专利名称：过滤截留法检测中药注射剂微量蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药注射剂杂质检测领域，用于中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。
背景技术：
中药注射剂最早产生在上世纪四十年代，由钱信忠等学者开创。在中国，中药注射剂已经广泛应用于临床并得到了业界的认可。2010年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的有效性问题(尽管作用机制尚不完全清除)，而安全性问题依然是业界难题。然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个系统和脏器，甚至导致死亡。很多中药注射剂的不良反应与原有的药理作用无关，根据多方面分析，这些不良反应主要属于超敏反应，即病理性免疫反应，包括I、II、III和IV型病理性免疫反应。病理性免疫反应仍是免疫反应，必须有抗原的参与，其抗原可以是半抗原或完全抗原。半抗原多属于小分子成分，完全抗原多为大分子成分，以蛋白质最为多见，且蛋白质型的抗原性最强，引发的超敏反应较为严重。因此减少中药注射剂中的抗原性成分是提高中药注射剂安全性的关键策略之一。中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。尽管植物中的蛋白质含量较低，通过有机溶剂提取的量较少，但微量的蛋白质仍足以导致诱发过敏反应。与人相比，植物蛋白质与人的同源性差异大，因此常常具有很强的抗原性。现行《中国药典》(2010年版)控制中药注射剂蛋白质含量的方法仍沿用了以前的磺基水杨酸自然沉淀法，控制的蛋白质限量约为37 IlOyg/ ml左右，如果中药注射剂低于此限量，所含的蛋白质药典方法很难检出。因此，蛋白质含量低于37yg/ml的中药注射剂将被视为“合格”。而且中药注射剂中的酸性成分会干扰磺基水杨酸法检测蛋白质的结果，这导致磺基水杨酸法应用范围受限。而其他未被药典采用的蛋白质检测方法如，凯氏(Kjeldahl)定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、直接考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等，却因为中药注射剂其他成分或本身颜色带来严重干扰，要么特异性较差，要么灵敏度较差，不适合用于中药注射剂的蛋白质限量检测。 蛋白质类杂质属于一类杂质，包含了不同性质或分子量的蛋白质，因此也很难用HPLC和/ 或质谱等仪器分析方法进行检测。中药注射剂中存在的微量蛋白质成分带来了安全性问题，从严控制中药注射剂中的蛋白质杂质，有利于提高中药注射剂的安全性。因此建立特异性高并且灵敏的中药注射剂蛋白质检测方法很有必要。由于中药注射剂都有较深的颜色，成分多样，而且蛋白质是一类物质，因此很难用
3目前单一方法同时提高检测的灵敏性和特异性。因此本发明是针对中药注射剂的特点而建立的，对蛋白质检测具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。我们以前申请了两项专利(申请号分别为201010199693. 3和201010504574. 4)，
发明了两种检测中药注射剂微量蛋白质的方法，检测的灵敏度分别约为12yg/ml和 0. 5μ g/ml，灵敏度分别是2010年版《中国药典》方法的3倍和30倍左右。在本专利中，我们参照专利前两项专利的原理将方法再次进行改进，将检测灵敏度进一步提高。
发明内容
本发明利用某些膜能将蛋白质特异性高强度吸附的特点以及考马斯亮蓝对蛋白质特异性显色的特点建立本方法，以提高中药注射剂微量蛋白质检测的灵敏性和特异性。 本方法包括以下步骤1、蛋白质吸附膜安装在滤器上；2、将中药注射剂溶液通过蛋白质吸附膜；3、用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜；4、将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝显色。在以上步骤1中，吸附蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜 (Polyvinylidene fluoride,聚偏二氟乙烯膜)。在以上步骤2中，中药注射剂溶液的体积根据需要确定。在以上步骤3中，洗涤蛋白质吸附膜的有机溶液浓度为0-100%，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除中药注射剂本色为度。步骤4进行考马斯亮蓝显色时，考马斯亮蓝的浓度不限。可以直接染色；也可以染色后进行脱色处理，以降低膜的背景。含有一定蛋白质浓度的中药注射剂会显示出稳定的
' τπ. ο本方法实施的效果是，检测的灵敏性和特异性高，抗干扰能力强。本发明方法的推荐条件是蛋白质吸附膜采用PVDF膜，安装蛋白质吸附膜的滤器孔径为2mm，滤过中药注射液的体积为0. 5-5ml，洗涤蛋白质吸附膜的有机溶液为甲醇，考马斯亮蓝染色采用0. 25%考马斯亮蓝染色液，染色时间为5分钟，采用甲醇一水一冰醋酸混合液为脱色液，比例为4. 5 4.5 1，脱色3次，每次10分钟。
