专利名称：微生物浓集方法以及用于其中的浓集剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于捕集或浓集微生物使得它们保持活力以检测或测定的方法。在其他方面，本发明还涉及用于制备适于实施这些浓集方法的浓集剂的方法(以及所得浓集剂和包括所得浓集剂的诊断试剂盒)。
背景技术：
由微生物污染导致的食源性疾病和医院内获得性感染为世界各地许多地方所关注。因此，测定多种临床样品、食品样品、环境样品或其它样品中细菌或其它微生物的存在 以确定所存在的微生物的种类和/或量常常是合乎需要的或是必要的。例如，可测定细菌DNA或细菌RNA，以甚至在存在其它细菌种类的情况下评估特定细菌种类的存在与否。然而，检测特定细菌的存在的能力至少部分取决于所分析的样品中细菌的浓度。可对细菌样品进行铺板或培养，以增加样品中细菌的数量，来确保足够的检测水平，但培养步骤通常需要大量的时间且因此会显著延缓评估结果。使样品中的细菌浓集可缩短培养时间或甚至消除对于培养步骤的需要。因此，已经开发了通过使用特定细菌菌株的特异性抗体(例如，为抗体包被的磁性颗粒或非磁性颗粒的形式)来分离(并由此浓集)该菌株的方法。然而，这些方法往往昂贵，而且对于至少一些诊断应用来说速度仍比期望的稍慢。也已经使用了非菌株特异性的浓集方法(例如，以获得对样品中所存在的微生物的较为一般性的评估)。在浓集了微生物混合群体之后，如果需要，通过使用菌株特异性探针来测定特定菌株的存在。已经通过基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法实现了微生物的非特异性浓集或捕集。涂覆壳聚糖的支持物已经用作非特异性捕集装置，并且用作微生物营养素的物质(例如，碳水化合物、维生素、铁螯合的化合物以及铁载体)也已经被描述为可用作配体以进行微生物的非特异性捕集。多种无机材料(例如，羟基磷灰石和金属氢氧化物)已经用于非特异性结合和浓集细菌。物理浓集方法(例如，过滤、色谱法、离心和重力沉降)已经被用于非特异性捕集，其使用和/或不使用无机结合剂。这些非特异性浓集方法在速度、成本(至少一些需要昂贵的设备、材料和/或受过训练的技术人员)、样品要求(例如，样品性质和/或体积限制)、空间要求、使用的方便性(至少一些需要复杂的多步骤方法)、现场使用的适合性和/或效果方面不同。非特异性浓集方法中的至少一些(例如，使用无机结合剂的方法中的至少一些)已涉及使用含阳离子的吸附缓冲剂作为添加剂来提高微生物结合。这些缓冲剂已通常以液体形式(例如，以水性盐溶液形式)进行使用。由于这些缓冲剂的现场使用需要运输和处理无菌液体或者在无菌条件下利用干燥盐现场重组缓冲剂，因此吸附缓冲剂的现场适用性已受到一定程度地限制。
发明内容
因此，我们认识到迫切需要用于快速检测病原微生物的方法。所述方法将优选不仅快速而且成本低、简单(不涉及复杂的设备或程序)和/或在多种条件下(例如，不同类型样品基质、不同细菌负荷以及不同样品体积)有效。简而言之，在一个方面，本发明提供了一种用于非特异性浓集样品中存在的微生物菌株(例如，细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)和细菌内生孢子的菌株)的方法，使得微生物保留活力以检测或测定一种或多种菌株。所述方法包括(a)提供吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，该吸附缓冲剂改性的无机浓集剂通过如下方法制备，其包括(I)使至少一种无机浓集剂(优选地，颗粒无机浓集剂)与至少一种含阳离子的盐溶液(优选地，水性)接触(优选地，通过洗涤)，以润湿无机浓集剂的至少一部分以及(2)干燥所得的至少部分润湿的无机浓集剂(优选地，通过加热至高于约25°C的温度);(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品(优选地，以流体形式);以及(c)使吸附缓冲剂改性的无机浓集剂与样品接触(优选地，通过混合)以使得至少一种微生物菌株的至少一部分结合至吸附缓冲剂改性的无机浓集剂或者被吸附缓冲剂改性的无机浓集剂捕集。含阳离子的盐溶液优选地包含至少一种多价阳离子(更优选地，至少一种二价阳离子；最优选地，至少一种选自二价钙离子、二价镁离子以及它们的组合的二价阳离子)。优选地，所述浓集方法还包括检测所述至少一种结合的微生物菌株的存在(例如，通过基于培养的检测方法、显微镜法/成像检测方法、基因检测方法、基于生物发光的检测方法或免疫检测方法)和/或离析(优选地，通过重力沉降)所得的结合微生物的浓集剂。所述方法还可任选包括将所得的经离析的浓集剂与所述样品分离。本发明的浓集方法不靶向特定的微生物菌株。相反，已经发现，可通过简单表面处理方法来令人惊讶地提高相对低成本、非特异性的无机浓集剂的捕集或结合效率，在所述简单表面处理方法中使该试剂接触吸附缓冲剂溶液并随后干燥。所得的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂可在捕集多种微生物方面比其未经处理的相应物至少稍微更加有效，并且一旦制备后就可现场(就地)使用，而无需运输和处理无菌液体缓冲溶液或者在无菌条件下现场重组缓冲溶液。吸附缓冲剂改性的无机浓集剂可用于以非菌株特异性方式浓集存在于样品(例如，食品样品)中的微生物菌株，使得可较容易且快速地测定一种或多种微生物菌株(优选地，一种或多种细菌菌株)。本发明的浓集方法相对简单且成本低(不需要复杂的设备或昂贵的菌株特异性材料)，并且可相对快速(相对于无浓集剂的对照样品，优选的实施例在少于约30分钟捕集存在于样品中的至少约70% (更优选地，至少约80%;最优选地，至少约90%)的微生物)。另夕卜，所述方法可对于多种微生物(包括(例如)革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者的病原体)和多种样品(不同的样品基质，并且与至少一些现有技术的方法不同，甚至微生物含量低和/或体积大的样品)有效。因此，本发明的方法的至少一些实施例可满足上述对于在多种条件下快速检测病原微生物的低成本、简单方法的迫切需要。
