专利名称：用于纳米孔解链依赖性核酸测序的工具和方法
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背景技术：
纳米孔测序法是作为常规Sanger测序方法的便宜和快速替代技术所开发的一项有前景技术。纳米孔测序方法可以提供胜过常规Sanger测序方法的几个优点；它们允许单分子分析，不是酶依赖性的(例如，对于链延长不需要聚合酶)并且需要明显较少的试剂。最近已经提出许多基于纳米孔的DNA测序方法14并且凸显出两个主要难题15 I)在各个核苷酸(nt)之间区分的能力，例如，该系统必须能够在单分子水平区别4种碱基，和2)这种方法必须能够平行读出。在基于纳米孔的DNA测序方法中，以往难以按比例缩小DNA分析至单分子水平，这主要因构成DNA的4种核苷酸之间相对小的差异所致和因单分子探测时的内在噪声所致。由一些人采用以克服这些问题的手段是相对于产生明显大于背景噪声水平的可度量信号的不同实体而’放大"DNA的各个碱基的每一种，从而增加信噪比。这由一个初始制备步骤实现，所述初始制备步骤将待分析的DNA分子转化成较长和周期性结构化的DNA分子(命名为“设计聚合物)”17’29’3°。目前，存在两种在“检测”或测量DNA各个碱基的基于纳米孔的DNA测序方法中所用的一般方法1)当DNA进入并通过孔时，监测孔导电性的变化，孔导电性的变化可以直接测量，例如，使用静电计；和2)在不同分子信标由必须小到足以排除双链DNA但仍将允许单链DNA进入和移位的纳米孔解链时，对它们进行光学地检测。在第一种方法中，大体积基团与核苷酸的碱基连接以增加当双链DNA经过纳米孔移位时所生成用于检测的电子阻断信号并且使其不同32。在第二种方法中，首先通过将DNA序列中的每种和每个碱基系统地置换为特定顺序的级联寡核苷酸对，将这种DNA转化成扩展的数字化形式29，31 (图I)。存在每种不同碱基(例如，A、T、U、G或C)的寡核苷酸的特定种类。转化的DNA与互补性分子信标杂交以形成双链DNA。存在每种不同碱基(例如，A、T、U、G或C)的分子信标互补性寡核苷酸的不同种类。出于鉴定目的，将这些不同种类的分子信标区别性地标记，例如，用于4个种类分子信标的4种不同荧光团。为检测DNA的序列，随后使用小于2nm的纳米孔以依次地使信标从包含分子信标的双链DNA (dsDNA)中解链。对于每个解链事件，一个新荧光团是未猝灭的，从而产生不同颜色的一系列光子闪光(photon flash)，这些光子闪光由(XD照相机记录(图2)。解链过程以电压依赖性方式将DNA经过孔的移位延缓到与光学记录相容的速率。依赖于标记dsDNA的纳米孔解链的DNA测序的一个限制性因素是纳米孔的孔不得不小到足以撬开双链结构，直径通常小于2nm。目前，存在两种制备纳米孔用于核酸分析的一般方法(I)从天然存在分子制备的有机纳米孔，如α-溶血素孔。虽然有机纳米孔常用于DNA分析，但是有机纳米孔对于单个DNA测序而言是大的并且不易适应于同时需要许多纳米孔的高通量DNA测序。(2)由多项常规和非常规制造技术产生的合成固态纳米孔。合成制造的纳米孔具有用于同时需要许多纳米孔的高通量DNA测序的更大潜力。依赖于标记dsDNA的纳米孔解链的DNA测序的另一个限制性因素是单纳米孔可以一次仅探测单个分子。使用基于纳米孔的测序方法，开发快速、高通量基因组测序将需要纳米孔阵列和同时监测纳米孔。虽然纳米孔的制造可以产生大量合成纳米孔，但是以均一恒定的质量制造具有很小孔的纳米孔是困难的。在基于纳米孔的解链测序方法中允许使用孔径略微较大的纳米孔的替代性策略是合乎需要的。发明概述本发明的实施方案基于以下发现将调节基团与纳米孔解链依赖性核酸测序中使用的部分如分子信标(MB)连接使利用孔比标准双链核酸宽度(约2. 2nm)更大的纳米孔成为可能。对于纳米孔解链依赖性测序，约I. 5-2. Onm的孔径仅允许单链核酸在电场中经过该孔的开口移位。这实质上迫使与纳米孔接触的双链核酸发生链分开，这个过程常叫作“解链”。伴随这种常规方法的问题是，纳米孔尺寸限于小于双链核酸宽度的孔径。大规模制造具有均一孔径的小尺寸纳米孔是困难的。与MB连接的调节基团对MB增加体积并且允许改造常规方法以使用具有较大孔径的纳米孔。双链核酸通过单链核酸和其上各自连接有大体积调节基团的多种MB杂交而形成。MB上大体积调节基团的存在起到以下作用将双链核酸在大体积基团与MB连接的点处的宽度(见图9)增加到比标准双链核酸的宽度更大的宽度。大于2. Onm但小于双链核酸在大体积基团与MB连接的点处的宽度的较大孔可以用来在测序过程中使包含连接大体积基团的MB的双链核酸解链。这类构造的较大孔仍能够仅允许单链核酸在电场中经过该孔的开口移位。这类构造的较大孔通过防止连接有大体积基团的MB在电场中经过该孔的开口移位而实现这一点，因为该孔小于双链核酸在大体积基团与MB连接的点处的宽度(D3，见图9)。这导致双链核酸的链分开，正如链分开将在标准双链核酸和约I. 5-2. Onm纳米孔尺寸的情况下，即，在不存在连接有大体积基团的MB的情况下发生那样。没有在其上连接的大体积调节基团的标准双链核酸将具有大约2. 2nm的宽度。如本文所用并且除非另外说明，否则以下每个术语应当具有下文所述的定义。“纳米孔”例如包括一种结构，所述结构包含(a)由物理屏障分隔的第一区室和第二区室，所述屏障具有直径例如约Inm至IOnm的至少一个孔，和(b)用于跨屏障施加电场的装置，从而带电分子如DNA可以从第一区室经过所述孔进入第二区室。纳米孔理想地进一步包含一种装置，所述装置用于测量通过纳米孔屏障的分子的电子签章(electronicsignature)。在一个实施方案中，纳米孔屏障是合成的，即，由合成材料制成或是合成产生的纳米孔。在一个实施方案中，纳米孔屏障是部分合成存在的。在一个实施方案中，纳米孔屏障是天然的，即，由天然材料制成或是天然存在的屏障。在一个实施方案中，纳米孔屏障是部分天然存在的。屏障可以包括，例如，内有α-溶血素、寡聚蛋白质通道如孔蛋白(porin)和合成肽等的脂质双层。在一个实施方案中，纳米孔屏障也可以包括具有大小合适的一个或多个孔的无机平板。在一些实施方案中，纳米孔屏障包含有机材料和/或无机材料。在一些实施方案中，纳米孔屏障包含有机材料和/或无机材料或者合成材料或天然存在材料的修饰形式。本文中，“纳米孔”和纳米孔屏障中的“孔”互换地使用。如本文所用，术语“包含”意指除了提出的限定要素之外，其他要素也可以存在。“包含”的用途表明包括而非限制。指示如本文所述的文库、方法和及其相应组分时，术语“由……组成”意指排除在实施方案的这个描述中没有提到的任何要素或组分。如本文所用的术语“基本由……组成”指给定实施方案所要求的那些要素。该术语允许不实质影响本发明的这个实施方案的基本和新的或功能特征的要素存在。如本文所用，术语“核酸”应当意指任何核酸分子，包括而不限于DNA、RNA及其杂交分子或类似物。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域熟知的。核酸是由单体核苷酸的链组成的大分子。在一些实施方案中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在其他实施方案中，核酸是人工核酸如肽核酸(PNA)、M0rph0lin0、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TM)。这些核酸的每一种因分子主链的改变与天然存在的DNA或RNA区别。如本文所用，术语“寡核苷酸”是任何长度的核苷酸聚合物形式。通常，核苷酸单元的数目可以是约2至100，并且优选地约2至30或50至80。在一个实施方案中，本文所述的MB的寡核苷酸是4-25个核苷酸长度。在本文所述的MB文库和方法的背景下术语“寡核苷酸”指以特定顺序连接在一起的多个天然存在、非天然存在、通常已知或合成的核苷酸，如二醇核酸(GNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)和磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO/Morpholino) 它们可以具有任意长度，在其3’末端和/或5’末端经修饰或未修饰。在一个实施方案中，“寡核苷酸”指DNA或RNA。如本文所用，在本文所述方法的背景下使用时，术语“包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物”指包含“嵌段序列”的聚合物，其中每个嵌段序列单独或组合地代表核苷酸碱基A、U、T、C或G。在一个实施方案中，术语“代表A、U、T、C或G的定义序列”指包含“嵌段序列”的聚合物，其中每个嵌段序列单独或组合地代表核苷酸碱基A、U、T、C或G。如本文所用，在包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物的背景下使用时，“嵌段序列”指具有特定序列的4-35个核苷酸的短核酸，所述短核酸单独或与另一个嵌段序列组合时代表A、U、T、C或G。例如，ATTTGGAAT是嵌段-O并且TTCCGAGGT是另一个嵌段_1。嵌段01的组合是ATTTGGAAT-TTCCGAGGT(SEQ ID. NO. I)和它代表核苷酸碱基A。在实施本文所述的本发明实施方案时，可以使用与任何部分连接的调节基团。一种示例性部分是分子信标。其他部分包括但不限于DNA、RNA和肽。本文所述的本发明实施方案的应用包括但不限于使用适配子的蛋白质分析或检测。对于蛋白质检测中的应用，纳米孔可以与用于特定蛋白质分析的部分(例如，特定蛋白质部分)组合。然而，出于说明本发明目的，本文所述的部分是MB。这种说明不应当以任何方式解释为这个部分仅限于MB。因此，本文中提供了一种用于纳米孔解链依赖性核酸测序的分子信标(MB)文库，所述文库包含多种MB，其中每种MB包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含(I)可检测标记；(2)可检测标记封阻剂；和(3)调节基团；其中所述MB能够与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交以形成双链(ds)核酸。在一个实施方案中，本文中提供了一种使双链(ds)核酸解链用于纳米孔解链依赖性核酸测序的方法，所述方法包括(a)将本文所述的分子信标(MB)文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因调节基团在MB上的存在而形成，其中所述待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；(b)使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl ;并且(c)施加跨纳米孔的电势以使杂交的MB与待测序的单链核酸解链。由跨纳米孔的电势产生的电场引起双链核酸从纳米孔的一个区室经过纳米孔移位至另一个区室。在移位过程期间，MB在进入纳米孔时从双链核酸剥离，原因是连接有大体积基团的MB太大(即，太宽)，以至于不能随互补杂交的单链核酸一起经过该孔移位。在另一个实施方案中，本文中提供了一种用于测定核酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤(a)将本文所述的分子信标(MB)文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因调节基团在MB上的存在而形成，其中所述待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；(b)使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl ；(c)施加跨纳米孔的电势以使杂交的MB与待测序的单链核酸解链；并且(d)当MB在所述孔处与双链核酸分开时，检测由可检测标记从每种MB发射的信号。由跨纳米孔的电势产生的电场引起双链核酸从纳米孔的一个区室经过纳米孔移位至另一个区室。在移位过程期间，MB在进入纳米孔时从双链核酸剥离，原因是连接有大体积基团的MB太大(即，太宽)，以至于不能随互补杂交的单链核酸一起经过该孔移位。在一个实施方案中，用于测定核酸的核苷酸序列的方法进一步包括将一串检测到的信号解码成正在测序的核酸的核苷酸碱基序列。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含两个亲和臂。在一些实施方案中，MB的寡核苷酸包含5’亲和臂和3’亲和臂。亲和臂是具有互补序列并且在条件有利于杂交时可以杂交的寡核苷酸的部分。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含4-60个核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸是聚合物。在一个实施方案中，这种聚合物包含4-60个核苷酸、核碱基或单体。在一个实施方案中，单体是核苷酸及其类似物，例如，去羟肌苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、恩曲他滨、拉米夫定、扎西他滨、阿巴卡韦、恩替卡韦、司他夫定、替比夫定、齐多夫定、碘苷和曲氟尿苷。在一个实施方案中，一些核苷酸、核碱基或单体可以出于与可检测标记、可检测标记封阻剂、调节基团(例如，硫代-dT (thiol-dT))偶联的目的进行修饰。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含选自脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、二醇核酸(GNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)和磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO/Morpholino)的核酸。在一个实施方案中，寡核苷酸的单体选自脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)和(PMO/Morpholino)。在另一个实施方案中，MB的寡核苷酸是嵌合寡核苷酸，即，包含DNA、RNA、GNA、PNA、LNA、TNA 和 Morpholino 的混合物或组合，例如，(DNA+RNA)、(GNA+RNA)、(LNA+DNA)、(PNA+DNA+RNA)等。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含一对“臂”。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含5’臂和3'臂，优选地5’荧光团臂和3’猝灭剂臂。在这个实施方案中，可检测标记是在5’荧光团臂上存在的荧光团并且可检测标记封阻剂是在MB的3’猝灭剂臂上存在