图1为采用PVDF膜建立蛋白质检测方法，确定本发明检测限的染色结果图A为 PVDF膜片安装在滤孔直径为2mm的过滤装置上，滤过不同浓度的标准蛋白质BSA (牛血清白蛋白)0. 5ml，经甲醇洗涤和考马斯亮蓝染色后的斑点图；B为PVDF膜片滤孔直径为2mm，滤过不同浓度的标准蛋白质BSA 5ml，经甲醇洗涤和考马斯亮蓝染色后的斑点图；点1-10的 BSA 浓度分别为 100，000,33, 333,11, 111、3，704,1, 235、412、137、46、15、5ng/ml，点 ρ 的蛋白质含量为零。图2为采用硝酸纤维素膜(NC膜)建立蛋白质检测方法，确定本发明检测限的染色结果图Α为NC膜片安装在滤孔直径为2mm的过滤装置上，滤过不同浓度的标准蛋白质BSA 0. 5ml，经甲醇洗涤和考马斯亮蓝染色后的斑点图；点1_7的BSA浓度分别为100，000、 33，333,11, 111、3，704,1, 235、412、137ng/ml，点 ρ 的蛋白质含量为零。图3为本发明检测80%乙醇提取物中的蛋白质含量结果图用75%乙醇提取 BSA,经高速(15，OOOg)离心后5分钟后取0. 5ml上清，经孔径为2mm的过滤装置将提取液通过PVDF膜，然后经乙腈洗涤后行考马斯亮蓝染色。图4为本发明检测四种中药注射剂微量蛋白质的结果图A为PVDF膜片安装在滤孔直径为2mm的过滤装置上，滤过不同中药注射液0. 5ml，经甲醇洗涤和考马斯亮蓝染色后的斑点图；B为PVDF膜片滤孔直径为2mm，滤过不同中药注射液5ml，经甲醇洗涤和考马斯亮蓝染色后的斑点图；Q为清开灵注射液，D为丹参注射液，S为双黄连注射液，Dz为灯盏细辛注射液，P为空白对照。
具体实施例方式实施示例1用PVDF膜建立过滤截留法蛋白质检测方法，确定检测限取11支15ml试管编号1-10和p，用醋酸盐缓冲液(醋酸钠，4. Sg ；冰醋酸，2. 3ml ； 加三蒸水到200ml, pH 4. 5)将配制出浓度为100，000ng/ml的BSA溶液15ml于1号管中， 在2-10号管中各加入IOml醋酸盐缓冲液，从1号管中取5ml溶液至2号管中混勻，再从2 号管中取5ml溶液至3号管中混勻，依此类推至第10号管，即得到浓度梯度为3倍的一组标准溶液，BSA的浓度从1号管到10号管依次为100,000,33, 333、11，111,3, 704、1，235、 412、137、46、15、5ng/ml，p号管为不含BSA的空白对照。将PVDF膜做好标记安装在滤过孔径为2mm的滤器上，滤器连接真空泵。先用甲醇 0. Iml湿润过滤孔和PVDF膜，然后将标准蛋白质溶液加到滤器上，启动真空泵，标准蛋白质液从滤孔穿过PVDF膜。滤液滤完后，变换PVDF膜的位置重新安装在滤器上，再次用甲醇湿润并滤过下一个标准蛋白质样品。预期的样品都从PVDF膜上滤过后，把此膜浸泡在甲醇溶液中洗涤3次，每次10分钟。之后用0. 25%考马斯亮蓝染色液染色5分钟，在转移脱色摇床上用脱色液甲醇一7K—冰醋酸5 4.5 DlOml洗脱3次，每次5分钟，脱去背景色， 将膜拍照，观察斑点颜色强弱。结果如图1所示。从图1可见，当过滤体积为0. 5ml时，不含蛋白质的醋酸缓冲液通过PVDF膜后，考马斯亮蓝染色几乎无色，但过滤体积增加到5ml时，此点的染色稍有加深。而含有蛋白质的醋酸缓冲液的滤过斑点都比空白斑点(点P)深。当过滤体积为0. 5ml时，本法的蛋白质检测限量在(图A点7) 137ng/ml以下；当过滤体积增加到5ml时，本法的检测限量可以达到 5_15ng/ml。实施示例2用NC膜建立过滤截留法蛋白质检测方法，确定检测限取8支1. 5ml试管编号1_8和p，用醋酸盐缓冲液(醋酸钠，4. Sg ；冰醋酸，2. 3ml ； 加三蒸水到200ml, pH 4. 5)将配制出浓度为100000ng/ml的BSA溶液1. 5ml于1号管中， 在2-10号管中各加入Iml醋酸盐缓冲液，从1号管中取0. 5ml溶液至2号管中混勻，再从2 号管中取0. 5ml溶液至3号管中混勻，依此类推至第10号管，即得到浓度梯度为3倍的一组标准溶液，BSA的浓度从1号管到7号管依次为100，000,33, 333、11，111,3, 704、1，235、412、137ng/ml，p号管为不含BSA的空白对照。将NC膜做好标记安装在滤过孔径为2mm的滤器上，滤器连接真空泵。先用甲醇 0. Iml湿润过滤孔和NC膜，然后将标准蛋白质溶液加到滤器上，启动真空泵，标准蛋白质液从滤孔穿过NC膜。滤液滤完后，变换NC膜的位置重新安装在滤器上，再次用甲醇湿润并滤过下一个标准蛋白质样品。预期的样品都从NC膜上滤过后，把此膜浸泡在甲醇溶液中洗涤 3次，每次10分钟。之后用0. 25%考马斯亮蓝染色液染色5分钟，在转移脱色摇床上用脱色液甲醇一水一冰醋酸5 4. 5 1) IOml洗脱3次，每次5分钟，脱去背景色，将膜拍照，观察斑点颜色强弱。结果如图1所示。从图2可见，当过滤体积为0. 