在另一方面，本发明提供了优选的浓集方法，其包括(a)提供吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，该吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过如下方法制备的，所述方法包括利用包含至少一种阳离子的至少一种吸附缓冲剂(盐或盐溶液)来处理(例如，通过多种已知的或将来开发的提供两种材料间接触的方法(包括本文所述的方法(包括物理气相沉积(PVD)技术))中的任何一种来进行接触)至少一种含硅的无机浓集剂，以提供具有如下表面组成的含硅的无机浓集剂(优选地，以显著干燥或不含溶剂的形式)，其中经X射线光电子能谱(XPS)测定，所述表面组成的至少一种阳离子原子(阳离子原子的总和；参见(例如)下文表4)与硅原子之比高于(优选地，高至少约50% ;更优选地，高至少约75% ;甚至更优选地，高至少约100% ;最优选地，高至少约200%或300%)相应的未经处理的含硅的无机浓集剂；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品；以及(c)使吸附缓冲剂改性的无机浓集剂与样品接触使得至少一种微生物菌株的至少一部分结合至吸附缓冲剂改性的无机浓集剂或被吸附缓冲剂改性的无机浓集剂捕集。可用的物理气相沉积(PVD)技术包括下文所述的那些(例如，关于娃藻土上的金属沉积)。 在其他方面，本发明还提供了制备可用于实施本发明的浓集方法的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂(以及由此制备的改性剂和包含改性剂的诊断试剂盒)的两种方法，所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过如下方法制备的，所述方法包括(a)使至少一种无机浓集剂(优选地，颗粒无机浓集剂)与至少一种含阳离子的盐溶液(优选地，水性)接触(优选地，通过洗涤)，以润湿无机浓集剂的至少一部分以及(b)干燥所得的至少部分润湿的无机浓集剂(优选地，通过加热至高于约25°C的温度)；或者作为另外一种选择，所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过如下方法制备的，所述方法包括利用包含至少一种阳离子的至少一种吸附缓冲剂(盐或盐溶液)来处理(例如，通过多种已知的或将来开发的提供两种材料间接触的方法(包括本文所述的方法(包括物理气相沉积(PVD)技术))中的任何一种来进行接触)至少一种含硅的无机浓集剂，以提供具有如下表面组成的含硅的无机浓集剂(优选地，以显著干燥或不含溶剂的形式)，其中经X射线光电子能谱(XPS)测定，所述表面组成的至少一种阳离子原子(阳离子原子的总和；参见(例如)下文表4)与硅原子之比高于(优选地，高至少约50% ;更优选地，高至少约75% ;甚至更优选地，高至少约100% ;最优选地，高至少约200%或300%)相应的未经处理的含硅的无机浓集剂；在每种情况下均具有如下前提条件，即所述制备方法是在基本上不存在含微生物的样品的情况下实施的(即，在使无机浓集剂接触包含至少一种微生物菌株的样品之前；因此，无机浓集剂基本上由至少一种无机材料组成)。可用的物理气相沉积(PVD)技术包括下文所述的那些(例如，关于硅藻土上的金属沉积)。
具体实施例方式在以下详细说明中，描述了各组数值范围(例如，特定部分中的碳原子数的数值范围、特定组分的量的数值范围等等)，并且在每组数值范围内，范围的任何下限可与范围的任何上限配对。这些数值范围另外指包括涵盖在该范围内的所有数值(例如，I至5包括I、I. 5,2,2. 75,3,3. 80、4、5 等等)。如本文所用，术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。
术语“优选的”和“优选地”是指本发明的实施例在某些情况下可提供一定的益处。然而，其他实施例在相同或其他情况下也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其他实施例是不可用的，且并非意图将其他实施例排除在本发明范围之外。当术语“包含”及其变型型式出现在说明书和权利要求书中时，这些术语不具有限制性含义。本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。因此，例如，疑似包含“一种”目标微生物的液体样品可被理解为是指该液体样品可包含“一种或多种”目标微生物。 上述“发明内容”部分并非旨在描述本发明的每个实施例或每种实施方式。以下具体实施方式
更具体地描述了示例性实施例。在整个具体实施方式
中，通过实例的列表提供指导，这些实例可以各种组合使用。在每种情况下，所述列表仅用作代表性的组类，并且不应解释为排他性列表。定义本专利申请中所用的“浓集剂”是指结合微生物的材料或组合物(优选地，具有至少约60% ;更优选至少约70% ;甚至更优选至少约80% ;最优选至少约90%的微生物捕集或结合效率)；“培养装置”是指可用于在将允许至少一个细胞发生分裂的条件下繁殖微生物的装置(优选地，培养装置包括用于降低或最小化偶发污染可能性的壳体和/或支持微生物生长的营养物质源);“检测”是指鉴定微生物的至少一种组分，由此确定微生物的存在。“基因检测”是指对衍生自靶微生物的遗传物质组分如DNA或RNA的鉴定。“免疫检测”是指对衍生自靶微生物的抗原物质如蛋白质或蛋白多糖的鉴定。“微生物”是指具有适于分析或检测的遗传物质的任何细胞或粒子(包括(例如)细菌、酵母菌、病毒和细菌内生孢子);“微生物菌株”是指可通过检测方法区分的特定类型的微生物(例如，不同属的微生物，属内不同种的微生物或种内不同分离物的微生物);“样品”是指所采集的(例如，待分析的)物质或材料；“样品基质”是指除微生物之外的样品组分；并且“靶微生物”是指需要检测的任何微生物。无机浓集剂适用于实施本发明的方法的浓集剂包括能够结合微生物的那些无机材料或组合物。相对于不含浓集剂的相应对照样品而言，优选的是，无机浓集剂可捕集或结合存在于样品中的微生物的至少约60% (更优选地，至少约70% ;甚至更优选地，至少约80% ;最优选地，至少约90%)。合适的无机材料包括金属氧化物、金属硅酸盐(例如，硅酸镁)、金属铝硅酸盐、二氧化娃、金属碳酸盐(例如，碳酸1丐)、金属磷酸盐(例如，轻基磷灰石)、娃藻土、表面改性的硅藻土等等以及它们的组合。如果需要，可使用这些无机材料的含涂层粒子(例如，包含磁芯和无机表面涂层的粒子)。