8的猝灭剂。在一个实施方案中，可检测标记连接在MB的寡核苷酸的一个末端上并且处于在文库中全部MB的寡核苷酸的相同末端上。在一个实施方案中，可检测标记发射当可检测标记不受封阻剂抑制时被检测和/或测量的信号。在一个实施方案中，文库的MB不与固相载体连接。在一个实施方案中，文库的MB游离于溶液中。在一个实施方案中，文库中MB的寡核苷酸上的可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团不干扰MB与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交。在一个实施方案中，光学地检测可检测基团的信号，例如，通过光强度、发射的光的颜色或荧光等。在一个实施方案中，可检测基团是荧光团并且信号是荧光。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂是突光团的粹灭剂。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂还是调节基团。换而言之，MB上的可检测标记封阻剂和调节基团是相同的分子。换而言之，MB上的可检测标记封阻剂也作为调节基团发挥作用。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的调节基团增加因此与其形成的双链核酸在所述调节基团与MB寡核苷酸连接的点处的宽度到大于2. O纳米(nm)，其中通过MB与代表A、U、T、C或G的定义序列杂交形成所述双链核酸(见图9)。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的调节基团增加因此与其形成的双链核酸在所述调节基团与MB寡核苷酸连接的点处的宽度到大于2. 2nm，其中通过MB与代表A、U、T、C或G的定义序列杂交形成所述双链核酸(见图9)。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的调节基团增加因此与其形成的双链核酸的D2到大于2. Onm(见图9)。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的调节基团增加因此与其形成的双链核酸的D2到大于2. 2nm(见图9)。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的调节基团增加因此与其形成的双链核酸的宽度到大于2. Onm。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的调节基团增加因此与其形成的双链核酸的宽度到大于2. 2nm。在一个实施方案中，调节基团连接在MB的寡核苷酸的5’末端或3’末端处。在一个实施方案中，调节基团在距离本文所述文库中MB的寡核苷酸的3’或5’末端的3-7个核苷酸内部连接。在另一个实施方案中，调节基团在距离本文所述文库中MB的寡核苷酸的3’或5’末端的1-7个核苷酸内部连接。在一个实施方案中，双链核酸在调节基团与本文所述文库中MB的寡核苷酸连接的点处的宽度是约3-7nm。在另一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB寡核苷酸连接的点处的宽度是约3-5nm。在一个实施方案中，文库的MB的寡核苷酸上的调节基团选自但不限于纳米级粒子、蛋白质分子、有机金属粒子、金属粒子和半导体粒子。在另一个实施方案中，调节基团大于2nm的任何分子，所述分子不是纳米级粒子、蛋白质分子、有机金属粒子、金属粒子或半导体粒子。在一个实施方案中，调节基团是3_5nm。在一个实施方案中，当核酸经历纳米孔测序并且双链核酸包含本文所述文库的MB时，MB的寡核苷酸上的调节基团促进双链核酸解链。在一个实施方案中，本文所述的文库包含两种或更多种类的MB，其中MB的每个种类具有不同的可检测标记。在一个实施方案中，每个种类的MB互补物与独特核酸序列杂交。在本文所述方法的一个实施方案中，纳米孔尺寸允许待测序的单链核酸通过所述孔，但是不允许包含本文所述文库的MB的双链核酸通过所述孔。在本文所述方法的一个实施方案中，纳米孔尺寸允许单链核酸经所述孔移位，但是不允许包含本文所述文库的MB的双链核酸经所述孔移位。在本文所述方法的一个实施方案中，孔大于2nm。在本文所述方法的另一个实施方案中，孔大于2. 2nm。在一个实施方案中，孔大于2nm但是小于双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)。在一个实施方案中，孔大于2. 2nm但是小于双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)。在本文所述方法的另一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)大于2. 2nm。在本文所述方法的一个实施方案中，Dl (孔的宽度)大于2nm。在另一个实施方案中，Dl大于2. 2nm。在本文所述方法的一个实施方案中，Dl是3_6nm。在本文所述方法的一个实施方案中，D3，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度，大于2nm。在另一个实施方案中，D3大于2. 2nm。在本文所述方法的一个实施方案中，D3是约3_7nm。在本文所述方法的一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)是约3-5nm。在本文所述方法的一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)大于纳米孔的开口宽度(Dl)，因而当双链核酸试图在电场的影响下通过纳米孔的开口时，调节基团封阻双链核酸上的MB寡核苷酸进入所述开口，导致链分开，并且MB的寡核苷酸从双链核酸中解链，同时单链核酸通过所述孔。在本文所述方法的一个实施方案中，杂交的单链核酸和MB之间的结合亲和力小于MB的调节基团和寡核苷酸的结合亲和力，因而当双链核酸试图在电场影响下通过纳米孔的开口时，单链核酸和MB之间的键而不是MB的调节基团和寡核苷酸之间的键破坏。在一个实施方案中，单链核酸和MB之间的键是非共价的氢键。在一个实施方案中，调节基团和MB的寡核苷酸之间的键是共价键。在一个实施方案中，单链核酸和MB之间的键是非共价的氢键，并且调节基团和MB的寡核苷酸之间的键是非共价键如离子相互作用和疏水相互作用。在一个实施方案中，杂交的单链核酸和MB之间的氢键弱于调节基团和MB的寡核苷酸之间的离子相互作用和/或疏水相互作用。在本文所述方法的一个实施方案中，待测序的核酸是DNA或RNA。附图简述图Ia是DNA解链依赖性测序方法学中两个步骤的示意性说明。首先，将靶DNA序列的每种核苷酸以本体生物化学(bulk biochemical conversion)方式转化成具有已知序列的已知寡核苷酸，随后与分子信标杂交。DNA/信标复合物经过纳米孔的线性化允许光学检测靶DNA序列。图Ib是平行读出方案的示意性说明。每个孔在EM-CCD的视域中具有特定位置并且因此使同时读出纳米孔的阵列成为可能。图2a显示环状DNA转化方法(OTC)的3个步骤。5’模板末端核苷酸及其代码是颜色编码的“C” -紫、“A” -灰、“T” -红和“G” -蓝。颜色已经在此变成灰度级。图2b显示在⑶C方法后分析转化的DNA。左小图变性凝胶显示探针与全部4种模板成功连接。泳道A、T、C和G指4种模板的相应5’末端核苷酸，而R是含有长度100-nt和150-nt的两种ssDNA分子的参考泳道。右小图使用序列特异性荧光寡核苷酸，该凝胶显示，全部4种模板的第一个核苷酸均成功被转化并且没有副产物从这个过程中产生。图3a显示在大体积基团解链实验的电学/光学检测中利用亚5nm孔使I比特复合物和2比特复合物解链的代表性事件。电流在每幅小图顶部上的黑色迹线中，而光信号是每幅小图中的下部浅灰色迹线，上部小图显示I比特样品的迹线并且下部小图分别显示2比特样品的迹线。图3b显示柱状图(每份样品，n>600)，所述柱状图表明I比特样品中的大部分复合物(深灰色)产生一个光子爆发，而2比特样品中的大部分复合物(浅灰色)产生两个光子爆发。图3c显示与图3b相似但是转换成(binned)成一个爆发脉冲、两个爆发脉冲和3+爆发脉冲的那些实验的柱状图。图4a显示采用A647 (红色)和A680 (蓝色)荧光团的两个解链实验所获得的累积光子强度。数据的颜色已经在此变成灰度级。在每个通道中观察到一个单一凸出峰，表示如EM-C⑶上成像的孔位置。R值(通道I对通道2中所测量的荧光强度的比率)对于两种突光团而目是O. 2和O. 4。图4b显示伴随A647 (顶部)和A680 (底部)的代表性解链事件的电信号/光信号。图4c显示每份样品的累积上百条迹线针对A647和A680分别产生R=O. 20±0. 06和 O. 40±0· 05。图5a显不使用两种突光团时的光纳米孔核喊基鉴定。使用两个不同的颜色以能够构造与全部4种DNA核碱基对应的2比特样品。数据的颜色已经在此变成灰度级。图5b显示，采用>2000个事件生成的R分布在O. 21 ±0. 05和O. 41 ±0. 06处揭示与对照研究极好符合的两种模式，其分别与A647和A680荧光团对应。图5c显示各个双色2比特解链事件的经强度校正的代表性荧光迹线，在事件上方显示相应的调用的比特、调用的碱基和确定性评分。在使用固定阈R值调用每个比特后，这两个通道中的强度由计算机代码自动地校正。图6a显示多孔检测DNA解链事件的可行性。描述累积光强度的表面曲线清晰地显示如通过EM-CXD成像的一个(左)、两个(中间)和三个(右)纳米孔的位置。图6b说明4条代表性迹线显示在两个不同孔处同时出现的解链。电流迹线(黑色，顶部迹线)不含有关于孔位置的信息，而光迹线(3条下部迹线)允许建立解链事件的位置。
图7是显示DNA模板分子(在5’末端处带有C)转化的变性凝胶图像。该图像显示环化转化产物(泳道E)以及线性化产物(泳道D)。泳道A是转化之前的DNA模板。在凝胶中包括两种参考分子，线性150聚体和环状150聚体，分别是泳道B和C。图8a显示含有ATT0647N染料的两种复合物的发射光谱。顶部曲线是含有杂交ATT0647N信标的分子的归一化测量光谱，而底部曲线是含有杂交ATT0647N信标以及BHQ-2猝灭剂信标的分子的测量光谱。本图中的插图示意性地显示所用的复合物。图8b显示含有ATT0680染料的两种复合物的发射光谱。顶部曲线是含有杂交ATT0680信标的分子的测量光谱，而底部曲线是含有杂交ATT0680信标以及BHQ-2猝灭剂信标的分子的测量光谱。本图中的插图示意性地显示所用的复合物。图9显示带有修饰的分子信标的双链核酸纳米孔解链的示意图，所述修饰的分子信标具有在其上连接的调节基团/大体积基团。
图10显示在溶液中并且不与靶核酸互补性杂交的分子信标的一个实施方案的总体特性。靶核酸是来自待测序核酸的转化的核酸。图11A-11C显示用于将肽与分子信标连接的示例性3个不同的偶联方案。图IlA显示链霉亲和素-生物素连接，其中通过将生物素-dT借助碳-12间隔区导入茎部的猝灭剂臂而修饰分子信标。生物素修饰的肽借助具有4个生物素结合位点的链霉亲和素分子与修饰的分子信标连接。图IlB显示巯基-马来酰亚胺连接，其中通过添加巯基修饰分子信标茎部的猝灭剂臂，所述巯基可以与置于肽的C末端的马来酰亚胺基团反应以形成直接稳定的连接。图IlC显示可切割的二硫键，其中肽通过在C末端添加与巯基修饰的分子信标形成二硫键的半胱氨酸残基被修饰。发明详述除非另外解释，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外说明，本发明是使用本领域已知的标准方法进行，例如，如CurrentProtocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan 等人编著，John Wiley andSons, Inc.)，所述文献均通过引用的方式完整地并入本文。应当理解本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂并且因而它们可以变动。本文所用的术语的目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图限制本发明的范围，本发明仅由权利要求书限定。除了在工作例子中或其中另外说明，表述本文所用的成分或反应条件的量的全部数字应当在全部情况下理解为由术语“约”修饰。与百分数一起使用时，术语“约”可以意指 +1%。单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the) ”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地指出。类似地，除非上下文另外清楚地指出，否则词“或”意指包括“和”。将进一步理解的是，对核酸给予的全部碱基尺寸或氨基酸尺寸和全部分子量或分子质量值是近似值并且出于描述而提供。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本公开的实施或检验，然而现在描述合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁语exempli gratia，并且在本文用来表示非限制性例子。因此，缩写“例如(e.g.)”是与术语
12“例如”同义的。所确定的全部专利和其他出版物明确地通过引用方式并入本文，目的在于描述和公开例如此类出版物中所述的可能与本发明一起使用的方法。这些出版物仅因它们的公开先于本申请的提交日而提供。就这一方面而言任何内容均不得解释为承认发明人由于在先发明或由于其他任何原因而不被给予早于这种公布的权利。就这些文献的日期而言的全部叙述或就这些文献的日期而言的描述基于申请人可获得的信息并且不构成对这些文献的日期或内容正确性的任何承认。本发明的实施方案基于一项示例性说明，S卩，对与纳米孔解链依赖性核酸(如DNA和RNA)测序一起使用的分子信标(MB)的修饰。在纳米孔解链依赖性核酸测序中，双链(ds) DNA的解链是从包含dsDNA的MB中激发信号必需的。从MB中激发的信号的时间顺序与正在测序的核酸的序列对应。用来dsDNA解链的纳米孔的尺寸局限为小于不与任何外部分子连接或偶联的标准dsDNA的宽度，这个宽度是大约2. 2nm。约I. 5但小于2. 2nm的孔径可以在dsDNA试图在电场影响下通过孔时使dsDNA解链，即，DNA的两条链分开，并且一条链通过孔，而包含多个非共价连接的MB的另一条互补链依次地和时间地得到检测并留在后面(见图Ia)。任何大于2. 2nm的孔径将不促进对于从MB中激发信号是必需的解链事件，其中激发的信号与正在测序的核酸的序列对应。任何大于2. 2nm的孔径将只允许dsDNA通过所述孔而无任何链分开。在ds DNA构型中，杂交的MB不激发任何信号。发明人已经通过增加测序期间试图通过纳米孔的dsDNA的宽度、尤其通过将调节基团与MB连接来克服这种孔径局限作用。如图9中示意性显示，调节基团103向MBlll增添体积，从而与未修饰的MB形成的双链核酸的宽度D2113相比时，由单链核酸109与修饰的MBlll形成的双链核酸具有较大的宽度D3115。因此，大于约2. 2nm的孔宽度DllOl可以用于解链事件并且因此用于测序，只要孔宽度DllOl小于MB上连接大体积调节基团的点处的dsDNA的宽度D3115即可。作为概念验证，发明人使MB生物素酰化并且将抗生物素蛋白(4. 0x5. 5x6. Onm)20与生物素酰化的MB连接。他们成功地使用3_6nm的纳米孔使包含抗生物素蛋白-生物素酰化MB的dsDNA解链并且从这些抗生物素蛋白-生物素酰化MB中激发信号(图3a)。另外，发明人还显示，这类修饰可以适用于使包含两个不同种类的MB的dsDNA解链(图3a)，如’2比特’实验中所显示，其中两个种类的MB用不同的荧光团标记，例如，一个种类的MB用发射红色荧光的荧光团标记并且第二种类的MB用发射蓝色荧光的另一种荧光团标记。由于在制造具有约2nm或更小尺寸的纳米孔时，尤其在大量生产制造时，难以获得一致性结果，所公开的修改的一个优点是较大的孔径可以用于依赖dsDNA解链的基于纳米孔的DNA测序。这种修饰转而促进纳米孔阵列的大规模制造，这为多孔检测的简易方法铺平道路。另一个优点是较大的孔径增加dsDNA的捕获率至少10倍并且这也有利于阵列中的多孔检测13。因此，本文中公开了一种用于纳米孔解链依赖性核酸测序的分子信标(MB)文库，所述文库包含多种MB，其中每种MB包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含(I)可检测标记、(2)可检测标记封阻剂；和(3)调节基团；其中所述MB能够与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交以形成双链(ds)核酸。图10中显示一个实施方
