值分别为0.28%, 0.60%。
【文档编号】G01N30/02GK103604890SQ201310654107
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】殷放宙, 殷武, 李林, 陆兔林, 蔡宝昌, 李伟东 申请人:南京中医药大学