优选的无机材料包括含硅的无机材料(例如，金属硅酸盐、金属铝硅酸盐、二氧化硅、硅藻土、表面改性的硅藻土等等以及它们的组合)以及它们的组合。更优选的无机材料包括金属硅酸盐；金属铝硅酸盐；二氧化硅；硅藻土 ；经金属氧化物、金、或钼改性的硅藻土 ；以及它们的组合。经金属氧化物改性的(优选地，经二氧化钛或氧化铁改性的)的硅藻土、金属招娃酸盐、无定形金属娃酸盐(优选地，无定形娃酸镁；更优选地，无定形、球化娃酸镁)以及它们的组合为甚至更优选的(其中无定形金属硅酸盐及其组合为甚至更优选的；并且无定形、球化娃酸镁为最优选的)。优选地，无机浓集剂为颗粒形式，更优选的是包含微粒。微粒优选具有约I微米(更优选地，约2微米；甚至更优选地，约3微米；最优选地，约4微米)至约100微米(更优选地，约50微米；甚至更优选地，约25微米；最优选地，约20微米)范围内的粒度；其中任何下限可与上述范围中的任何上限配对。使用上述浓集剂进行的浓集或捕集通常不特异性针对任何特定菌株、种或类型的微生物，并因此提供对样品中微生物全体群落的浓集。然后，可使用任何已知的光学检测方法用菌株特异性探针从捕集的微生物群落中检测特定的微生物菌株。当分散于或悬浮于水系中时，无机材料显示具有材料和水系pH特征性的表面电荷。整个材料-水界面上的电势称为电势”，其可通过电泳迁移率(即，材料颗粒在设置于水体系中的带电电极之间移动的速率)进行计算。优选地，无机浓集剂在约7的pH下具有负;电位。金属硅酸盐适用于实施本发明的方法的金属硅酸盐浓集剂包括金属的无定形硅酸盐，金属例如镁、钙、锌、铝、铁、钛等等(优选地，镁、锌、铁和钛；更优选地，镁)以及它们的组合。优选的是至少部分熔融颗粒形式的无定形金属硅酸盐(更优选地，无定形的球化金属硅酸盐；最优选地，无定形的球化硅酸镁)。金属硅酸盐为已知的并且可通过已知方法进行化学合成或者通过开采和加工天然存在的原始矿石获得。无定形、至少部分熔融颗粒形式的金属硅酸盐可通过下述已知方法中的任何一种来制备，所述已知方法为在可控条件下熔融或软化相对小的进料粒子(例如，平均粒度至多为约25微米)以制备大致椭圆形或球形粒子(即，具有通常为大致圆形且不含尖角或尖锐边缘的放大二维图像的粒子，包括真正或基本上圆形和椭圆形的形状以及任何其他的圆形或弯曲形状)。这种方法包括原子化、火抛光、直接熔融等等。优选方法为火焰熔融，其中通过直接熔融或火抛光固体进料粒子形成至少部分熔融的、基本上玻璃状的粒子(例如，如同描述于美国专利号6，045，913 (Castle)的方法，其说明书以引用方式并入本文中)。最优选地，这种方法可通过将无规则形状进料粒子的相当大一部分(例如，约15至约99体积％ ;优选地，约50至约99体积％ ;更优选地，约75至约99体积％ ;最优选地，约90至约99体积％)转换成大致椭圆形或球形的粒子而用于制备无定形的球化金属硅酸盐。一些无定形金属硅酸盐为市售的。例如，无定形、球化硅酸镁可商购获得以用于化妆品制剂中(例如，以 3M Cosmetic Microspheres CM-111 得自 3M 公司(St. Paul, MN))。无定形金属硅酸盐浓集剂还可包括其他材料(包括金属(例如，铁或钛)的氧化物、结晶金属硅酸盐、其他结晶材料等等)。然而，浓集剂优选基本上不含结晶二氧化硅。适用于实施本发明的方法的尤其优选的浓集剂包括含有无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成的那些浓集剂，所述表面组成具有的金属原子与硅原子之比小于或等于约0. 5 (优选地，小于或等于约0. 4 ;更优选地，小于或等于约0. 3 ;最优选地，小于或等于约0.2)，如通过X射线光电子能谱(XPS)所测定。这种浓集剂包括描述于美国临时专利申请号60/977，180 (3M Innovative Properties公司)中的那些，其中浓集剂及其制备方法的描述以引用方式并入本文中。优选地，尤其优选的浓集剂的表面组成还包括平均至少约10原子％的碳(更优选地，平均至少约12原子％的碳；最优选地，平均至少约14原子％的碳)，如通过X射线光电子能谱(XPS)所测定。XPS是一种可测定样品表面的最外侧约3至10纳米(nm)的元素组成并且对周期表中除氢和氦之外的所有元素均敏感的技术。XPS是一种定量技术，对于大多数原子而言检测极限在0. I至I原子％浓度范围。XPS的优选表面组成评价条件可包括相对于接受立体角为±10度的样品表面测得的90度的飞离角。这种优选的金属硅酸盐浓集剂与(例如)普通金属硅酸盐(例如普通滑石)相比可具有带更高负电的(电位。然而令人惊讶地是，浓集剂比滑石粉更有效地浓集表面通常趋 于带负电的微生物(如细菌)。优选的是，这种浓集剂在约7的pH下具有负(电位(更优选地，在约7的pH下具有约-9毫伏至约-25毫伏范围的Smoluchowski ;电位；甚至更优选地，在约7的pH下具有约-10毫伏至约-20毫伏范围的Smoluchowski ;电位；最优选地，在约7的pH下具有约-11毫伏至约-15毫伏范围的Smoluchowski ;电位)。表面改件的硅藻土适用于实施本发明的方法的表面改性的硅藻土包括下述物质，所述物质包括在其表面的至少一部分上具有表面处理剂的硅藻土，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包括金属氧化物(优选地，二氧化钛或氧化铁)、细纳米级金或钼、或者它们的组合。