13案的常见MB的示意图。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含两个亲和臂。在一个实施方案中，MB寡核苷酸包含5’亲和臂和3’亲和臂。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含5’荧光团臂和3’猝灭剂臂。在一个实施方案中，调节基团是四重体DNA。在一个实施方案中，这种四重体DNA是本文所述的MB的寡核苷酸的部分并且位于其内部。在一个实施方案中，本文中提供了一种使双链(ds)寡核苷酸解链用于纳米孔解链依赖性核酸测序的方法，所述方法包括(a)通过这种方法将本文所述的分子信标(MB)文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因调节基团在MB上的存在而形成，其中所述待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；(b)使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl ;并且(c)施加跨纳米孔的电势以使杂交的MB与待测序的单链核酸解链。在另一个实施方案中，本文中提供了一种用于测定核酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤(a)将本文所述的分子信标(MB)文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因调节基团的存在而形成，其中所述待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；(b)使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl ;并且(c)施加跨纳米孔的电势以使杂交的MB与待测序的单链核酸解链；以及(d)当MB在其出现时与双链核酸分开时，在所述孔处检测由可检测标记从每种MB发射的信号。发射的信号的时间顺序与单链核酸的序列对应。在测定核酸的核苷酸序列的这种方法的一个实施方案中，该方法包括将待测序的核酸转化成由MB的文库杂交的代表性单链核酸。在一个实施方案中，用于测定核酸的核苷酸序列的方法进一步包括将一串检测到的信号的序列解码以推导核酸的实际核苷酸碱基序列。这包括本文所述的文库和方法可以在其中需要任何核酸或寡核苷酸的序列的任何情况(例如，检测突变、DNA指纹分析、单核苷酸多态性和生物全基因组测序)下使用。如本领域通常已知，MB是形成茎-环结构(见图10)并且用来报道溶液中存在特定核酸的寡核苷酸杂交探针。茎-环结构是在本领域中也称作发夹或发夹环。MB也称作分子信标探针。作为示例和不应当解释为限制性，常见MB寡核苷酸探针的一般设计和特征如下(见图10) :MB可以具有多种长度，例如，长约15-35个核苷酸。在其中MB内部存在DNA四重体部分的实施方案中，MB的长度可以较长，例如，长直至60个核苷酸。在一个实施方案中，中间部分形成“环”，包含与特定靶DNA或RNA或寡核苷酸互补的5-25个核苷酸。如在MB的背景下所用，“靶核酸”、“靶DNA”、“靶序列”、“靶RNA”或“靶寡核苷酸”是MB可以基于Watson-Crick型杂交与之互补性杂交即“碱基配对”的核酸。在一个实施方案中，在MB的每个末端存在彼此互补即可以彼此“碱基配对”的至少两个核苷酸。在MB的每个末端或“亲和臂”处的这两个核苷酸复性在一起并且形成MB的“茎”，在MB不与其靶核酸杂交时产生茎-环结构。这种茎-环结构一般在彼此互补的两个末端处在序列上长2-7个核苷酸。在一个实施方案中，染料或可检测标记连接至常叫作5’荧光团的MB的5’末端/臂，所述5’末端/臂在互补靶存在时发荧光。在一个实施方案中，猝灭剂染料或可检测标记封阻剂共价地连接于常叫作3’猝灭剂的MB的3’末端/臂。当信标处于闭合环形状时，猝灭剂阻止荧光团发射光线。通常，MB形式带有起初猝灭的荧光团的茎-环型分子，所述荧光团的荧光在这些分子与靶核酸序列结合时恢复。以下是MB的例子荧光团在5’末端处；5’-GCGAGCTAGGAAACACCAAAGATGATAITTGCTCGC-3’-DABCYL(SEQ ID NO:2)。DABCYL(非荧光发色团)可以充当MB中用于任何荧光团的通用猝灭剂。在另一个实施方案中，MB没有茎-环结构。在MB的每个末端不存在彼此互补的核苷酸，因而无茎-环结构形成。在一个实施方案中，文库的MB不形成茎-环结构。在一个实施方案中，MB是带有可检测标记的寡核苷酸。在又一个实施方案中，MB是带有可检测标记和可检测标记封阻剂的寡核苷酸。在一个实施方案中，MB在它们在溶液中在合适的温度和离子强度条件(例如，低于茎-环结构的Tm)下游离时不发荧光。当MB与互补于MB探针或环区域的核酸杂交时，MB经历使其能够发射明亮荧光的构象变化。在不存在互补核酸的情况下，探针是晦暗的，因为茎将荧光团如此靠近荧光猝灭剂安置，从而荧光团和猝灭剂临时共享电子，这消除荧光团发射荧光的能力。当探针遭遇合适的互补核酸分子时，它形成比茎合体更长和更稳定的探针-靶杂种。探针-靶杂种的刚度和长度是共同存在茎杂种的前提。因此，MB经历自发构象重组织，所述自发构象重组织迫使茎杂种解离并且迫使荧光团和猝灭剂彼此远离的，从而允许荧光团在受合适的光源激发时发射荧光。在一个实施方案中，MB的整个寡核苷酸与靶核酸互补。对于解链DNA纳米孔方法，靶核酸将是代表A、U、T、C或G的特异性核酸序列或聚合物。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸的3’和5’亲和臂在不存在靶核酸的情况下彼此互补。在靶核酸存在下，MB的寡核苷酸的3’和5’亲和臂与靶核酸互补。本文所述文库的MB的靶核酸是代表A、U、T、C或G的核酸序列或聚合物。在不存在靶核酸序列的情况下，MB的3’和5’亲和臂复性并且形成MB茎-环结构的茎部。在一些实施方案中，MB的整个寡核苷酸是具有4至60个核苷酸的序列。在其它实施方案中，MB的整个寡核苷酸是具有8至32个核苷酸的序列。例如，MB的文库可以是这样的，因此全部MB均是8个核苷酸长度。在其他情况下，MB的文库可以是这样的，因此全部MB均是16个核苷酸长度、32个核苷酸长度、45或60个核苷酸长度。在一个实施方案中，MB的文库包含至少两个种类的MB，其中所述两个种类具有MB的不同寡核苷酸长度。例如，对于仅具有两个种类的文库，一个种类可以是8个核苷酸长度并且另一个种类可以是16核苷酸长度。在某些实施方案中，“环”区域互补地与靶核酸(例如，代表A、U、T、C或G的核酸序列或聚合物)杂交。在某些实施方案中，“环”区域互补地与具有靶核酸上4至32个核苷酸的序列杂交。在某些实施方案中，MB的茎的亲和臂也互补地与具有4至25个核苷酸的靶序列杂父。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含四重体部分。G-四重体是从围绕形成氢键的鸟嘌呤碱基的四分体建立的富G序列中形成的高级DNA和RNA结构物。这类四重体序列是本领域熟知的，例如，如由 Burge, S.等人，Nucleic Acids Research, 2006，34:5402-5415 ;Borman,S.，Chemical and Engineering News,2007，85:12 — 17 ；Hammond-Kosack和 Κ·Docherty，FEBs Letters，1992，301:79-82 ;和 Chen CY 等人，Sex Transm.Infect.，2008，84:273-6描述。这些参考文献通过引用的方式完整地并入本文。因此，本领域技术人员可以设计四重体并且将其并入MB文库中。在一个实施方案中，四重体部分没有互补地与代表A、U、T、C或G的靶核酸序列或聚合物杂交。在一个实施方案中，四重体部分充当大体积调节基团。在一个实施方案中，MB的四重体部分存在于MB的寡核苷酸的3’或5’末端处。在一个实施方案中，MB的四重体部分以2-7个核苷酸相距MB寡核苷酸的3’或5’末端存在。在另一个实施方案中，MB的四重体部分以1-7个核苷酸相距MB的寡核苷酸的3’或5’末端存在。提到寡核苷酸能够序列特异性与序列互补杂交或互补时，这意指这个寡核苷酸通过氢键与该序列形成规范的Watson和Crick核苷酸碱基配对，其中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，如DNA中鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对那样。在RNA中，胸腺嘧啶由尿嘧啶⑶替换。在用于纳米孔解链依赖性测序的某些实施方案中，将待测序的核酸首先转化成代表性序列。代表性序列的功能在于将待测序核酸中的每个单碱基放大成较大的序列。较大的代表性序列由序列块(也称作代码或嵌段序列)组成，所述的序列块对于每种碱基A、T、C、G和U而言是限定的、独特的和固定的。例如，“A”在待测序的核酸中由扩展的10聚体嵌段序列ATTTATTAGG (SEQ ID NO. 3)代表，” T”由扩展的10聚体嵌段序列CGGGCGGCAA (SEQID NO. 4)代表，“C”由扩展的10聚体嵌段序列CCTTTCCTTA(SEQ ID NO. 5)代表，并且“G”由扩展的10聚体嵌段序列AGCGCCGAAC(SEQ ID NO. 6)代表。因此，具有“TGGCA”序列的核酸将转化成包含5个10聚体嵌段序列的代表性序列CGGGCGGCAA-AGCGCCGAAC-AGCGCCGAAC-CCTTTCCTTA-ATTTATTAGG(SEQ ID NO. 7)。由于碱基 A、T、C、G 在这个例子中由 4 个独特10聚体嵌段序列代表，因此这是序列转化的独特或单个代码系统。当一个碱基由一对嵌段序列代表时，它是二进制编码的顺序转换系统。例如，这种二进制代码是两个独特的 10 聚体嵌段序列ATTTATTAGG(SEQ ID NO. 3)和 CGGGCGGCAA (SEQ ID NO. 4)，并且可以将它们分别称作代码“O”和“I”。每个碱基由一对嵌段序列代表，例如，“A”由“0，I”或ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA (SEQ ID NO. 8)代表，“T”由“0，O”或 ATTTATTAGG-ATTTATTAGG (SEQID NO. 9)代表，“C”由“1，O”或 CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG(SEQ ID NO. 10)代表，“G”由“1，I”或CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA(SEQ ID NO. 11)代表。成对嵌段序列或代码的依次排列是重要的，这意味“0，I”与“1，O”不相同，因为在以上例子中“0，I”代表A而“ 1，O”代表“C”。因此，当使用本文所述的二进制代码系统时，具有“GATGGCA”序列的核酸将转化成二进制代码(II)-(01)-(00)-(11)-(11)-(10)-(01)或代表性序列(CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA)-(ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA)-(ATTTATTAGG-ATTTATTAGG)-(CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA)-(CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA) - (CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG) - (ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA) (SEQ ID NO. 12)。对待测序核酸的转化和用于转化的代码系统的详细描述可以在Soni和MelIer (2007) 29、MelIer等人，2009(美国专利申请公开2009/0029477)以及Meller和Weng(PCT申请No. PCT US2009/034296)中找到。这些参考文献通过引用的方式完整地并入本文。在一个实施方案中，代表单链核酸中的A、U、T、C或G核苷酸的定义序列包含嵌段序列，其中所述嵌段序列代表单链核酸中的A、U、T、C或G核苷酸。在一个实施方案中,MB的寡核苷酸与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列的嵌段序列互补。在一个实施方案中，文库包含几个种类的MB，其中对于代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的每个嵌段序列，存在至少一个种类的MB。每种类具有与文库中其他种类不同的可检测标记。例如,如果文库中存在4个种类的MB，则存在4种不同的可检测标记，例如，用作可检测标记的红色、绿色、蓝色和黄色荧光团。每个种类也具有与文库中其他种类MB不同的寡核苷酸序列。例如，如果文库中存在4个种类的MB，则存在4种不同的寡核苷酸序列，例如，在文库的 MB 中的 ATTTATTAGG (SEQ ID NO. 3)、CGGGCGGCAA (SEQ IDN0. 4)、CCTTTCCTTA(SEQ ID NO. 5)和 AGCGCCGAAC(SEQ ID NO. 6)。在其中使用序列转化的独特或单一代码系统的实施方案中，文库包含至少4个种类的MB。在一个实施方案中，文库包含至少2个种类的MB以及高达4个种类的MB，其中每个种类具有不同的荧光团和不同的序列。在一个实施方案中，文库包含至少2个种类的MB以及高达6个种类的MB，其中每个种类具有不同的荧光团和不同的序列。在一个实施方案中，文库包含高达8个种类的MB，其中每个种类具有不同的荧光团和不同的序列。在一个实施方案中，文库包含4个种类的MB，例如，其中每个类型具有不同荧光团和不同序列的4种不同类型的MB。在其中使用序列转化的二进制代码系统的实施方案中，文库包含至少两个种类的MB，例如，两个不同类型的MB，其中一个类型MB具有荧光团和代码“O”的独特序列和另一个类型具有不同的荧光团和代码“I”的独特序列。在一个实施方案中，文库包含两个种类的MB。每个种类的MB具有其自身的可以与其特异性嵌段序列互补杂交的独特寡核苷酸序列。在一个实施方案中，每个种类的MB具有不同的可检测标记。在一个实施方案中，每个种类的MB具有相同的可检测标记封阻剂。在另一个实施方案中，每个种类的MB具有相同的调节基团。在一个实施方案中，本文所述的文库包含在MB上的至少两种不同的可检测标记，其中仅一种可检测标记位于每个MB上。在一个实施方案中，本文所述的文库包含在MB上的两种不同的可检测标记，其中仅一种可检测标记位于每个MB上。在一个实施方案中，本文所述的文库包含在MB上的四种不同的可检测标记，其中仅一种可检测标记位于每个MB上。例如，在本文所述的二进制代码系统中，文库将具有两个种类的MB，一个第一种类的MB具有可以与具有序列ATTTATTAGG (SEQ ID NO. 3)的代码“O”互补的序列并且文库的一个第二种类的MB具有可以与具有序列CGGGCGGCAA (SEQ ID NO. 4)的代码“I”互补的序列。在一个实施方案中，存在两种或更多种类的MB，其中MB的每个种类具有不同的可检测标记。例如，文库包含两个种类的MB，一个第一个种类的MB具有ATT0647N荧光团作为可检测基团并且文库的第二种类的MB具有ATT0488荧光团作为可检测基团(见实施例部分)。ATT0647N-MB和ATT0488-MB均具有相同的可检测标记封阻剂，猝灭剂BHQ-2。此外，ATT0647N-MB和ATT0488-MB均具有相同的调节基团，抗生物素蛋白-生物素。在纳米孔解链依赖性测序中，多个MB以串联排列方式结合到形成双链聚合物的序列上。例如，使用本文所述的二进制代码系统，具有二进制代码(11)-(01)-(00)-(11)-(1
1)-(10)-(01)或代表性序列(CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA) - (ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA) - (ATTTATTAGG-ATTTATTAGG)_ (CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA)_(CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA)_(CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG) - (ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA) (SEQ ID. NO. 12)的序列将具有 14 个以串联排列方式与所述序列互补性杂交以形成双链聚合物的MB。MB串联排列是这样的，从而前一个MB的3’猝灭剂被后续MB的5’荧光团的荧光猝灭(见图I)。在Soni和Mel Ier (2007)29中和在美国专利申请公开号2009/0029477中描述了使用MB的纳米孔解链依赖性测序的详述公开，所述文献均通过引用的方式完整地并入本文。在一个实施方案中，MB是寡核苷酸，如DNA和RNA。在一个实施方案中，寡核苷酸 是单链寡核苷酸。在另一个实施方案中，MB是寡核苷酸，如二醇核酸(GNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)和Morpholino。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含选自但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TM)和磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO/Morpholino)的核酸。在另一个实施方案中，MB是嵌合寡核苷酸；例如，包含DNA、RNA、GNA、PNA、LNA、TNA和吗啉代的混合物或组合。例子包括但不限于DNA/RNA嵌合MB、DNA/LNA嵌合MB和RNA/PNA嵌合MB。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸包含4-60个核苷酸。在其他实施方案中，MB的寡核苷酸包含7_32个核苷酸、4-25个核苷酸、4-16个核苷酸、4_32个核苷酸、7_16个核苷酸或7-25个核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸包含8-16个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含7、8、16或32个核苷酸。在一个实施方案中，文库中全部种类的MB具有核苷酸数目相同的寡核苷酸。在另一个实施方案中，文库中的MB种类具有核苷酸数众多的寡核苷酸。在一个实施方案中，核苷酸选自脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)和磷酰二胺吗啉代寡聚物(ΡΜ0/Morpholino)。寡核苷酸的长度通常是至少约6至约25个核苷酸、经常至少约10至约20个核苷酸，并且往往是至少约11至约16个核苷酸。