5ml时，不含蛋白质的醋酸缓冲液通过NC膜后，考马斯亮蓝染色几乎无色。当过滤体积为0.5ml时，本法的蛋白质检测限量约在(图A点 6)412ng/ml。相比采用PVDF膜，NC膜的检测效果较劣。实施示例3本发明直接检测80%乙醇提取物中的蛋白质中药注射剂的生产原料常采用“水煮醇沉”生产，沉淀用的乙醇浓度多为80%，现采用本法检测80%乙醇对蛋白质的溶解情况。取1支1. 5ml试管。称取18mg BSA至于其中，加Iml 80%乙醇充分振摇。之后经 15，OOOg离心5分钟，取上清液0. 5ml。将PVDF膜做好标记安装在滤过孔径为2mm的滤器上，滤器连接真空泵。先用甲醇 0. Iml湿润过滤孔和PVDF膜，然后将上清液0. 5ml加到滤器上，启动真空泵，上清液从滤孔穿过PVDF膜。把此膜浸泡在乙腈溶液中洗涤3次，每次10分钟。之后用0.25%考马斯亮蓝染色液染色5分钟，在转移脱色摇床上用脱色液甲醇一7K—冰醋酸5 4.5 1) IOml 洗脱3次，每次5分钟，脱去背景色，将膜拍照，观察斑点颜色强弱。结果如图3所示。由图3可见，滤过斑点颜色较深，对比图1，推测80%乙醇提取液中的蛋白质含量高达 11-33μ g/ml。实施示例4中药注射剂成品微量蛋白质检测从市场上买来清开灵注射液、双黄连注射液、丹参注射液和灯盏细辛注射液作为检测样品。将PVDF膜做好标记安装在滤过孔径为2mm的滤器上，滤器连接真空泵。先用甲醇0. Iml湿润过滤孔和PVDF膜，然后将中药注射剂加到滤器上，启动真空泵，中药注射液从滤孔穿过PVDF膜。滤液滤完后，变换PVDF膜的位置重新安装在滤器上，再次用甲醇湿润并滤过下一个中药注射剂样品。样品都从PVDF膜上滤过后，把此膜浸泡在甲醇溶液中洗涤3 次，每次10分钟。之后用0. 25%考马斯亮蓝染色液染色5分钟，在转移脱色摇床上用脱色液甲醇一水一冰醋酸； 4.5 DlOml洗脱3次，每次5分钟，脱去背景色，将膜拍照， 观察斑点颜色强弱。结果如图4所示。从图4可见，不管滤过体积为0. 5ml (图4A)还是滤过体积为5ml (图4B)，均能检测到清开灵注射液存在较多蛋白质，其次丹参注射液和灯盏细辛注射液也能发现微量蛋白质。在这四种注射中，双黄连注射液蛋白质含量最低。
权利要求
1.一种检测中药注射剂微量蛋白质的方法，其特征在与按以下步骤进行1)先将蛋白质吸附膜上安装在滤器上；2)将中药注射液通过蛋白质吸附膜；3)用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜；4)将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝染色。
2.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征在于用于吸附蛋白质的膜包括但不限于PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)、硝酸纤维素膜(NC膜)。
3.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征在于洗涤去除中药注射剂点样本色所用的有机溶液浓度为0-100%，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙腈，以及它们两种或两种以上任意比例的混合；采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除中药注射剂点样斑点的本色为度。
4.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征是染色所用的考马斯亮蓝浓度不限；既可以对经过步骤2处理后的点样膜直接染色，也可以染色后再进行脱色处理，以进一步降低染色背景；染色后脱色采用的是含量为0-100%的有机溶液，包括但不限于甲醇、乙腈，以及它们两种或两种以上任意比例的混合。
全文摘要
一种能够检测中药注射剂微量蛋白质的检测方法，用于检测中药注射剂的蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。其特征在于按以下步骤进行1)先将蛋白质吸附膜上安装在过滤器上，2)将中药注射液通过蛋白质吸附膜，3)用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜，4)将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝染色。本法检测中药注射剂所含蛋白质的浓度可低于15ng/ml，同时较强的抗干扰能力强，适用于中药注射剂微量蛋白质的检测。
文档编号G01N21/78GK102253036SQ20111004672
公开日2011年11月23日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者却翎, 李奇峰, 林青, 柯瑾, 段为钢, 殷华 申请人:云南中医学院
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