这种浓集剂包括描述于美国临时专利申请号60/977，200(3M Innovative Properties公司)中的那些，其中所述浓集剂及其制备方法的描述以引用方式并入本文中。表面处理剂还优选包括选自以下物质的金属氧化物氧化铁、氧化锌、氧化铝等等以及它们的组合(更优选地为氧化铁)。尽管已知例如金之类的贵金属具有抗微生物特性，但令人惊讶的是，用于本发明的方法中的含金浓集剂不仅可有效用于浓集微生物而且还可使得它们保留活性，以用于检测或分析。可用的表面改性剂包括细纳米级金；细纳米级钼；与至少一种金属氧化物(优选二氧化钛、氧化铁或它们的组合)结合的细纳米级金；二氧化钛；与至少一种其他金属氧化物(即，除二氧化钛之外)结合的二氧化钛；氧化铁；与至少一种其他金属氧化物(即，除氧化铁之外)结合的氧化铁；等等；以及它们的组合。优选的表面改性剂包括细纳米级金；细纳米级钼；与至少氧化铁或二氧化钛结合的细纳米级金；二氧化钛；氧化铁；与至少氧化铁结合的二氧化钛；以及它们的组合。更优选的表面改性剂包括细纳米级金；细纳米级钼；与氧化铁或二氧化钛结合的细纳米级金；二氧化钛；与氧化铁结合的二氧化钛；氧化铁；以及它们的组合(甚至更优选地，细纳米级金；与氧化铁或二氧化钛结合的细纳米级金；与氧化铁结合的二氧化钛；二氧化钛；氧化铁；以及它们的组合)。氧化铁、二氧化钛以及它们的组合为最优选的。表面改性的硅藻土浓集剂中的至少一些与未经处理的硅藻土相比具有带至少稍高正电的(电位，并且浓集剂可令人惊讶地比未经处理的硅藻土能显著更有效地浓集诸如细菌之类的微生物(其表面通常往往带负电)。优选的是，这种浓集剂在PH值为约7时的^电势为负4电势(更优选地在pH值为约7时的4电势为在约-5毫伏至约-20毫伏的范围内；甚至更优选地在pH值为约7时的(电势为在约-8毫伏至约-19毫伏的范围内；最优选在pH值为约7时的;电势为在约-10毫伏至约-18毫伏的范围内)。包含细纳米级金或钼的表面改性的硅藻土浓集剂可通过这样制备通过物理气相沉积(任选地，通过氧化气氛中的物理气相沉积)将金或钼沉积在硅藻土上。如本文所用，术语“细纳米级金或钼”是指使所有维度上的尺寸均为小于或等于5纳米(nm)的金或钼团粒(例如，粒子或原子簇)。优选地，所沉积金或钼的至少一部分在所有维度(例如，粒径或原子簇直径)上的平均尺寸范围为至多(小于或等于)约IOnm (更优选地，至多约5nm;甚至更优选地，至多约3nm)。在最优选的实施例中，金的至少一部分是超纳米级的(S卩，使至少两个维度上的尺寸为小于0. 5nm，并且使所有维度上的尺寸为小于I. 5nm)。如本领域所熟知，可通过透射电子显微镜(TEM)分析法来测定单个金或钼纳米粒子的尺寸。 硅藻土为由硅藻(一种海洋栖居微生物)残余物产生的天然硅土材料。因此，其可得自天然来源并且也为市售的(例如，得自Alfa Aesar (Ward Hill, MA),它是JohnsonMatthey Company旗下的公司)。娃藻土粒子通常具有小的、开放的二氧化娃网络(形式为对称立方体、圆柱体、球体、板、矩形盒等等)。这些粒子的孔结构通�？晌灾鹊慕峁�。硅藻土可以原始开采材料或以纯化和任选碾磨的粒子进行使用。优选硅藻土为碾磨粒子形式，该粒子的直径尺寸为在约I微米至约50微米(更优选地约3微米至约10微米)的范围内。可任选将硅藻土在使用之前进行热处理，以去除有机残余物的任何遗迹。如果使用热处理，则优选热处理为500°C或更低，因为较高温度可产生不利地高含量的结晶二氧化硅。提供于硅藻土上的金或钼的量可在宽范围内变化。由于金和钼的价格昂贵，因此期望使用不超过实现所需浓集活性程度而所需要的合理量。另外，因为纳米级金或钼在使用PVD沉积时可具有高度移动性，如果使用过多的金或钼，则活性可因金或钼中的至少一些聚结成较大团粒而损失。
由于这些原因，基于硅藻土和金或钼的总重量，硅藻土上的金或钼的载重优选为在约0. 005重量％ (更优选地为0. 05重量％)至约10重量％、更优选地为约0. 005重量％(甚至更优选地为0. 05重量％)至约5重量％、并且甚至更优选地为约0. 005重量％(最优选地为0. 05重量％)至约2. 5重量％的范围内。可以通过PVD技术(例如，通过溅射)沉积金和钼，以在载体表面上形成浓集活性的细纳米级粒子或原子簇。据信，金属主要以元素形式沉积，但也可存在其它氧化态。除了金和/或钼之外，还可在同一硅藻土载体和/或与含金和/或含钼载体混合的其他载体上提供一种或多种其他金属。这种其它金属的实例包括银、钯、铑、钌、锇、铜、铱等等以及它们的组合。如果使用这些其它金属，则可从与所使用的金或钼源靶相同或不同的靶源将它们共沉积到载体上。或者，可在沉积金和/或钼之前或之后将这些金属设置在载体上。可在沉积金和/或钼之前有利地将需热处理活化的金属施加到载体上并进行热处理。
物理气相沉积是指金属从含金属的源或靶向载体介质的物理转移。可以各种不同的方式进行物理气相沉积。代表性的方法包括溅射沉积(优选的)、蒸镀和阴极电弧沉积。可使用这些或其他PVD方法中的任何者来制备用于实施本发明的方法的浓集剂，但PVD技术的特性可赋予所得活性。可通过利用目前使用的或将来为此目的开发的任何类型的设备来实施PVD。为了确保载体表面得到足够的处理，优选在充分混合(例如，翻滚、流化、碾磨等)待处理的载体介质的同时进行物理气相沉积。美国专利No. 4，618，525(Chamberlain等人)中描述了用于PVD沉积的翻滚粒子的方法，其说明书以引用方式并入本文中。当在细粒子 或细粒子聚集体(例如，平均直径为小于约10微米)上实施PVD时，优选在PVD过程中的至少一部分期间对载体介质既进行混合又进行粉碎(例如，研磨或碾磨到一定程度)。可以在宽范围内的基本上任意所需的温度条件下进行物理气相沉积。然而，如果在相对较低的温度下沉积金属(例如，温度低于约150°C、优选低于约50°C、更优选在环境温度(例如，约20°C至约27°C)或更低)，则沉积的金属可具有更大的活性(也许是因为缺陷更多和/或迁移率及聚结程度更低)。基于有效性和经济性的考虑，环境条件下的操作通�？梢允怯叛〉模蛭诔粱讨胁恍枰屑尤然蚶涠�。