本文所述的16聚体和32聚体寡核苷酸MB是示例性的并且不应当以任何方式是限制性的。在一些实施方案中，MB的寡核苷酸是核苷酸、核碱基或单体的聚合物。GNA是与DNA或RNA相似但是在其“主链”的组成上不同的聚合物。已知GNA并不天然地存在。尽管DNA和RNA具有脱氧核糖和核糖的糖主链，但是GNA的主链由通过磷酸二酯键连接的重复性甘油单元组成。甘油分子仅具有3个碳原子并且能够进行Watson-Crick碱基配对。Watson-Crick碱基配对在GNA中比其天然对应物DNA和RNA稳定得多，因为它需要高温以使GNA的双链体解链。GNA的例子是由Ueda等人，(1971) Journal ofHeterocyclicChemistry 8 (5), 827-9首次制备的2，3- 二轻丙基核苷类似物。其他GNA聚合物及它们的制备和性能在 Seita 等人，(1972)Die MakromolekulareChemie, 154:255-26l;Cook 等人，(1995) PCT 国际申请 WO 9518820,第 126 页；美国专利 No. 5886177 ；Acevedo和 Andrews(1996)Tetrahedron Letters 37(23):3931-3934 和 Zhang 等人,(2005), J.Am. Chem. Soc. 127(12) :4174-5中公开。这些参考文献均通过引用的方式完整地并入本文。TNA是与DNA或RNA相似但是在其“主链”的组成上不同的聚合物。已知TNA并不天然地存在。不同于具有脱氧核糖和核糖的糖主链的DNA和RNA，TNA的主链由通过磷酸二酯键连接的重复性苏糖单元组成。苏糖分子比核糖更容易装配。TNA可以与RNA和DNA特异性碱基配对。J Am Chem Soc. 2005，127:2802-3。TNA 的例子是(3，-2，)- α-I-苏糖核酸。其他 TNAs 由 Orgel, Leslie, 2000，Science 290 (5495) : 1306-1307 ；ffatt, Gregory,2005, Nature Chemical Biology ;和 Schoning, K.等人，2000，Science 290:1347 描述。这些参考文献均通过弓I用的方式完整地并入本文。PNA是与DNA或RNA相似的人工合成的聚合物，由Peter E. Nielsen和同事在1991年(Science，254:1497)发明。PNA的主链由通过连接的重复性N-(2-氨基甲基)-甘氨酸单元组成。多种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键与主链连接。将PNA如同肽那样，N端在第一(左)位置处并且C端在右侧。因此，PNA是具有伪肽主链的DNA模拟物。PNA是DNA (或RNA)的极好结构性模拟物。由于PNA的主链不含带电荷的磷酸基团，故而PNA/DNA链之间的结合因缺少静电排斥作用而强于DNA/DNA链之间的结合。PNA寡聚物能够与Watson-Crick互补性DNA、RNA(或PNA)寡聚物形成非常稳定的双链体结构物，并且它们也可以通过螺旋侵入与双链体DNA中的靶结合。(见Egholm, M.等人，(1993)Nature, 365，566-568 ;ffittung, P.等人，(1994)Nature, 368，561-563)。这些参考文献均通过引用的方式完整地并入本文。LNA是修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分以连接2’氧和4’碳的额外桥进行修饰。这个桥将核糖“锁定”处于3’ -内(北)构象，这种构象经常存在A形式的DNA或RNA中。LNA核苷酸可以在需要时与寡核苷酸中的DNA或RNA碱基混合。锁定的核糖构象增强碱基堆叠作用和主链预组织化。这明显增加寡核苷酸的热稳定性(解链温度)(Kaur，H等人，(2006), Biochemistry 45(23) :7347-55)。LNA核苷酸已经用来增加DNA微阵列、FISH探针、实时PCR探针和基于寡核苷酸的其他分子生物学技术中表现的灵敏度和特异性。LNA的合成和它们的杂交性能由 Alexei A.等人，(1998)，Tetrahedron 54(14) :3607-30 ；YouY.等人，(2006), Nucleic Acids Res. 34(8) :e60描述。这些参考文献均通过引用的方式完整地并入本文。Morpholino是可以通过标准核酸配对与互补序列杂交的合成分子。Morpholino具有与吗啉环而非与脱氧核糖环结合并且经磷酰二胺基团而不经磷酸酯连接的核苷酸碱基。用不带电荷的磷酰二胺基替换阴离子磷酸酯消除了正常生理学PH范围内的电离，从而Morpholino是总体上不带电荷的分子。Morpholino的完整主链由这些修饰的亚单位组成。最常使用吗啉代作为单链寡核苷酸，不过Morpholino链和互补性DNA链的异双链体可以与阳离子胞质递送试剂组合使用。还在开发Morpholino作为靶向致病生物如细菌或病毒的药学治疗药和用于减轻遗传病。例如，用于反义技术，用于抑制基因表达(Moulton，Jon(2007). “UsingMorpholinos to Control Gene Expression (Unit 4. 30)(使用 Morpholino 来控制基因表达(单兀4.30))” 引自 Beaucage, Serge. Current Protocols in Nucleic AcidChemistry. NewJersey: John ffiley&Sons, Inc.。这份参考文献通过引用的方式完整地并入本文。因为它们完全是非天然的主链，所以Morpholino不被细胞蛋白识别。核酸酶不降解Morpholino,同样它们在血清或细胞中不降解。Morpholino不激活toll样受体并且因而它们不激活固有免疫反应如干扰素诱导或NF- K B介导的炎症反应。已知Morpholino不修饰DNA的甲基化。在一个实施方案中，本文所述文库的MB不与固相载体(如载玻片或微珠)连接。在一个实施方案中，本文所述文库的MB游离于溶液中。在另一个实施方案中，本文所述文库的MB，当在溶液中游离时，采取“环-茎”构型，所述构型能够使可检测标记基团封阻剂在不存在与MB复性的靶核酸的情况下封阻可检测基团发射信号。在另一个实施方案中，本文所述文库的MB，当在溶液中游离时，采取一种构型，所述构型能够使可检测标记基团封阻剂在不存在与MB复性的靶核酸的情况下封阻可检测基团发射信号。在又一个实施方案中，本文所述文库的MB，当在溶液中游离时，不采取“环-茎”构型。在一个实施方案中，MB在它
19们在溶液中在合适的温度和离子强度条件(例如，低于茎-环结构的Tm)下游离时不发荧光。在一个实施方案中，可检测标记在MB的寡核苷酸的一个末端上存在并且在文库中全部MB寡核苷酸的相同末端上存在，其中在所述可检测标记不受封阻剂抑制时，可检测标记发射可以检测和/或测量的信号。在一个实施方案中，可检测标记位于MB的寡核苷酸的5’末端处。在一个实施方案中，可检测标记位于文库中全部MB寡核苷酸的5’末端处。在另一个实施方案中，可检测标记位于MB的寡核苷酸的3’末端处。在一个实施方案中,可检测标记位于文库中全部MB寡核苷酸的3’末端处。在一个实施方案中，可检测标记与MB的寡核苷酸的一条臂的末端、优选地与寡核苷酸的5’臂的末端共价连接。在一个实施方案中，可检测标记与寡核苷酸的5’臂共价连接。在一个实施方案中，可检测标记与MB的寡核苷酸的3’臂共价连接。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团不干扰MB与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交。在一个实施方案中，光学地检测可检测基团的信号。如本文所用，“光学地检测”就可检测基团信号而言指测量作为可检测基团所发射的信号的光能量。在一个实施方案中，发射的光能量具有380-760nm波长范围。在另一个实施方案中，发射的光能量具有700nm-1400nm波长范围。在另一个实施方案中，没有光学地检测可检测基团的信号。在一个实施方案中，可检测基团是荧光团并且信号是荧光。使用广泛类型的荧光团，可以使得MB具有许多不同的颜色(Tyagi S等人，Nature Biotechnology 1998 ；16:49-53)。随MB使用的荧光团的例子包括但不限于Alexa Fluor 350 ；Marina Blue ;Atto 390 ；Alexa Fluor 405 ；Pacific Blue ; Atto 425 ；Alexa Fluor 430 ；Atto 465 ；DY-485XL ；DY-475XL ；FAM 494 ；Alexa Fluor 488 ；DY-495-05 ；Atto 495 ；Oregon Green 488 ；DY-480XL 500 ；Atto 488 ；Alexa Fluor 500 ；Rhodamin Green ; DY-505-05 ；DY-500XL ；DY-510XL ；Oregon Green 514 ；Atto 520 ；Alexa Fluor 514 JOE 520 JET.TM. 521 ；CAL Fluor Gold 540 ;DY_521XL ； RhoctaminfiG ; Yakima Ydl0w⑩ 526 ；Atto532 ；Alexa Fluor 532 ；HEX 535 ；VIC 538 ；CALFluor0range560 ；DY-530 ；TAMRA ；Quasar570 ；Cy3 550 ；NED.TM. ;DY_550 ；Atto 550 ；Alexa Fluor 555 ;DY_555 ；Alexa FluOl 546 ；BMN 3 ;DY_547 ； PET ; Rhodamin Red ; Atto 565 ；CAL Fluor RED 590 ；R0X ；Alexa Fluor 568 ；Texas Red ; CAL FluorRed 610 ；LC Red 610 ；Alexa FlllOI 594 ；Atto 590 ；Atto 594 ;DY_600XL ;DY_610 ；Alexa FluOl' 610 ；CAL Fluor Red 635 ；Atto620 ；DY-615 ；LC Red 640 ；Atto 633 ；Alexa「hso!'卞.633 ;DY_630 ;DY_633 ;DY_631 ；LIZ638 ；Atto 647N ；BMN -5 ；Quasar 670 ;DY_635 ；Cy5 ；Alexa Fluor 647 ；CEQ8000D4 ；LC Red 670 ;DY_647652 ;DY_651 ；Atto 655 ；Alexa Fluor 660 ;DY_675 ;DY_676 ；Cy5. 5 675 ；Alexa Fluor 680 ；LC Red 705 ；BMN -6 ；CEQ8000D3 ； IRDye 700Dx 689 ；DY-680 ；DY-681 ；DY-700 ；Alexa Fluor 700 ；DY-701 ；DY-730 ；DY-731 ；DY-732 ；DY-750 ；Alexa Fluor 750 ；CEQ8000D2 ;DY_751 ;DY_780 ;DY_776 ； IRDye 800CW ;DY_782 ；和DY-781 ； Oyster 556 ； Oyster 645 ； IRDye 700，IRDye 800 ；WelIRED D4 ；WelIREDD3 ；WellRED D2 染料；Rhodamine Green ；Rhodamine Red ;荧光素；MAX 550 531 560JOE NHS 酯(类似 Vic) ；TYE 563 ；TEX 615 ；TYE 665 ；TYE 705 ；0DIPY 493/503TM ；
20BODIPY 558/568 ；B0DIPY564/570 ；B0DIPY 576/589 ；B0DIPY 581/591 ；B0DIPYTR-X ；B0DIPY-530/550 ;羧基-X-罗丹明 ;羧基萘荧光素；羧基罗丹明6G ；Cascade Blue ；7-甲氧基香豆素；6-J0E -J-氨基香豆素-X ;和2’，4’，5’，7’ -四溴砜荧光素菁染料；噻唑橙；洋地黄苷；荧光素(FAM);罗丹明x(ROX);四氯-6-羧基荧光素(TET);四甲基罗丹明(TAMRA) ；Alexa Fluor ； BOD IP Y ； OREGON GRE ΕΝ ; CASCADE B LUE ； Mar inaBlue ;PACIFIC BLUE ；RH0DAMINE GREEN ；RH0DAMINE RED ;和 TEXAS RED 是从 MolecularProbes, Inc.可商业获得的。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂是荧光团的猝灭剂。随MB使用的荧光团的猝灭剂的例子包括但不限于3’ I0WABLACK FQ、3’黑洞猝灭剂和3’Dabcyl ；BHQ-I ;BHQ-2 ; BBQ-650 ；DDQ-1 ；Iowa BlackRQ ；Iowa BlackFQ ； QSY-21 ; QSY-35 ;QSY-7 iQSY-9 ; QXL 490 ；QXL 570 ；QXL 610 ；QXL 670 ；QXL 680 ；DNP ;和 EDANS。存在许多猝灭剂-荧光团组合，每种组合物产生独特的颜色或荧光发射谱(见，例如，molecularbeacons. org的网站和其中引用的参考文献)。技术人员会认识到各种突光团和猝灭剂各自在特定的波长或波长范围具有最佳活性。因此，技术人员将知道选择荧光团和猝灭剂对，从而荧光团的最佳激发和发射光谱与猝灭剂的有效范围匹配。构思的猝灭剂-荧光团对的例子是6_FAM、HEX或TET与3’ -Dabcyl ;5’ -香豆素或伊红与3’ -Dabcyl ；5’ -Texas Red或四甲基罗丹明与3’ -黑洞猝灭剂；和EDANS和3’ -DABCYL0在一个实施方案中，可检测标记封阻剂和可检测标记均位于MB的寡核苷酸的相同末端处，即，均位于MB的寡核苷酸的3’末端或5’末端上。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂不紧邻MB的寡核苷酸上的可检测标记存在。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂和可检测标记由MB的寡核苷酸上的至少3个核苷酸或单体、MB的寡核苷酸上的至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸或至少25个核苷酸或单体分隔。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂位于MB的寡核苷酸的一个末端处，而可检测标记位于MB的寡核苷酸的另一末端处。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂与MB的寡核苷酸的一条臂、优选地与MB的寡核苷酸的3’臂共价连接。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂与MB的寡核苷酸的3’臂共价连接。在另一个实施方案中，可检测标记封阻剂与MB的寡核苷酸的5’臂共价连接。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂位于与MB的寡核苷酸上的可检测标记相对的末端。例如，如果可检测标记封阻剂位于MB的寡核苷酸的5’末端，则可检测标记位于同一个MB的寡核苷酸的3’末端。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂与MB的寡核苷酸的一条臂的末端共价连接，并且可检测标记与同一个寡核苷酸的另一条臂的末端共价连接。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂与MB的寡核苷酸的3’臂共价连接，并且可检测标记与同一个寡核苷酸的5’臂共价连接。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂与MB的寡核苷酸的5'臂共价连接，并且可检测标记与同一个寡核苷酸的3’臂共价连接。在一个实施方案中，荧光团与MB的寡核苷酸的一条臂的末端共价连接，并且荧光猝灭剂与同一个
21寡核苷酸的另一条臂的末端共价连接。在一个优选的实施方案中，荧光猝灭剂与MB的寡核苷酸的3,臂共价连接，并且荧光团与同一个寡核苷酸的5’臂共价连接。在另一个优选实施方案中，MB的寡核苷酸的3’臂指MB的寡核苷酸的3’末端并且MB的寡核苷酸的5’臂指MB的寡核苷酸的5’末端。在某些实施方案中，可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团通过共价键与MB的寡核苷酸偶联。在一个实施方案中，共价键包含间隔区、优选地直链烷基间隔区。“偶联”意指至少两个分子的共价键。间隔区的本质不是关键性的。例如，荧光猝灭剂如EDANS和DABCYL可以借助本领域熟知和常见使用的6个碳长度的烷基间隔区连接。烷基间隔区赋予可检测标记和可检测标记封阻剂足够柔性以便彼此相互作用以出现高效荧光共振能量转移并且因此出现高效猝灭。本领域技术人员将理解合适的间隔区的化学组分。碳链间隔区的长度可以大幅度变动，例如，从至少I个和高达15个碳或30个碳长度的烷基间隔区。在一个实施方案中，可检测标记封阻剂还是调节基团。这种调节基团的非限制性例子是金。金纳米粒子已经显示使突光团粹灭，例如，在Ghosh等人ChemicalPhysics Letters, 2004，395:366-372 ;Dulkeith 等人 Nano Lett. , 2005, 5:585-589 ；Mayilo 等人 Nano Lett. , 2009, 9:4558-4563 ；Dulkeith 等人 Physical ReviewLetters, 2002, 89:203002 ;Fan 等人 PNAS, 2003，100:6297-6301 中描述。这些参考文献通过引用的方式完整地并入本文。调节基团的主要功能是向MB的寡核苷酸增加体积并且以这种方式向双链核酸增加体积，其中所述双链核酸在多个MB与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列杂交以形成双链核酸时形成。双链核酸上所添加的体积起到以下作用(I)封阻双链核酸通过直径开口大于2. 2nm的孔；(2)促进具有较大孔径的纳米孔用于纳米孔解链依赖性核酸测序，和(3)辅助在纳米孔解链依赖性核酸测序期间在单链核酸上杂交的多个MB的解链。解链是一个顺序过程。图9中显示正在经历解链过程的双链核酸，此时一条链经过纳米孔120移位。经过具有孔宽度Dl (101)的纳米孔120移位的单链核酸109是代表待测序的核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列。待测序的核酸已经转化成在这种纳米孔解链DNA测序方法中使用的单链109代表性定义序列。双链核酸包含单链序列109和在其上互补性杂交的多个MB111。每种MB包含带有末端荧光团105和荧光团猝灭剂107的寡核苷酸117，以及调节基团103。图9中所示的MB具有分开和不同的封阻剂和调节基团。如图9中所示，不带大体积调节基团的双链核酸的宽度是D2 (113)。当Dl大于D2时，不带大体积调节基团的双链核酸可以经过宽度Dl的纳米孔移位。调节基团103的存在增加带有大体积调节基团的双链核酸的宽度到大于Dl (101)的D3 (115)。在纳米孔120的入口处，带有调节基团的MB 111与单链核酸109 “敲离”，原因在于MB 111和单链核酸109之间的亲和力弱于调节基团103对MB 111的亲和力。MB 111与单链核酸109的互补性杂交借助MB上的核碱基和单链核酸之间弱的非共价氢键进行。在一些实施方案中，调节基团103与MB 111共价连接。由于共价键强于氢键，当双链核酸在电场中试图移位纳米孔时，较弱的氢键断裂并且MB 111从双链核酸中释放出来。在一些实施方案中，调节基团103与MB 111非共价连接，但是这种非共价连接强于氢键。强于氢键的非共价连接是离子相互作用和疏水相互作用。这种非共价连接的非限制性例子是本领域熟知的抗生物素蛋白-生物素连接。抗生物素蛋白的解离常数经测量是Kd约等于10_15M，从而使得它成为已知最强的非共价连接之一。在一个实施方案中，杂交的单链核酸和MB之间的结合亲和力小于MB的调节基团和寡核苷酸的结合亲和力，由此当所述双链核酸试图在电势影响下通过纳米孔的开口时，所述单链核酸和MB之间的键而不是所述MB的调节基团和寡核苷酸之间的键破坏。在一个实施方案中，杂交的单链核酸和MB之间的氢键弱于调节基团和MB的寡核苷酸之间的离子相互作用和/或疏水相互作用。在一个实施方案中，调节基团与MB的寡核苷酸共价连接。在另一个实施方案中，调节基团与MB的寡核苷酸非共价连接。在一个实施方案中，调节基团选自但不限于纳米级粒子、蛋白质分子、有机金属粒子、金属粒子和半导体粒子。以下是本文中构思的调节基团类型的非限制性例子。构思可以使用在连接MB时可以向MB增加体积并且仍不干扰互补性碱基配对的任何分子作为调节基团。纳米级粒子低于IOOOnm的任何粒度，例如TiO2珠、金珠、银珠或乳胶珠、富勒烯(巴克球)、脂质体、二氧化硅-金纳米壳和量子点。种类繁多的纳米粒子是可商业获得的，例如，来自 INVITR0GEN 的 DYNABEADS、来自 PR0MEGA 的 MAGNESPHERE、和来自 BI0CL0NE 的磁珠。聚苯乙烯乳胶纳米珠与DNA的偶联由Huang等人，在Analytical Biochemistry1996，237:115-122中描述，所述文献通过引用方式完整地并入本文。蛋白质分子DNA结合蛋白，例如，锌指蛋白和组蛋白；tat肽；核定位信号(NLS)肽；链霉亲和素、抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的多种修饰形式，例如，中性抗生物素蛋白(neutravidin)。DNA结合蛋白天然地与DNA结合。在一个实施方案中，可以使用尺度范围l-20nm的蛋白质粒子。尺度范围4_20nm的其他蛋白质粒子可以通过酰胺键形成与蛋白质共价连接，这在 Taylor, J. R.等人，AnalyticalChemistry 2000, 72:1979-1986 ；Pagratis, N. Nucl. Acids Res. 1996, 24:3645-3646 ；Niemeyer, C.等人，Nucl. AcidsRes. 1999，27:4553-4561 ;Stahl, S.等人，Nucleic Acids Research 1988, 16:3025-3038 ；Sun, H.等人，Biosensors and Bioelectronics 2009，24:1405-1410 中描述。这些参考文献通过引用的方式完整地并入本文。有机金属粒子可以通过Ihara, T 等人，在 Nucl.Acids Res. 1996，24:4273-4280中； 和 Navarro,A.-E.等人,Bioorganic&MedicinalChemistry Letters2004, 14:2439-2441描述的二甲氧基三苯甲基核苷磷酰亚胺偶联法偶联二茂铁(0. 5nm)。这些参考文献通过弓I用的方式完整地并入本文。金属粒子金和镀银的金(大小可以是I. 4-100nm)和银(25-30nm)。这些金属粒子可以通过环状二硫化物、二硫化物、巯基(硫氢基)和胺官能团并且还通过生物素与MB寡核苷酸偶联。这些方法在Mirkin，C.A.等人，Nature 1996, 382:607-609 ；Alivisatos, A.等人，Naturel996, 382:609-611 ;Mucic, R. C 等人，J. Amer. Chem.Soc. 1998, 120:2674-12675 ；Taton, T. A.等人，Science 2000,289:1757-1760 ；Taton, T. A.等人，J. Amer. Chem. Soc. 2001，123: 5164-5165 ;Segond vonBanchet, G.和 Heppelman,B. :J.Histochem.Cytochem. , 43, 821 (1995)) ；Letsinger,R.L 等人，Bioconjugate Chemistry 2000, 11:289-291 ；Tokareva,I.和 Hutter, E. J. Amer. Chem.Soc. 2004, 126:15784-15789 ；Lee, J. -S.等人，Nano Letters 2007, 7:2112-2115 ；Sun, H.等人，Biosensors and Bioelectronics 2009，24:1405-1410 中详细描述。这些参考文献
23通过引用的方式完整地并入本文。半导体粒子量子点和ZnS。多种半导体型纳米粒子是商业可获得的，例如，来自INVITR0GEN 。在一个实施方案中，可以使用具有15_20nm大小范围的半导体粒子。这些粒子可以借助生物素、金属-巯基相互作用、糖苷键和、静电相互作用或半胱氨酸加帽的粒子与MB寡核苷酸连接。这些方法由Wu, S. -M.等人，Chem. Phys. Chem. 2006，7:1062—1067 ；Xiao, Y.和 Barker, P. E. Nucl. Acids Res. 2004, 32: e28 ；Yu, ff. ff.等人，Biochemical andBiophysical ResearchCommunications 2006, 348:781-786 ；Artemyev, M.等人，J. Amer.Chem. Soc. 2004，126:10594-10597 ；Li, Y.等人，Spectrochimica Acta Part A:Molecularand Biomolecular Spectroscopy 2004，60:1719-1724 描述。这些参考文献通过引用的方式完整地并入本文。在一个实施方案中，调节基团位于MB的寡核苷酸的5’末端或3’末端处。在另一个实施方案中，调节基团在距离MB的寡核苷酸的3’或5’末端2-7个核苷酸内部连接。调节基团可以位于距离MB的寡核苷酸的3’或5’末端的第二核苷酸处、第三核苷酸处、第四核苷酸处、第五核苷酸处、第六核苷酸处或第七核苷酸处。在一个实施方案中，调节基团与MB的寡核苷酸的主链连接。核酸的基本结构和组分是本领域已知的。核酸是由主链和核碱基组成的聚合物，其中所述主链包含交替的糖和磷酸盐或吗啉代。在另一个实施方案中，调节基团与MB的寡核苷酸的核碱基连接。在一些实施方案中，调节基团通过碳接头与MB的寡核苷酸连接。在一些实施方案中，这种碳接头具有1-30个碳(烷基)残余物。在一个实施方案中，调节基团增加双链核酸在调节基团与寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)到大于2. O纳米(nm)，其中通过MB与代表A、U、T、C或G的定义序列杂交形成双链核酸。在一个实施方案中，调节基团增加宽度D3大于2. 2nm。在其他实施方案中，调节基团增加宽度 D3 大于 3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4. 1,4. 2,4. 3,4. 4、
4.5、4. 6、4. 7、4. 8、4. 9、5. 0、5. 1、5. 2、5. 3、5. 4、5. 5、5. 6、5. 7、5，8、5. 9、6. 0、6. 1、6. 2、6. 3、
6.4、6. 5、6，6、6. 7、6. 8、6. 9、7. O、7. I、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、8. O、8. I、8. 2、
8.3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 9、9· 0、9· 1、9· 2、9· 3、9· 4、9· 5、9· 6、9· 7、9· 8、9· 9 或 IOnm0在一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)是约3-7nm。在一个实施方案中，宽度D3是约3_7nm。在一个实施方案中，双链核酸在调节基团与单链核酸连接的点处的宽度可以通过侧接头，例如，C20、C15、C12、C9、C8、C6、C5、C4、C3和C2接头进一步增加。在一个实施方案中，MB的寡核苷酸上的调节基团是3_5nm。在一个实施方案中，调节基团是0. 5nm至lOOOnrn。在一个实施方案中，调节基团是90_944nm。在一个实施方案中，调节基团是4-20nm。在一个实施方案中，调节基团是I. 4_100nm。在一个实施方案中，调节基团是25-30nm。在一个实施方案中，调节基团是15_20nm。在一个实施方案中，调节基团是15_30nm。在一个实施方案中，调节基团是150_300nm。在一个实施方案中，调节基团是9-50nm。在一个实施方案中，调节基团是10-100nm。在其他实施方案中，调节基团是3-1000nm、3-944nm、3-30nm、3-100nm、3-25nm、3-50nm、3-300nm、3-90nm、3-15nm、3-9nm 和3-4nm,包括3和IOOOnm之间的全部数字至第二小数位。在一个实施方案中，当链核酸经历纳米孔测序时，调节基团促进双链核酸的解链。在本文所述方法的一个实施方案中，纳米孔尺寸允许待测序的单链核酸通过所述孔，但是不允许双链核酸通过所述孔，其中所述双链核酸由本文所述的MB与单链核酸或代表A、C、T、G或U的定义序列杂交形成。在本文所述方法的一个实施方案中，纳米孔开口大于2nm但是小于lOOOnm。在一个实施方案中，纳米孔开口大于2nm但是小于双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度。在本文所述方法的一个实施方案中，孔(Dl)具有约3nm至约6nm的开口直径。在本文所述方法的又一个实施方案中，孔具有约3nm至与MB寡核苷酸连接的调节基团的75%宽度的开口直径。在本文所述方法的某些实施方案中，孔具有约2. 2nm至10nm、约2. 2nm至75nm或约2. 2nm至IOOnm的直径。在其他实施方案中，孔(Dl)具有例如约3. 0,3. 1,3. 2、3. 3、3· 4、3· 5、3· 6、3· 7、3· 8、3· 9、4· 0、4· 1、4· 2、4· 3、4· 4、4· 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9、5· 0、5· I、5. 2、5. 3、5. 4、5. 5、5. 6、5. 7、5，8、5. 9、6. O、6. I、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6，6、6. 7、6. 8、6. 9、7. O、7. 1、7· 2、7· 3、7· 4、7· 5、7· 6、7· 7、7· 8、7· 9、8· 0、8· 1、8· 2、8· 3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 9、9· 0、9· I、9. 2、9. 3、9. 4、9. 5、9. 6、9. 7、9. 8、9. 9 或 IOnin 直{5。在本文所述方法的一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)大于2nm。在本文所述方法的另一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)大于2. 2nm。在本文所述方法的其他实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)在直径方面大于3. 0,3. I、3. 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 6、3· 7、3· 8、3· 9、4· 0、4· 1、4· 2、4· 3、4· 4、4· 5、4· 6、4· TA. 8、4· 9、5· O、
5.I、5. 2、5. 3、5. 4、5. 5、5. 6、5. 7、5，8、5. 9、6. O、6. I、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6，6、6. 7、6. 8、6. 9、
7.0、7· 1、7· 2、7· 3、7· 4、7· 5、7· 6、7· 7、7· 8、7· 9、8· 0、8· 1、8· 2、8· 3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 9、9· O、
9.1、9· 2、9· 3、9· 4、9· 5、9· 6、9· 7、9· 8、9· 9 或 10nm，其中 D3 总大于 D1。在本文所述方法的一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)是约3-5nm。在本文所述方法的一个实施方案中，双链核酸在调节基团与MB的寡核苷酸连接的点处的宽度(D3)是约3-6nm。在其他实施方案中，D3是约3_7nm、3-8nm、3-9nm、3-10nm、3-12nm、3-15nm、3-17nm 或 3_20nmo在本文所述方法的一个实施方案中，D3大于2nm。在本文所述方法的另一个实施方案中，D3大于2. 2nm。在一个实施方案中，D3是约3_7nm。在本文所述方法的一个实施方案中，Dl大于2nm。在本文所述方法的另一个实施方案中，Dl大于2. 2nm。在一个实施方案中，Dl是约3_6nm。在本文所述方法的一个实施方案中，双链核酸在调节基团与聚合物连接的点处的宽度(D3)大于纳米孔的开口宽度(Dl)，因而当双链核酸试图在电势的影响下通过这个开口时，调节基团封阻双链核酸上的MB进入所述开口并且MB从双链核酸中解链。在本文所述方法的一个实施方案中,D3大于D1。在一个实施方案中,Dl最多为D3宽度的75%。在本文所述方法的一个实施方案中，杂交的单链核酸和MB之间的结合亲和力小于MB的调节基团和寡核苷酸的结合亲和力，因而当双链核酸试图在电势影响下通过纳米孔的开口时，单链核酸和MB之间的键而不是MB的调节基团和寡核苷酸之间的键破坏。在一个实施方案中，单链核酸和MB之间的键是非共价的氢键。在一个实施方案中，调节基团和MB的寡核苷酸之间的键是共价键。在一个实施方案中，单链核酸和MB之间的键是非共