可在惰性溅射气体气氛中(例如，在氩、氦、氙、氡或它们中的两者或更多者的混合物(优选氩)中)进行物理气相沉积，并且可任选在氧化气氛中进行物理气相沉积。氧化气氛中优选包含至少一种含氧气体(更优选地含氧气体选自氧、水、过氧化氢、臭氧以及它们的组合；甚至更优选地含氧气体选自氧、水以及它们的组合；最优选的是氧)。氧化气氛中还包含惰性溅射气体，如氩、氦、氙、氡或它们中的两种或更多种的混合物(优选为氩)。在PVD过程期间，真空室中的(所有气体的)总气压可以为约I毫托至约25毫托(优选为约5毫托至约15毫托)。基于真空室中所有气体的总重量，氧化气氛中可以包含约0.05重量％至约60重量％的含氧气体(优选为约0. I重量％至约50重量％ ;更优选地为约0. 5重量％至约25重量％)。可任选将硅藻土载体介质在金属沉积之前进行煅烧，但这会增加其结晶二氧化硅含量。由于金和钼在通过PVD沉积时立即具有活性，因此通常不需要在金属沉积之后进行热处理，这与通过一些其他方法的沉积不同。然而如果需要，也可实施这种热处理或煅烧，以提闻活性。一般来讲，热处理可涉及在约125°C至约1000°C范围的温度下对载体加热约I秒至约40小时、优选为约I分钟至约6小时的时间段，加热可以在任何合适的气氛中进行，例如空气、惰性气氛(例如氮、二氧化碳、氩)、还原性气氛(例如氢)等等。采用的具体热条件可取决于包括载体性质在内的各种因素。—般来讲，热处理可以在低于使载体组分发生分解、降解或者说是不当地受到热损害的温度下实施。根据例如载体性质、金属量等等之类的因素，如果在过高的温度下对系统进行热处理，则活性可能会在某些程度上损失。包含金属氧化物的表面改性的硅藻土浓集剂可通过这样制备通过水解可水解金属氧化物前体化合物将金属氧化物沉积于硅藻土上。合适的金属氧化物前体化合物包括可被水解以形成金属氧化物的金属络合物和金属盐。可用的金属络合物包括下述络合物，其具有醇盐配体、过氧化氢配体、羧酸盐官能化配体等等以及它们的组合。可用的金属盐包括金属硫酸盐、硝酸盐、卤化物、碳酸盐、草酸盐、氢氧化物等等以及它们的组合。使用金属盐或过氧化氢或羧酸盐官能化配体的金属络合物时，可通过化学方法或热方法中的任一者来诱导水解。在化学诱导水解中，可将金属盐以溶液形式引入硅藻土的分散体中，并且通过加入碱溶液来增加所得组合的PH值直至金属盐作为金属的氢氧化物络合物沉淀于硅藻土上。合适的碱包括碱金属和碱土金属的氢氧化物和碳酸盐、铵和烷基铵的氢氧化物和碳酸盐等等以及它们的组合。金属盐溶液和碱溶液的浓度通�？晌�0. IM至约2M。优选在搅拌(优选快速搅拌)硅藻土分散体的情况下实施将金属盐加入至硅藻土 中。可将金属盐溶液和碱溶液单独(以任一顺序)或同时引入到硅藻土分散体中，以使所得金属氢氧化物络合物与硅藻土的表面进行优选基本上均匀的反应。在反应期间可任选加热反应混合物，以加快反应速度。通常，所添加的碱量可等于金属的摩尔数乘以金属盐或金属络合物上的非氧或非羟基抗衡离子数。或者，当使用钛或铁的盐时，可热诱导金属盐水解以形成金属的氢氧化物络合物并且与硅藻土的表面相互作用。在这种情况下，通常可将金属盐溶液加入到下述硅藻土分散体(优选地,搅拌分散体)中，所述硅藻土分散体已加热至足够高的温度(例如,大于50°C )以促进金属盐的水解。优选的是，温度为约75°C至100°C，但如果在高压釜设备中进行反应，则可使用较高的温度。当使用金属醇盐络合物时，可诱导金属络合物水解以通过金属醇盐在醇溶液中的部分水解来形成金属的氢氧化物络合物。在存在硅藻土的情况下，金属醇盐溶液的水解可产生沉积于硅藻土表面上的金属氢氧化物物质。或者，在存在硅藻土的情况下，可通过使金属醇盐在气相中与水反应来将金属醇盐水解并沉积到硅藻土表面上。在这种情况下，可在(例如)流化床反应器和转筒式反应器中的任一者中于沉积期间搅动硅藻土。在存在硅藻土的情况下，金属氧化物前体化合物进行上述水解之后，可通过沉淀或通过过滤或通过其他已知的技术来分离所得的经表面处理的硅藻土。可将分离产物通过用水洗涤来纯化并随后进行干燥(例如，在50°C至150°C)。虽然通常使经表面处理的硅藻土在干燥之后进行官能化，但可任选在通常不损失官能性的情况下通过在空气中加热至约250°C至650°C进行煅烧来去除挥发性副产物。当将金属醇盐用作金属氧化物前体化合物时，优选进行该煅烧步骤。通常，利用铁的金属氧化物前体化合物时，所得的表面处理包括氧化铁纳米颗粒。当氧化铁与硅藻土的重量比为约0. 08时，X射线衍射图案(XRD)不显示明确的氧化铁材料的存在。相反，在3.80A、3.68A和2.94A下观察到额外的X射线反射。该材料的TEM检查显示出硅藻土表面相对均匀地涂布有球形纳米颗粒状氧化铁材料。氧化铁材料的微晶尺寸为小于约20nm,其中大部分微晶的直径为小于约10nm。这些球形微晶在娃藻土表面上的堆积具有致密的外观，并且硅藻土表面由于这些微晶的存在而看起来为粗糙的表面。通常，利用钛的金属氧化物前体化合物时，所得的表面处理包括纳米颗粒二氧化钛。当将二氧化钛沉积至硅藻土上时，所得产物在煅烧至约350°C之后的XRD可显示出存在锐钛型二氧化钛的小微晶。利用相对较低的钛/硅藻土比率时或在其中使用钛和铁氧化物前体的混合物的情况下，通过X射线分析通常观察不到锐钛的迹象。
由于二氧化钛为熟知的强效光氧化催化剂，因此本发明中的经二氧化钛改性的硅藻土浓集剂可用于浓集微生物以进行分析，并且随后还可任选用作光活化剂以杀灭残余微生物和去除使用之后的非所需有机杂质。因此，经二氧化钛改性的硅藻土可分离待分析的生物材料并随后进行光化学清洁以重复利用。另外可将这些材料用于其中可能需要微生物去除以及抗微生物效果的过滤应用中。