25价的氢键，并且调节基团和MB的寡核苷酸之间的键是非共价键如离子相互作用和疏水相互作用。在本文所述方法的一个实施方案中，当双链核酸试图在电势的影响下通过这个开口时，调节基团封阻双链核酸上的MB寡核苷酸进入所述开口，单链核酸和MB寡核苷酸之间的非共价氢键变得破裂。MB寡核苷酸在纳米孔的入口处逐个依次和按时间顺序分离并且从单链核酸释放，其中单链核酸进入纳米孔而分离的MB不进入。在本文所述方法的一个实施方案中，待测序的核酸是DNA或RNA。在本文所述方法的一个实施方案中，使用单个孔。在另一个实施方案中，使用多个孔。MB的合成和将外部基团与寡核苷酸偶联的方法是本领域技术人员已知的。带有所需官能团的分子信标可以使用标准寡核苷酸合成技术合成或购买(例如，从IntegratedDNA Technologies购买)。技术人员将认识到许多额外的分子信标序列是市售的并且可以设计额外的分子信标序列用于本发明方法中。对设计有效分子信标核苷酸序列的标准的详细讨可以在分子信标组织(molecular-beacons organization)的互联网上和在Marras 等人,(2003) ^Genotyping single nuc leoti depolymorph isms with molecularbeacons (用分子信标对单核苷酸多态性进行基因分型”)(引自Kwok, P. Y.(编著)，Singlenucleotidepolymorphisms:methods and protocols (单核苷酸多态性:方法和操作方案)· The Humana Press Inc. , Totowa, N. J.,第 212 卷，第 111-128 页)；和 Vet 等人(2004) “ (Design and optimization of molecular beacon real-timepolymerasechain reaction assays)分子信标实时聚合酶链反应测定法的设计和优化.”(引自Herdewi jn, P.(编著)，Oligonucleotide synthesis :Methods and Applications (寡核苷酸合成方法和应用).Humana Press, Totowa, N. J.,第288卷，第273-290页)中找到，所述文献的内容通过引用的方式完整地并入本文。分子信标也可以使用从PremierBiosoftInternational (Palo Alto, Calif.)可获得的专用软件(如名为“信标设计师”)设计，所述软件的内容通过引用方式完整地并入本文。许多修饰的核苷、核苷酸和适于掺入核苷中的多种碱基是从多个制造商可商业获得的，包括 SIGMAchemical company(Saint Louis, Mo.)> R&DSystems (Minneapolis, Minn. )、Pharmacia LKBBiotechnology (Piscataway, N. J.) >CLONTECH Laboratories,Inc. (PaloAlto, Calif.)> Genes Corp. , Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee, ffis. )> Glen Research, Inc. , GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersberg,Md.)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika (FlukaChemie AG,Buchs, Switzerland)> Invitrogen , San Diego, Calif.和 Applied Biosystems(FosterCity, Calif.)以及技术人员已知的许多其他商业来源。将碱基与糖部分连接以形成核苷的方法是已知的。见，例如，Lukevics和Zablocka (1991), NucleosideSynthesis: OrganosiliconMethods (核苷合成有机娃法),Ellis Horwood LimitedChichester, WestSussex, England及其中的参考文献。使核苷磷酸化以形成核苷酸和将核苷酸掺入寡核苷酸中的方法也是已知的。见，例如，Agrawal (编著)(1993)Protocols forOligonucleotides and Analogues, Synthesis andProperties (寡核苷酸及类似物的操作方案、合成和性能)，Methods inMolecular Biology,第 20 卷，Humana Press, Towota, N.J.及其中的参考文献。此外，定制设计的MB也是市售的，例如，GENE TOOL LLC的Morpholino ；BI0-SYNTHESIS Inc.的 PNA 及嵌合 PNA ;和 EXIQON 的 LNA。修饰的核苷、核苷酸和多种碱基提供合适的接头用于连接本文所述的可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团。接头可以置于MB寡核苷酸的3’末端、5’末端或内部。本领域技术人员将能够选择适宜的接头并且在MB的合成期间掺入这些接头。氨基接头的非限制性例子是2’ -脱氧腺苷-8-C6氨基接头、2’ -脱氧胞苷-5-C6氨基接头、2’ -脱氧胞苷-5-C6氨基接头、2’ -脱氧鸟苷-8-C6氨基接头、3’ C3氨基接头、3’ C6氨基接头、3’ C7氨基接头、5’ C12氨基接头、5’ C6氨基接头、C7内部的氨基接头、胸苷-5-C2和C6氨基接头、胸苷-5-C6氨基接头。巯基接头可以用来与马来酰亚胺形成可逆的二硫键或稳定的巯基醚键。巯基接头的非限制性例子是3’ C3 二硫键接头、3’ C6- 二硫键接头和5’ C6 二硫键接头。其他接头包括但不限于用于3’末端的醛接头、用于5’末端的醛醛接头、生物素酰化-dT、羧基-dT和DADE接头。用于偶联外部基团的修饰的核苷、核苷酸和多种碱基是可商业获得的，例如，来自 TriLINK BIOTECHNOLOGIES。在一些实施方案中，可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团通过共价键借助间隔区、优选地直链烷基间隔区与MB寡核苷酸偶联。本领域技术人员将理解合适的间隔区的化学组分。碳链间隔区的长度可以大幅度变动，具有至少I个至30个碳。在一些实施方案中，MB寡核苷酸具有与之连接的外部基团。例如，基团可以与核苷糖环上或嘌呤环或嘧啶环上的多个位置，其中所述嘌呤环或嘧啶环可以通过与带负电荷的磷酸酯主链静电相互作用或通过在大沟和小沟中的氢键相互作用使双链体稳定。例如，腺苷和鸟苷核苷酸任选地在N2位置处以咪唑基丙基置换，增加双链体稳定性。通用碱基类似物如3-硝基吡咯和5-硝基吲哚任选地包含于寡核苷酸探针中，以便通过碱基堆叠相互作用改善双链体稳定性。在某些实施方案中，可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团的连接借助在Mb寡核苷酸和标记/封阻剂或调节基团上可用的伯胺(-NH2)或仲胺、羧基(-C00H)、硫氢基/巯基(-SH)、伯羟基或仲羟基和羰基(-CH0)官能团进行。本领域技术人员将认识本文所述的可用官能团或将能够设计并且合成带有用于偶联目的的所需官能团的MB寡核苷酸或标记/封阻剂或调节基团。例如，在肽不含有用于化学交联的可用反应性巯基的情况下，几种方法可用于将巯基导入蛋白质和肽中，包括但不限于还原固有二硫键以及将胺或羧酸基团转化成巯基。这类方法是本领域技术人员已知的并且存在用于此目的的许多商业试剂盒，如来自 INVITROGENtmInc.的 Molecular Probes 分公司和 Pierce Biotechnology。在一个实施方案中，偶联可以在MB寡核苷酸上的氨基接头上的蛋白质的羧基基团和胺基团之间发生。氨基接头可以位于MB寡核苷酸的3’、5’或内部。使用化学交联剂偶联几个分子是本领域熟知的。交联试剂是可商业获得的或可以容易地合成。本领域技术人员将能够基于可用于偶联的官能团，例如蛋白质中半胱氨酸氨基酸残基之间的二硫键选择适宜的交联剂。不应当解释为限制性的交联剂的例子是戊二醛、双(亚氨酯)、双(琥珀酰亚胺酯)、二异氰酸酯和二酰氯。可以在INVITROGEN的Molecular Probe的第5. 2部分找到关于化学交联剂的广泛数据。图11A-11C是用于将肽与分子信标连接的3个不同偶联策略的例子。这些偶联策略适用于选择的任何调节基团。图IlA显示链霉亲和素-生物素连接，其中通过将生物
27素-dT借助碳-12间隔区导入茎部的猝灭剂臂而修饰分子信标。生物素修饰的肽借助具有4个生物素结合位点的链霉亲和素分子与修饰的分子信标连接。选择的生物素-dT可以具有O个碳直至18个碳的长度变动的间隔区。图IlB显示巯基-马来酰亚胺连接，其中通过添加巯基修饰分子信标茎部的猝灭剂臂，所述巯基可以与置于肽的C末端的马来酰亚胺基团反应以形成直接稳定的连接。图IlC显示可切割的二硫键，其中肽通过在C末端添加与巯基修饰的分子信标形成二硫键的半胱氨酸残基被修饰。巯基-dT是向寡核苷酸添加巯基的最常见方法。巯基-dT可以具有O个碳至18个碳的不同长度的间隔区。在一个实施方案中，调节基团与MB寡核苷酸的可检测标记臂连接。在一个实施方案中，调节基团与MB寡核苷酸的荧光团臂连接。在一个实施方案中，调节基团与MB寡核苷酸的可检测标记封阻剂臂连接。在一个实施方案中，调节基团与MB寡核苷酸的荧光团猝灭剂臂连接。在一个实施方案中，由可检测基团发射的信号是荧光。检测和测量荧光的方法是本领域技术人员已知的，例如在美国专利No. 6，191,852和美国专利申请公开No. 20090056949中描述。这些参考文献通过引用的方式完整地并入本文。包含合成或天然纳米孔的纳米孔器件是本领域已知的并且本文中描述。见，例如，Heng, J. B.等人，Biophysical Journal 2006，90，1098-1106 ;Fologea, D.等人，NanoLetters 20055 (10), 1905-1909 ；Heng, J. B.等人，Nano Letters 20055(10), 1883-1888 ；Fologea, D.等人，NanoLetters 2005 5 (9), 1734-1737 ；Bokhari, S. H.和 Sauer, J.R. , Bioinformatics 200521(7), 889-896 ；Mathe, J.等人，Biophysical Journal200487, 3205-3212 ；Aksimentiev, A.等人，Biophysical Journal 2004 87, 2086-2097 ；Wang, H.等 A , PNAS 2004 101(37), 13472-13477 ；Sauer-Budge, A. F.等人，PhysicalReview Letters 2003 90(23), 238101-1-238101-4 ；Vercoutere, ff. A.等人，NucleicAcids Research2003 31(4),1311-1318 ；Meller,A.等人，Electrophoresis 200223，2583-2591。纳米孔和使用它们的方法在美国专利No. 7，005，264 B2及6，617，113、美国专利申请公开 No. 2009/0029477 及 20090298072 和在 Soni 和 Meller, Clin.Chem. 2007, 53:11中公开。这些参考文献通过引用的方式完整地并入本文。本发明可以在依字母顺序排列的以下段落的任一个中定义[A]用于纳米孔解链依赖性核酸测序的分子信标(MB)文库，所述文库包含多种MB，其中每种MB包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含(I)可检测标记；(2)可检测标记封阻剂；和(3)调节基团；其中MB能够与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交以形成双链(ds)核酸。[B]段落[A]的文库，其中寡核苷酸包含4-60个核苷酸。[C]段落[A]或[B]的文库，其中MB的寡核苷酸包含选自脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和磷酰二胺吗啉代寡聚物(ΡΜ0或Morpholino)的核酸。[D]段落[A]_[C]的任一段落的文库，其中可检测标记在寡核苷酸的一个末端上连接并且处在文库中全部寡核苷酸的相同末端上，其中在可检测标记不受封阻剂抑制时，可检测标记发射可以检测和/或测量的信号。
[E] [A]-[D]的任一段落的文库，其中MB不与固相载体连接。[F] [A]-[E]的任一段落的文库，其中寡核苷酸上的可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团不干扰MB与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交。[A]-[F]的任一段落的文库，其中光学地检测可检测基团的信号。[A]-[G]的任一段落的文库，其中可检测基团是荧光团并且信号是荧光。[A]-[H]的任一段落的文库，其中可检测标记封阻剂是荧光团的猝灭剂。段落[A]_[I]的任一段落的文库，其中可检测标记封阻剂还是调节基团。段落[A]-[J]的任一段落的文库，其中调节基团位于寡核苷酸的5’末端或3’末端。[L]段落[A]_[K]的任一段落的文库，其中调节基团增加双链核酸在调节基团与寡核苷酸连接的点处的宽度到大于2. O纳米(nm)，其中通过MB与代表A、U、T、C或G的定义序列杂交形成双链核酸。[M]段落[L]的文库，其中双链核酸在调节基团与寡核苷酸连接的点处的宽度是约 3_7nm。[N]段落[A]_[M]的任一段落的文库，其中调节基团选自纳米级粒子、蛋白质分子、有机金属粒子、金属粒子和半导体粒子。[O]段落[A]_[N]的任一段落的文库，其中调节基团是3_5nm。[P]段落[A]_
的任一段落的文库，其中当双链核酸经历纳米孔测序时，所述调节基团促进双链核酸的解链。[Q]段落[A]_[P]的任一段落的文库，其中存在MB的两个或更多个种类，其中MB的每个种类具有不同的可检测标记。[R] 一种使双链(ds)核酸解链用于纳米孔解链依赖性核酸测序的方法，所述方法包括a.将权利要求[A]_[Q]的分子信标(MB)的文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因所述调节基团的存在而形成，其中待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；b.使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl ;并且c.施加跨纳米孔的电势以使杂交的分子信标与待测序的单链核酸解链。[S]段落[R]的方法，其中所述纳米孔尺寸允许待测序的单链核酸通过所述孔，但是不允许所述双链核酸通过所述孔。[T]段落[R]或[S]的方法，其中Dl大于2nm。[U]段落[R]_[T]中任一段落的方法，其中Dl是3_6nm。[V]段落[R]_[U]中任一段落的方法，其中D3大于2nm。[ff]段落[R]_[V]中任一段落的方法，其中D3是约3_7nm。[X]段落[R]_[W]中任一段落的方法，其中杂交的单链核酸和MB之间的结合亲和力小于MB的调节基团和寡核苷酸的结合亲和力，由此当所述双链核酸试图在电势影响下通过纳米孔的开口时，所述单链核酸和MB之间的键而不是所述MB的调节基团和寡核苷酸
29之间的键破坏。[Y]段落[R]_[X]中任一段落的方法，其中所述待测序的核酸是DNA或RNA。[Z] 一种用于测定核酸的核苷酸序列的方法，其包括步骤a.将权利要求[A]_[Q]的分子信标(MB)文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因所述调节基团的存在而形成，其中待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；b.使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl ；c.施加跨纳米孔的电势以使杂交的MB与待测序的单链核酸解链；并且d.当所述MB在所述孔处出现时与所述双链核酸分开时，检测由可检测标记从每种MB发射的信号。[AA]段落[Z]的方法进一步包括将检测到的信号序列解码成所述核酸的核苷酸碱基序列。[BB]段落[Z]或[AA]的方法，其中纳米孔尺寸允许待测序的单链核酸通过所述孔，但是不允许所述双链核酸通过所述孔。[CC]段落[Z]_[BB]中任一段落的方法，其中Dl大于2nm。[DD]段落[Z]_[CC]中任一段落的方法，其中Dl是约3_6nm。[EE]段落[Z]_[DD]中任一段落的方法，其中D3大于2nm。[FF]段落[Z]_[EE]中任一段落的方法，其中D3是约3_7nm。[GG]段落[Z]_[FF]中任一段落的方法，其中杂交的单链核酸和MB之间的结合亲和力小于MB的调节基团和寡核苷酸的结合亲和力，由此当所述双链核酸试图在电势影响下通过纳米孔的开口时，所述单链核酸和MB之间的键而不是所述MB的调节基团和寡核苷酸之间的键破坏。[HH]段落[Z]_[GG]中任一段落的方法，其中待测序的核酸是DNA或RNA。本发明由以下实施例进一步说明，这些实施例不应当解释为限制性的。本申请通篇范围内引用的全部参考文献的内容并且附图通过引用方式并入本文。
实施例采用纳米孔阵列光学识别单分子DNA测序的各个核碱基介绍高通量DNA测序技术正在深刻地影响比较基因组学、生物医学研究和个体化医疗1O具体而言，单分子DNA测序技术使所要求的DNA材料的量最小化，并且因此被视为提供指向宽范围DNA读出长度的低成本和高通量测序法的突出候选物卜4。固态纳米孔是一类具有广泛应用的单分子探针技术，包括表征DNA结构和DNA-药物或DNA-蛋白质相互作用5_12。不同于其他单分子技术，采用纳米孔检测不要求将大分子到表面上固定，因此简化样品准备。另外，固态纳米孔可以按高密度形式制造，这将允许规模平行检测的开发。纳米孔是在将含有离子溶液的两个腔室分隔的超薄膜中纳米大小的孔。跨该模施加的外部电场在孔附近产生离子电流和局部电势梯度，这以单文件方式牵引生物聚合物穿过该孔并且使其线性化6’13。随着生物聚合物进入该孔，它移走一部分电解液，导致孔导电性变化，这可以使用静电计直接测量。最近已经提出许多基于纳米孔的DNA测序方法14并且凸显出两个主要难题15 1)在各个核苷酸(nt)之间区分的能力。该系统必须能够在单分子水平区别4种碱基。2)这种方法必须能够平行读出。由于单纳米孔一次仅可以探针一个单分子，因此需要用于制造纳米孔阵列和同时监测这些纳米孔的策略。最近，已经显示，可以在用核酸外切酶切割DNA碱基后使用修饰的α-溶血素蛋白孔鉴定各个核苷酸16。然而，酶活性的动力学仍是读出的限速步骤。另外，这种方法以及在读出阶段涉及酶的其他单分子方法的通量受在分子之间大幅度变化的酶持续合成能力限制。迄今，仍未展示借助任何基于纳米孔的方法平行读出。发明人提出了一种用于高通量碱基识别的基于纳米孔的新方法，所述方法避免在读出阶段期间对酶的需要并且提供了用于多孔检测的简易方法。靶DNA分子的生物化学制备将每个碱基转化成可以使用未修饰的固态纳米孔直接读取的形式。读出速度和长度因此不是酶限制性的。尽管先前公开使用电信号探测纳米孔中的生物分子，但是发明人在此使用光学感知来检测DNA序列。发明人已经开发了一种定制全内反射(TIR)方法，所述方法允许高时空分辨率宽域光学检测经纳米孔移位的各个DNA分子17。在此，发明人使用这种系统来实现从多个纳米孔同时光学检测。因此，发明人为纳米孔单分子测序方法的全部关键组分展示原理验证。方法电测量自行制造纳米芯片，这始于使用LPCVD以30nm厚的低应力SiN镀覆双侧抛光的硅晶片。使用标准方法产生SiN窗(30X30 μ m2)。如先前描述，使用聚焦电子束制造纳米孔(直径3-5nm)28。将钻孔的纳米芯片在受控的湿度和温度下清洁并且在定制设计的CTFE小室上装配，所述CTFE小室并入玻璃盖玻片底部(详见参考文献17)。通过将脱气和过滤的IM KCI电解液添加到顺式腔并且将含有8. 6M脲的IM KCI添加到反式腔室，将纳米孔水合以促进经过反式腔的全内反射(TIR)成像，如下文解释。使用IOmM Tris-HCl,将全部电解液调节至pH 8.5。将Ag/AgCl电极浸入小室的每个腔中并且与Axon 200B前级(headstage)连接,所述Axon 200B前级用来跨膜施加固定电压(对于全部实验均为300mV)并且用来在需要时测量离子电流。将流体室置于中定制的法拉第笼以减少噪声拾取，所述法拉第笼安装在改良的倒置显微镜上。纳米孔电流使用50kHz低通Butterworth滤波器滤波并且使用250kHz/16比特的DAQ板卡(PCI-6154, Nationallnstruments, TX)采样。使用如先前所述的定制LabView程序取得信号9。电/光学检测和信号同步为了在悬浮的SiN膜附近实现高速单分子检测各个荧光团，开发了一种大幅度减少荧光背景的定制TIR成像法17。调节反式腔溶液的折射率，从而可以在SiN膜处产生TIR，防止光继续进入顺式腔，因此减少额外的背景。将小室安装在高NA物镜(Olympus 60X/1. 45)上，并且通过将入射激光束640nm激光(20mW，iFlex2000，Point-Source UK)聚焦至其后焦平面处的离轴点，因而控制入射角来优化TIR。使用Semrock(FF685Di01) 二色镜，将荧光发射劈裂分成两条独立光路，并且将两幅图像投射到EM-CXD照相机(Andor, iXon DU-860)上。EM-CXD在最大增益和Ims积分时间下工作。通过将照相机'拍摄’脉冲连接至计数板卡(PCI-6602, Nationallnstruments, TX)实现电信号和光信号之间的同步，其中所述计数板卡共享与DAQ主板相同的采样时钟和启动触发器(start trigger)。合并数据流包括在每个CCD巾贞的起点处独特的时戳(time stamp),
31所述时戳与离子电流采样同步。两个独立标准用于分类每个事件。首先，离子电流必须骤降至用户定义的阈值水平以下，并且返回原始状态之前在该水平保持至少100μ8。其次，在事件驻留时间(信号保持在阈值以下的时间)期间的相应CCD帧必须仅在孔区域处显示光子计数增加。通过读取的以孔位置为中心的3X3像素区域内的强度进行双色强度分析(见例如图4a)。使用两个通道中的原始强度数据来计算比率R=Ch2/Chl，所述比率用来区分两个比特。使用校正数据，以定制LabView代码自动地进行区分(图4c)。数据分析使用IGORPro (Wavemetrics)进行，并且产生拟合以优化卡方(chi-square)。制备抗生物素蛋白-生物素酰化白分子信标由于抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白分子含有4个结合位点，不可避免的是仅单分子信标与一个抗生物素蛋白分子结合。因此，发现在Tris-EDTA缓冲液中与摩尔比3:1的游离生物素对抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白预孵育30分钟充当了相当适合的引发步骤。此后，将生物素酰化的DNA信标添加至溶液，从而信标对抗生物素蛋白的比率是5:1。这确保仅I个信标与一个抗生物素蛋白分子结合。结果该方法包含两个步骤(图Ia):首先，将靶DNA(即，待测序的DNA)中4种核苷酸(A、C、G和T)的每一个转化成预定义的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列与携带特定荧光团的分子信标杂交。对于双色读出(即，两个类型的荧光团)，这4种序列是两个预定义独特序列比特’O’和比特’I’的组合，因此A将是’1，I’，G将是’1，O’，T将是’0，I’并且最后C将是’ 0，O’(图la，左小图)。携带两个类型荧光团的两个类型的分子信标与’ O’序列和’I’序列特异性杂交。其次，通过固态孔使转化的DNA和杂交的分子信标以电泳方式线性化，其中随后剥离所述信标。每次剥离一个信标时，一个新荧光团解猝灭，导致光子爆发，所致爆发在孔的位置处记录到(图la，右小图)。每个孔位置处双色光子爆发的顺序(将颜色转换成图I中的不同灰度级)是靶DNA序列的二进制代码。发明人的方法解决了纳米孔测序法遭遇的两个难题1)避免了需要检测各个碱基并且促进无酶读出；和2)宽域成像和空间固定的孔能够进行简单修改以使用电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)照相机同时检测多个孔(图Ib中示意性显示)。图2显示了靶DNA的转化，作为命名为环状DNA转化(CDC)的过程，因为在每个转化循环期间形成环状DNA分子。图2a示意性地显示⑶C的3个步骤，并且图2b显示单个转化循环的结果。出于原理验证，合成4种单链DNA(ssDNA)模板,全部4种模板均长100_nt并且它们仅在5’末端核苷酸处不同。这些模板含有用于固定到链霉亲和素涂覆的磁珠上的生物素部分。在初始步骤中，这些模板与DNA分子(称作探针)的文库杂交，每个DNA分子带有双链中央部分和两个单链突出端。双链部分含有匹配于模板分子5’端核苷酸的预定义的寡核苷酸代码。仅其3’突出端完美互补于模板5’末端的那些探针可以与模板杂交。探针的5’突出端与相同模板的3’末端杂交以形成环状分子。在转化的第二步骤中，T4DNA连接酶用来将探针的两个末端与模板连接(连接的两个位置在图2a中由红色点指示)。T4DNA连接酶已经因与其他酶相比的极高保真性在其他DNA测序方法中使用18。最后，探针的双链部分含有IIS型限制酶的识别位点(以’ R’标出)并且使它正好在模板的5’端核苷酸之后切割。在短暂热诱导解链和随后洗涤后，新形成的ssDNA在其3’端含有二进制代码，随后是原始模板的5’端核苷酸。这种过程可以根据需要重复许多次，将核苷酸从模板的5’端转移至3’端，与相应代码交错。不同模板分子的转化不需要至加以同步，并且无结果的杂交将不导致误差，只要没有连接和切割接踵发生即可。环状DNA转化法(CDC)这种转化方法的目的是使DNA模板中的每个单个碱基在由较长的预定义序列代表。出于概念验证目的，合成4种DNA模板分子(每种为100聚体)，其中每种模板仅因5’末端碱基的身份而不同。这些模板含有用于将模板固定到链霉亲和素涂覆的磁珠(INVITROGENDYNABEADS MYONE Streptavidin Cl)上的生物素部分。这个固定步骤使得在转化过程的不同期间快速移走和替换缓冲溶液成为可能，同时DNA样品损失最小。首先将模板分子随所述珠一起在缓冲溶液(2MNaCl，2mM EDTA, 20mM Tris)中悬浮10分钟以允许固定发生。这之后是洗涤步骤以移去固定缓冲溶液。包覆的珠随后重悬于含有本文中称作探针的DNA分子的文库的溶液中。每种探针是一种带粘性末端的双链分子，其含有特定碱基的预定义寡核苷酸代码，如图2a中所显示。仅其3’突出端完美互补于模板5’末端的那些探针可以与模板杂交。将文库探针设计成允许模板分子的3’末端与探针的5’突出端杂交。样品随经历过缓慢冷却过程以允许文库探针与它们的互补性模板分子杂交。这个过程在高盐(IOOmM NaCl, IOmMMgCl2)下实施以促进杂交。在本过程的这个阶段，环状分子已经产生。样品随后用IOmMTris缓冲溶液洗涤以除去已经不与固定的模板分子杂交的任何过多文库探针。样品随后重悬于连接缓冲液中以允许新杂交的分子连接一起。连接缓冲液含有 Quick T4 DNA 连接酶(New England BioLabs)和 Quick 连接反应缓冲剂(New EnglandBioLabs)。连接在室温实施5分钟。在这个步骤后，用IOmM Tris缓冲溶液实施另一次洗涤以除去连接酶和连接缓冲液。转化过程的倒数第二步骤是将新环化和固定的分子重悬于含有BseGl限制酶和FASTDIGEST缓冲剂(二者均来自Fermantes)的缓冲溶液中。这个过程以如此方式再线性化环状分子，从而预定义代码外加它代表的碱基现在位于模板分子的3’末端处并且新碱基现在位于在5’末端，为通过转化过程做好准备。一旦样品已经悬浮在这种消化缓冲液中，将样品在37°C静置15分钟以允许消化发生。为使用纳米孔或凝胶分析分子，从珠中移出转化的DNA。这通过将固定的样品悬浮在95%甲酰胺缓冲液中并加热至95°C持续10分钟实现。样品随后在变性凝胶上运行(图2b和图7)以验证转化。图7显示了该过程的一些关键阶段的变性凝胶(这里为清晰起见，仅显示仅C端模板)。这种凝胶使用SYBR Green II (Invitrogen)染色。该凝胶显示:Α·原始DNA模板分子。B.作为参考所显示的线性150聚体ssDNA。C.作为参考所显示的环状150聚体DNA。D.使用BseGl线性化后转化的产物。E.在线性化之前转化的环状产物。这些结果显示在杂交步骤、连接步骤和消化步骤后延长的分子长度。用于环状DNA转化法(CDC)的原理验证的DNA序列下文是分子信标的序列，所述分子信标用来验证本实施例中前文所述的转化产物的身份。下文的全部信标序列均由Eurogentec NA SanDiego合成A.与 “I” 比特互补的 16 聚体。5’ -TAAGCGTACGTGCTTA-3’ (SEQID NO. 13)。这个序列具有5’胺修饰，并且ATT0647N(Atto-Tec)染料在5’末端偶联。对于纳米孔光学读出实验，合成了在3’末端带有粹灭剂(BHQ-2, Biosearch Technologies)的相同寡核苷酸(分子信标)。B.与 “O” 比特互补的 16 聚体5’ -CCTGATTCATGTCAGG-3’ (SEQID. NO. 14)。这个
33序列具有5’胺修饰，并且ATT0488 (Atto-Tec)染料在5’末端偶联。对于纳米孔光学读出实验，合成了在3’末端带有粹灭剂(BHQ-2, Biosearch Technologies)的相同寡聚物，ATT0680 (Atto-Tec)染料在5’末端偶联。C.与“01”序列互补的 32 聚体5’-CCTGATTCATGTCAGGTAAGCGTACGTGCTTA-3’ (SEQID NO. 15)。这个序列具有5’胺修饰，并且ATT0647N(Atto-Ttec)染料在5’末端偶联。D.与“10”序列互补的 32 聚体5’-TAAGCGTACGTGCTTACCTGATTCATGTCAGG-3’ (SEQID NO. 16)。这个序列具有5’胺修饰，并且TM R(INVITROGEN )染料在5’末端偶联。通过从磁珠中取出反应产物后分析它们，发明人充分验证了 CDC的可行性。图2b的左小图显示含有一轮转化后的产物的变性凝胶(SM(脲))。观察到4种不同模板中的每一种的>50%延长约50nt(100至约150nt),这表明模板与探针成功连接。为证明每种情况下使用了正确探针，合成如下4种类型的寡核苷酸，也称作分子信标1)带有红色荧光团的与“I”比特互补的16聚体；2)带有蓝色荧光团的与“O”比特互补的16聚体；3)带有绿色荧光团的与“10”双比特序列互补的32聚体；和4)带有红色荧光团的与“01”互补的32聚体。前两种寡核苷酸的混合物与每种CDC产物杂交，并且作为对照，与全部4种初始模板杂交。在凝胶分离后，使用3色激光扫描仪实施图像分析并且在图2c中显示。将颜色转换成图中的灰度级。仅观察到“A”产物的一个红色条带，并且仅观察到“C”产物的一个蓝色条带，分别编码为“11”和“00” (泳道2和泳道3)。其他两种产物“G”和“T”同时显示红色条带和蓝色条带，因为它们分别由“ 10”和“01”编码(泳道4和泳道5)。为区分转化的“G”和“T”，将它们与前述两种32聚体寡核苷酸杂交。仅“G”显示以绿色荧光团标记的条带，其对应于“10”代码(泳道6)并且仅“T”显示以红色荧光团标记的条带，其对应于“01”代码(泳道7)。对照显示，模板本身不与任何标记的分子信标杂交，并且标记的分子信标本身不在凝胶中显示，因为与 150nt产物相比，它们太短(泳道1、8和9)。这些结果结论性地显示，单个⑶C循环产生具有正确转化代码的纯产物。发明人的方法的第二步骤使用固态纳米孔将杂交的分子信标剥离转化的ssDNA。这需要使用小于2nm范围的孔，因为双链DNA(dsDNA)的截面直径是2. 2nm19。DNA分子进入这类小孔的可能性比它们进入较大孔的可能性小得多9’13，这需要使用更多的DNA量。另外，制造小孔带来许多技术难题，因为存在很小的容错性，并且困难对于高密度纳米孔阵列而言递增。发现3-5nm大小的“大体积基团”(例如，蛋白质或纳米粒子)与分子信标共价连接有效地将复合物的分子截面增加至5_7nm,从而允许使用尺寸范围3_6nm的纳米孔。这增加DNA分子的捕获率10倍或更多，并且大大促进纳米孔阵列的制造过程。出于概念验证，将抗生物素蛋白(4. 0X5. 5X6. Onm)2(1分子与含有荧光团-猝灭剂配对的生物素酰化分子信标(ATT0647N-BHQ2，缩写为“A647-BHQ”)连接。这种信标和类似构建的在一个末端含有猝灭剂并且在另一个末端不含荧光团的分子信标与靶ssDNA(’ I比特’样品)杂交。合成含有两个信标分子的相似复合物C 2比特’样品)，如图3a中示意性显示。大体积突光(BulkFluorescenc)研究为了检验BHQ-2的猝灭过程的效率，实施大体积荧光实验。对于每种荧光团，设计两种分子(见图8(a)和b)的插图)。一个分子由在其5’末端含有荧光染料的16聚体组成，与一种66聚体杂交。第二分子也含有相同的16聚体外加在其3’末端含有BHQ-2猝灭