_4] 吸附缓冲剂改性的无机浓集剂的制备可通过包括如下工序的方法来制备吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，所述工序包括(a)使上述无机浓集剂中的至少一种与至少一种含阳离子的盐溶液(优选地，水性)接触，以润湿无机浓集剂的至少一部分以及(b)干燥所得的至少部分润湿的无机浓集剂。适于用作含阳离子的盐溶液的吸附缓冲剂溶液包括如下溶液，所述溶液包含至少一种单价或多价阳离子(优选地，至少一种多价阳离子；更优选地，至少一种二价阳离子；最优选地，至少一种 选自二价钙离子、二价镁离子以及它们的组合的二价阳离子)。阳离子优选为金属阳离子，但也可使用其他阳离子(例如，铵)。例如，可用的吸附缓冲剂可包括下述盐，例如氯化镁(MgCl2)、氯化钙(CaCl2)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸钙(CaSO4)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、磷酸氢钾(K2HPO4)、氯化亚铁(FeCl2)、氯化镧(LaCl3)、氯化铝(AlCl3)等等以及它们的组合。可通过将一种或多种盐与极性足以溶解该盐的至少一种溶剂混合来制备吸附缓冲剂溶液。优选地，溶剂为水。如果需要，可通过加热和/或通过搅拌或搅动来促进盐溶于溶剂中。溶解之后，可将所得溶液进行灭菌(优选地，通过过滤灭菌；更优选地，通过使用孔尺寸为约0. 22微米的标准微生物过滤器的过滤灭菌)。盐(在溶剂中)的浓度可大幅变化，这取决于盐的特性和溶剂以及无机浓集剂的所需捕集增强水平，其中至多约10毫摩尔/升(mM/L)(优选地，约0. ImM/L至约5mM/L)的浓度为典型的。盐溶液的pH可在约6. 0至约7. 5的范围内，但约6. 5至约7. 5的相对中性pH值通常为优选的(更优选地，约6. 8至约7. 3 ;更优选地，约7. 2)。优选的吸附缓冲剂包含至少一种选自镁阳离子(Mg++)、钙阳离子(Ca++)、钠阳离子(Na+)、钾阳离子(K+)、亚铁阳离子(Fe++)、镧阳离子(La+++)、铝阳离子(Al+++)以及它们的组合的阳离子(更优选地，至少一种选自镁阳离子、钙阳离子、钠阳离子、钾阳离子以及它们的组合的阳离子；甚至更优选地，至少一种选自镁阳离子、钙阳离子、钾阳离子以及它们的组合的阳离子；最优选地，至少一种选自镁阳离子、钙阳离子以及它们的组合的阳离子)。可用于本发明的方法中的尤其优选的吸附缓冲剂溶液在每升水中包含5mM KClUmM CaCl2,0. ImMMgCl2 和 ImM K2HPO4 并且具有 7. 2 的 pH。使无机浓集剂与吸附缓冲剂接触的上述参考步骤可通过提供多种已知或将来开发的两种材料间接触的方法中的任何一种来实现，所述方法包括下文在使浓集剂与样品相接触的相关部分中描述的那些。用于接触操作中的吸附缓冲剂的量可大幅变化，这取决于无机浓集剂的特性和量以及所需的捕集增强程度。吸附缓冲剂溶液的量可通常足以润湿无机浓集剂的至少一部分(例如，其暴露表面的至少一部分)。优选地，可润湿无机浓集剂的基本上整个暴露表面(例如，当需要最大捕集增强时)。无机浓集剂与吸附缓冲剂的接触操作优选通过利用缓冲溶液洗涤所述试剂至少一次(优选地，至少两次；更优选地，至少三次)来实现。例如，无机浓集剂的这种洗涤能有效地润湿无机浓集剂的基本上整个暴露表面并且可通过将所述试剂浸于合适容器(例如，试管)内的缓冲溶液中来实现。如果需要，可预洗涤所述试剂(例如，通过用水清洗)以在接触缓冲剂之前除去杂质。例如，可通过将颗粒无机浓集剂穿过一定体积的缓冲剂至少一次(例如，通过依赖重力沉降(例如)约10分钟的一段时间)来进行洗涤。可通过混合(例如，通过搅拌、摇动、或使用振动台)使得无机浓集剂颗粒反复经过或沉降穿过缓冲剂的大部分，来增强与缓冲剂的接触。混合可(例如)通过涡旋(例如，以最高速度持续一或两分钟)而为快速的或者可通过以“翻跟头”方式轻轻地翻转颗粒无机浓集剂和缓冲剂的组合来实现(例如，通过被构造为容纳试管或其他类型的反应容器并且以“翻跟头”方式缓慢地旋转试管或容器的装置)。可任选的是，可允许无机浓集剂在缓冲剂中浸泡(例如，环境温度下)所需时间段(例如，混合之后持续约5分钟的时间段)。因此，在洗涤无机浓集剂的实施过程中，混合(例如，搅动、振动、或搅拌)和/或浸泡为任选但优选的，以增加缓冲剂与浓集剂的接触。如果需要，可在无机浓集剂和缓冲剂的组合中包含一种或多种添加剂(例如，表面活性剂或润湿剂、分散剂等等)(例如，以有助于 分散和/或润湿所述无机浓集剂)。在接触或洗涤步骤之后，可将无机浓集剂优选地进行离析(例如，通过重力沉降或通过离心或过滤；优选地，通过离心)和/或与缓冲剂分离(例如，通过滗析或虹吸移除或分离所得上清液，以将无机浓集剂留在用于实施接触步骤的容器或管的底部)。然后可在环境温度(例如，约23°C)下或者在高温(例如，使用烘箱)下来干燥所得的至少部分润湿的无机浓集剂。优选地，在高于约25°C (更优选地，至少约50°C ;甚至更优选地，至少约70°C ;最优选地，至少约80°C )的温度下来实施干燥。干燥时间的间期可大幅变化，这取决于(例如)所用的干燥温度和至少部分润湿的无机浓集剂的量(例如，约I克至少部分润湿的试剂可在环境温度下干燥约48小时或更长时间，并且约5克至少部分润湿的试剂可在约80°C下干燥约5或6小时)。星显本发明的浓集方法可用于多种不同类型的样品，包括但不限于医学样品、环境样品、食品样品、饲料样品、临床样品和实验室样品以及它们的组合。医学或兽医样品可包括(例如)来自生物来源(例如，人或动物)的待测定以进行临床诊断的细胞、组织或流体。环境样品可为(例如)来自医学或兽医设施、工业设施、土壤、水源、食品制备区(食品接触和非接触区)、实验室或已潜在遭受生物恐怖的区域。优选的是食品加工、处理以及制备区样品，这是因为这些在细菌病原体导致的食品供应污染方面常常受到特别的关注。以液体形式或者以固体在液体中的分散体或悬浮液形式获得的样品可直接使用，或可进行浓集(例如，通过离心法)或稀释(例如，通过添加缓冲(控制pH的)溶液)。固体或半固体形式的样品可直接使用或可根据需要通过(例如)用流体介质(例如，缓冲溶液)洗涤或冲洗或者悬浮或分散于流体介质中的方法来提取。可从表面(例如，通过擦拭或冲洗)获取样品。优选地，样品为流体(例如，液体、气体或者固体或液体在液体或气体中的分散体或悬浮液)。可用于实施本发明的方法的样品的实例包括食品(例如，新鲜农产品或即食型午餐或“熟食”肉)、饮料(例如，果汁或碳酸饮料)、水(包括饮用水)和生物流体(例如，全血或其组分，例如血浆、富含血小板的血液级分、血小板浓缩液或浓集人类红细胞；细胞制剂(例如，分散的组织、骨髓抽吸物或椎体骨髓);细胞悬浮液；尿液、唾液和其他体液；骨髓；肺液；脑液；伤口渗出液；伤口活检样品；眼液；脊髓液等等)以及可使用已知程序(例如使用裂解缓冲液等等)形成的裂解制剂(例如细胞裂解物)等。优选的样品包括食品、饮料、水、生物流体以及它们的组合(其中食品、饮料、水以及它们的组合为最优选的)。样品体积可根据具体应用而不同。例如，当本发明方法用于诊断或研究应用时，所述样品的体积通常为微升范围(例如，10微升或更大)。当所述方法用于食品病原体检测分析或用于饮用水安全性检测时，样品的体积可通常为毫升至升的范围(例如，100毫升至3升)。在工业应用中，例如生物工艺或制药配方中，所述体积可为成千上万升。本发明的方法可从浓集状态的样品分离微生物，并且还可使得能从可对待使用的检测程序造成限制的样品基质组分分离微生物。在所有这些情况中，本发明的方法可伴随或替代其它的微生物浓集方法而使用。因此，任选地，如果需要另外的浓集，可在实施本发 明的方法之前或之后从样品培养培养物。腿可通过多种已知的或将来开发的提供两种材料间接触的方法中的任何一种来实施本发明的方法。例如，可将吸附缓冲剂改性的(处理的)的浓集剂添加至样品、或者可将样品添加至浓集剂。可将涂布有浓集剂的浸溃片浸于样品溶液中、可将样品溶液倾注到涂布有浓集剂的膜上、可将样品溶液倾注到涂布有浓集剂的导管或凹槽中、或者可使样品溶液穿过涂布有浓集剂的过滤器(例如，织造材料过滤器)。然而，优选地，在多种容器中的任何容器(任选地但也优选地，带盖的容器、闭合或密封容器，更优选地，带盖的试管、瓶子或罐)中合并(使用任何添加次序)浓集剂和样品。用于实施本发明的方法的合适容器将由具体样品决定，并且可在尺寸和性质上大不相同。例如，所述容器可为小容器，例如10微升容器(例如，试管)或较大的容器，例如100毫升或3升容器(例如，三角烧瓶或聚丙烯大口瓶)。直接接触样品的容器、浓集剂以及任何其他装置或添加剂可在使用前进行灭菌(例如，通过受控热、环氧乙烷气体、或辐射来进行)，以减少或防止任何可导致检测误差的样品污染。足以捕集或浓集特定样品的微生物以便成功检测的浓集剂的量是可变动的(取决于例如，浓集剂的性质和形式以及样品体积)，可由本领域技术人员容易地确定。例如，对于一些应用而言，每毫升样品10毫克浓集剂是实用的。如果需要，可通过将粒状浓集剂通过样品至少一次来实现接触(例如，通过依赖重力沉降(例如)约10分钟的一段时间)。可通过混合(例如,通过搅拌、摇动或使用振动台)使得浓集剂颗粒反复经过或沉降穿过样品的大部分，来增强接触。对于微升级的小体积(通常，小于0. 5毫升)来说，诸如通过涡旋或“章动”，混合可以是快速的，例如，如美国专利号5, 238,812 (Coulter等人)所述，将其说明内容以引用方式并入本文中。对于大于或等于
0.5毫升(通常0. 5毫升至3升)的较大体积来说，可通过以“翻跟头”的方式轻轻翻转粒状浓集剂和样品来实现混合，例如，如美国专利号5，576，185(Coulter等人)所述，将其说明内容以引用方式并入本文中。可借助于例如被设置成固定试管或其他类型反应容器并以“翻跟头”方式缓慢旋转该试管或容器的装置来实现所述翻转。可进行接触达所需的时间(例如，对于等于或小于约100毫升体积的样品，最多约60分钟的接触是有用的；优�。�15秒至约10分钟或更长时间；更优�。�15秒至5分钟)。
因此，在实施本发明方法中，混合(例如，搅动、振荡或搅拌)和/或孵育(例如，在室温下)是任选的但也是优选的，以增加微生物与浓集剂的接触。优选的接触方法包括将含微生物的样品(优选地，流体)与粒状浓集剂进行混合(例如，持续约15秒至约5分钟)和孵育(例如，持续约3分钟至约60分钟)。如果需要，可在浓集剂和样品的组合中添加一种或多种添加剂(例如，裂解试剂、生物发光测定试剂、核酸捕集试剂(例如，磁珠)、微生物生长培养基、缓冲液(例如，用于润湿固体样品)、微生物染色试剂、洗涤缓冲液(例如，用于洗除未结合材料)、洗脱剂(例如，血清白蛋白)、表面活性剂(例如，可得自Union Carbide Chemicalsand Plastics (Houston, TX)的Triton X-100非离子型表面活性剂)、机械磨蚀/洗脱剂(例如，玻璃珠)、吸附缓冲剂(例如，用于制备吸附缓冲剂改性的无机浓集剂的相同缓冲剂或不同缓冲剂)等等)。优选地，在未在浓集剂和样品的组合中引入吸附缓冲剂作为添加剂的情况下来实施样品接触步骤。如果需要，可将浓集剂(单独地或者与(例如)抗微生物材料或与载体材料(形式为液体(例如，水或油)、固体(例如，织物、聚合物、纸张、或无机固体)、凝胶、乳剂、泡沫、或糊齐U)结合)施用或者擦拭到非多孔或多孔的、固体的、经微生物污染的、或微生物可污染的材料或表面上(例如，用作“清洁”剂)。如果需要，可使用粘结剂、稳定剂、表面活性剂、或者其他特性表面改性剂。对于这种应用，可将浓集剂施用至织造或非织造织物并且可施用至一次性表面(例如，纸张、组织、棉签)以及多种吸收和非吸收材料。例如，可将浓集剂掺入到棉布或纸张载体材料内以用作“清洁”拭子。可将浓集剂施用至(例如，以包含载体材料的拭子或糊剂)(例如)家庭、日常护理、工业和医院环境中的固体表面以用于清洁玩具、设备、医疗装置、工作表面等等。当用于清洁或其他目的时，如果需要，可在单个步骤中利用浓集剂同时采集和接触样品。离析和/或分离任选地但也优选地，本发明的方法还包括离析所得的结合微生物的浓集剂。优选可通过至少部分依赖于重力沉降(重力沉淀，例如，经约5分钟至约30分钟的时间)实现这样的离析。然而，在一些情况下，可取的是加快离析(例如，通过离心或过滤)，或者采用任何所述离析方法的组合。本发明的方法还可任选地包括分离所得的结合微生物的浓集剂与样品。对于流体样品，这可涉及去除或分离因离析产生的上清液。可通过本领域中熟知的多种方法来实施上清液的分离(例如，通过滗析或虹吸，以将结合微生物的浓集剂留在用于实施本方法的容器或管的底部)。