34剂的第二 16聚体。这两种16聚体均与一种66聚体杂交。这两种16聚体分子杂交，从而在一个分子5’末端上的荧光探针靠近另一个分子3’末端上的BHQ-2猝灭剂。所用的两种荧光团是 ATT0647N (Atto-Tec)和 ATT0680 (Atto-Tec)。ATT0647N 在 644nm 处具有最大吸收峰并且在669nm处具有最大激发峰，而ATT0680在680nm处具有最大吸收峰并且在700nm处具有最大激发峰。对于每种分子，我们使用荧光光谱仪(JASCO FP-6500)来测量复合物的荧光发射。首先，用解猝灭的荧光团测量分子的发射光谱(图8的(a)和(b)中的顶部迹线)。随后，用猝灭剂-荧光团对测量分子的发射光谱(图8的(a)和(b)中的底部迹线)。每个实验含有约IOOnM的杂交样品。这些实验确定，这些大体积分子出现时，存在95-97%粹灭，如图8中所示。因此，大体积研究展示，当处于其杂交状态时，分子信标上的A647荧光团由相邻的BHQ猝灭剂猝灭约95%。鉴于这种极高猝灭效率，只有链分开发生时，如荧光团在杂交双链状态下不紧挨相邻猝灭剂时那样，才可以在单分子水平检测到荧光爆发。I比特样品和2比特样品的纳米孔实验均使用640nm激光实施并且使用EM-CXD照相机以每秒1，000帧成像。图3a显示两个样品的常见解链事件，I比特样品中每个复合物带一种信标，并且2比特样品中每个复合物带2种信标。电信号以黑色迹线显示并且在孔位置处随电信号同步测量的光信号以浅灰色或深灰迹线显示17。电流的骤降表示分子进入孔，并且在清除孔时，电信号返回开放孔高能态19。光信号清晰地显示分别针对I比特样品和2比特样品中大部分解链事件的一个或两个光子爆发。这是预期到的，因为荧光团在抵达孔之前遭猝灭并且在信标与模板解链后再次立即自我猝灭21。每个解链事件期间如电信号所限定的光强度的总和产生两个样品的泊松分布(图3b中的实线)，其中I比特样品的均值为I. 30+0. 06，并且2比特样品的双值是(2. 65+0. 08)(在每种情况下n>600个事件，误差代表标准偏差)。这证明，无论用来限定光子爆发的模型是什么，平均而言，对于I比特样品中的每个复合物出现单个解链事件并且对于2比特样品中的每个复合物出现2个解链事件。另外，采用强度阈值分析(在平均强度+2std处选择)，观察到几乎90%在I比特样品中收集的事件含有单荧光爆发，而在2比特样品中，大约80%所收集的事件显示2个这类爆发(图3c)。这份数据显示，在使用3-5nm孔进行的各个解链事件中，可以光学地区分I比特样品和2比特样品。为区别全部4种核苷酸，使用同时受相同的640nm激光激发的两种高量子产率荧光团A647 (ATT0647N)和A680 (ATT0680)，将当前系统从I颜色编码方案扩展至2颜色编码方案。将光发射信号使用二色镜劈分成通道I和通道2并且在相同的EM-C⑶照相机上并排成像。当两种荧光团的发射光谱重叠时，一部分A647发射“泄漏”入通道2中，并且一部分A680发射“泄漏”入通道I中。使用以A647或A680荧光团标记的I比特复合物进行两次校正测量(图4a)。在每种况下多于500个解链事件积累后，清楚地见到每个通道中与纳米孔的位置对应的不同单峰。通道I对通道2中的荧光强度的比率(R)对于A647样品是O. 2和并且对于A680样品是O. 4。在图4b和图4c中分别描述两份样品中每一个的代表性事件(来自多于500个事件)和相应的R分布。在每个移位事件期间观察到突出的荧光单峰(以黑色显示的电迹线)，强度大于基线荧光波动超过3倍。计数全部检测到的事件分别针对A647和A680产生R=O. 20+0. 06和O. 40+0. 05 (平均值+std)，与图4a中所示的累积荧光比率(针对全部事件)完全一致。R服从由图4c中实线拟合给出的高斯分布。这些对照测量显示，R可以用来确定各个荧光团的身份。使用图4c中给出的校正分布，测试了鉴定来自⑶C的含有4种2比特组合即11 (A) ,00(C)、01 (T)和10(G)(其中“O”和“I”分别对应于A647信标和A680信标)的产物的能力。对多于2000个解链事件的分析揭示R的双峰分布，两种模式在O. 21+0. 05和O. 41+0. 06处(图5b)，与校正测量完全一致(图4c)。将R〈0. 30的全部光子爆发划归为“0”，并且将R>0. 30的那些划归为“I”(O. 30是图5b中分布的局部最小值)。R的分布还用来计算错误分类的概率。这种进一步提供统计手段以校正两个通道用于最佳区分两种荧光团。图5c提供了描述全部4种DNA碱基的单分子鉴定的代表性双色荧光强度事件。双色鉴定的稳健性主要归功于光子爆发的优异信噪比和两个通道的荧光团强度比率之间的分离。开发了一种计算机算法以进行荧光信号中的自动化峰鉴定。这种算法滤出荧光信号中的随机噪声(例如，假峰电位)并且使用校正分布鉴定比特序列(图4c)，并且随后进行碱基调用(base calling)。这种算法输出两个确定性评分，一个评分用于比特调用并且一个评分用于碱基调用。在图5c中显示常见结果。在括号中显示从原始强度数据自动提取的每个碱基的确定性值(范围在O和I之间)。本发明基于当前广域光学的检测方案的主要优点之一在于简单性，其中可以平行地探测多个孔，最终能够进行高通量读出。作为平行读出的概念验证，在相同的SiN膜上制造相隔几个微米的多个3-5nm大小的纳米孔。在图6a中显示在3个独立实验中使用含有I个、2个或3个纳米孔的膜获得的累积荧光强度图像。与单孔实验相似，记录该模中来自全部孔的荧光爆发。每个实验中累积来自几千个解链事件的光子计数在每个像素处产生光子强度的表面图(图6a)。如该图中所反映，检测到的峰数目等于每块膜中所制造的孔数目。对于双孔膜，3个峰之间的距离是I. 8 μ m，并且对于三孔膜，2个峰之间的距离I. 8 μ m和7. 7 μ m,与制造过程期间测量的孔之间距离完全一致。这份数据为宽域光学检测方案的可行性提供直接证据。图6b展示了该系统探测单个膜中同时来自多个纳米孔的光子爆发的能力。4条代表性迹线显示使用I比特样品时从3个纳米孔(分别是绿色标记、红色标记和蓝色标记)中所探测到的电流(黑色)和光信号。在每个孔处每个分子的进入和解链是一个随机的过程。在本实验中所用的条件下，在多于3，000个解链事件中，涉及经两个孔同时进入的约50个分子。从全部孔中积累的电流迹线显示两个不同的封阻水平(blockade level)，从而显示在特定时刻占据的孔总数，而未透露哪个孔被占据的信息。另一方面，光学迹线清晰揭示占据的孔。这种最终将消除当本方法扩展至较大阵列时对电流测量的需要，并且完全依赖于光测量，从而简化仪器要求。讨论和结论单分子DNA测序方法已经开始改造遗传研究，对成本和通量提出更高要求3’22’23。预计随着测序成本进一步降低，人类基因组重测序将变得一种普及和可支付的医学诊断工具。这里，已经展示了具有低成本和超高通量潜力的一种单分子DNA测序新概念的可行性。在其最简单的形式下，使用二进制代码(每个碱基2比特)来代表与两个荧光团偶联并且由光学检测系统读出的DNA序列。在其当前阶段，当前系统可以读取每秒每个纳米孔50-250个碱基，这有利地与其他单分子方法可比较2’3。预计针对4种颜色的简易改造和使用优化的试剂将允许该系统实现读取每秒每个纳米孔多于500个碱基。最重要地，首次对基于纳米孔的方法展示了多孔读出的可行性。来自纳米孔阵列的光学检测随孔数目高效地改变，这不同于依赖统计学占有率的酶促方法。发明人的方法包括一个准备步骤以将靶DNA转化成可以用标准固态纳米孔直接 探测的较长DNA分子。尽管时间和复杂性增加，但是这个步骤带来以下优点1)不像其他测序平台那样24，这种方法不需要可能易出错的基于PCR的扩增步骤2。2)读出阶段不使用任何酶如聚合酶、连接酶或核酸外切酶，因此读出长度、速度和保真性不是酶限制性的4。3)可以通过调节物理参数如跨纳米孔电压或两个腔室中的离子强度，针对各个测序反应轻易调节读出速度。酶依赖性方法将需要所涉及酶的生物工程化。4)转化的DNA可以设计成几乎没有二级结构，这可以大大促进基因组中高度结构化和/或重复区域的测序，避免在读出阶段需要强变性剂。5)读出系统使用可以大量制造的尺寸范围3-6nm的标准固态纳米孔阵列。发明人的结果在此首次展示全固态DNA序列读出和大体积基团的掺入允许使用3-6nm孔。这些结果有力地说明使用固态纳米孔用于DNA测序的可行性。最近，许多出版物已经展示在固态材料制造相似规模的阵列25’26。参考文献I. 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明
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权利要求
1.一种用于纳米孔解链依赖性核酸测序的分子信标(MB)文库，所述文库包含多种MB，其中每种MB包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含(1)可检测标记；(2)可检测标记封阻剂；和(3)调节基团；其中所述MB能够与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交以形成双链(ds)核酸。
2.根据权利要求I所述的文库，其中所述寡核苷酸包含4-60个核苷酸。
3.根据权利要求I或2所述的文库，其中所述MB的寡核苷酸包含选自脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和磷酰二胺吗啉代寡聚物(ΡΜ0或Morpholino)的核酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的文库，其中所述可检测标记在所述寡核苷酸的一个末端上连接并且处在所述文库中全部寡核苷酸的相同末端上，其中在所述可检测标记不受所述封阻剂抑制时，所述可检测标记发射可以检测和/或测量的信号。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的文库，其中所述MB不与固相载体连接。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的文库，其中寡核苷酸上的所述可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团不干扰所述MB与代表单链核酸中A、U、T、C或G核苷酸的定义序列进行序列特异性互补杂交。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的文库，其中光学地检测到所述可检测基团的信号。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的文库，其中所述可检测基团是荧光团并且所述信号是突光。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的文库，其中所述可检测标记封阻剂是所述荧光团的猝灭剂。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的文库，其中所述可检测标记封阻剂还是调节基团。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的文库，其中所述调节基团位于所述寡核苷酸的5’末端或3’末端。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的文库，其中所述调节基团增加所述双链核酸在所述调节基团与所述寡核苷酸连接的点处的宽度到大于2. O纳米(nm)，其中通过所述MB与代表A、U、T、C或G的定义序列杂交形成所述双链核酸。
13.根据权利要求12所述的文库，其中所述双链核酸在所述调节基团与所述寡核苷酸连接的点处的宽度是约3-7nm。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的文库，其中所述调节基团选自纳米级粒子、蛋白质分子、有机金属粒子、金属粒子和半导体粒子。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的文库，其中所述调节基团是3-5nm。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的文库，其中当所述双链核酸经历纳米孔测序时，所述调节基团促进所述双链核酸的解链。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的文库，其中存在MB的两个或更多个种类，其中MB的每个种类具有不同的可检测标记。
18.一种使双链(ds)核酸解链用于纳米孔解链依赖性核酸测序的方法，所述方法包括a.将根据权利要求1-17所述的分子信标(MB)文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因所述调节基团的存在而形成，其中所述待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；b.使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl;并且c.施加跨纳米孔的电势以使杂交的分子信标与待测序的单链核酸解链。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述纳米孔尺寸允许待测序的单链核酸通过所述孔，但是不允许所述双链核酸通过所述孔。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中Dl大于2nm。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中Dl是3-6nm。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中D3大于2nm。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中D3是约3_7nm。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述杂交的单链核酸和MB之间的结合亲和力小于所述MB的调节基团和寡核苷酸的结合亲和力，由此当所述双链核酸试图在电势影响下通过纳米孔的开口时，所述单链核酸和MB之间的键而不是所述MB的调节基团和寡核苷酸之间的键破坏。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述待测序的核酸是DNA或RNA。
26.一种用于测定核酸的核苷酸序列的方法，其包括步骤a.将根据权利要求1-17所述的分子信标(MB)文库与待测序的单链核酸杂交，从而形成具有宽度D3的双链(ds)核酸，所述双链核酸因所述调节基团的存在而形成，其中所述待测序的单链核酸是包含代表A、U、T、C或G的定义序列的聚合物；b.使步骤a)中形成的双链核酸与具有宽度Dl的纳米孔开口接触，其中D3大于Dl；c.施加跨纳米孔的电势以使杂交的MB与待测序的单链核酸解链；并且d.当所述MB在所述孔处出现时与所述双链核酸分开时,检测由可检测标记从每种MB发射的信号。
27.根据权利要求26所述的方法，进一步包括将一串检测到的信号解码成所述核酸的核苷酸碱基序列。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述纳米孔尺寸允许待测序的单链核酸通过所述孔，但是不允许所述双链核酸通过所述孔。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中Dl大于2nm。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中Dl是约3_6nm。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中D3大于2nm。
32.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中D3是约3_7nm。
33.根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述杂交的单链核酸和MB之间的结合亲和力小于所述MB的调节基团和寡核苷酸的结合亲和力，由此当所述双链核酸试图在电势影响下通过纳米孔的开口时，所述单链核酸和MB之间的键而不是所述MB的调节基团和寡核苷酸之间的键破坏。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述待测序的核酸是DNA或RNA。
全文摘要
本文中提供了包含多种分子信标(MB)的文库，每种MB具有可检测标记、可检测标记封阻剂和调节基团。该文库与纳米孔解链依赖性核酸测序法一起使用。
文档编号G01N33/58GK102918166SQ201180024114
公开日2013年2月6日 申请日期2011年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者阿米特·梅勒, 阿龙·辛格 申请人:波士顿大学董事会
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