可任选的是，如果需要，可从浓集剂洗脱或分离(例如，通过使用牛血清白蛋白溶液或肉浸汁溶液以化学方式、或者通过温和的超声处理以物理方式)结合的微生物。本发明的方法可人工实施(例如，以批次方式)或可为自动的(例如，以能够进行连续或半连续处理)。捡Ii可通过使用本发明的方法来浓集以及任选且优选地检测多种微生物，包括(例如)细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒(包括无包膜和有包膜的病毒)、细菌内生孢子(例如，芽孢杆菌属(包括炭疽芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)和梭状芽孢杆菌(包括肉毒梭状芽孢杆菌、艰难梭状芽孢杆菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌))等等以及它们的组合(优选地，细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子、真菌以及它们的组合；更优选地，细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合；甚至更优选地，细菌、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合；甚至更优选地，革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、无包膜病毒(例如，诺罗病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、鼻病毒以及它们的组合)、细菌内生孢子以及它们的组合；最优选地，革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及它们的组合)。所述方法可用于检测病原体，这对于食品安全或对于医学、环境或反恐原因来说是重要的。所述方法尤其可用于检测病原性细菌(例如，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)以及多种酵母菌、霉菌和支原体(以及这些中的任何的组合)。待检测的靶微生物属包括(但不限于)李斯特菌属(Listeria)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭状芽抱杆菌属(Clostridium)、螺杆菌属(Helicobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、志贺氏菌属(Shigella)、链球菌 属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、博德特氏菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)等以及它们的组合。样品可含有多种微生物菌株，并且任何一种菌株可独立于任何其它菌株而被检测到。可作为检测靶的具体微生物菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(无害李斯特菌为替代物)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、葡萄球菌肠毒素亚种(Staphylococcal enterotoxin ssp)、錯状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthracis)、萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽抱杆菌(Clostridium diff icile)、坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等等以及它们的组合(优选地，金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌(无害李斯特菌为替代物)、大肠杆菌、铜绿假单胞菌以及它们的组合)。由浓集剂捕集或结合(例如，通过吸附)的微生物可通过基本上任何目前已知或将来开发的所需方法来检测。这类方法包括(例如)基于培养的方法(当时间允许时可为优选的)、显微镜法(例如，使用可用于观察标记有荧光染料的微生物的透射光显微镜或落射荧光显微镜)以及其它成像方法、免疫检测方法和基因检测方法。微生物捕集之后的检测方法可任选包括去除样品基质组分的洗涤、染色等等。免疫检测是对衍生自靶生物体的抗原物质的检测，该抗原物质通常是充当细菌或病毒颗粒的表面上的标志的生物分子(例如，蛋白质或蛋白多糖)。抗原物质的检测通�？赏ü固�、选自诸如噬菌体展示之类的过程的多肽或来自筛选过程的适体来进行。免疫检测方法是熟知的，并且包括(例如)免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可以多种方式(例如，通过用荧光染料、用量子点或用可产生化学发光的酶或有色底物来标记第一抗体或第二抗体，和使用读板机或侧流装置)来检测抗体结合。还可通过基因检测(例如，通过核酸杂交或引物定向的扩增)来进行检测，基因检测常常是优选的方法。可将捕集或结合的微生物裂解，以使它们的遗传物质可供检测。裂解方法是熟知的，包括例如下述处理声裂法、渗压震扰、高温处理(例如，约50°C至约IO(TC)以及与酶一起孵育，该酶例如为溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶(zymolose)、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒内溶素。
许多常用的基因检测分析可检测特定微生物的核酸，包括DNA和/或RNA。基因检测方法中使用的条件的严格性与所检测的核酸序列的变异水平相关。高严格的盐浓度和温度条件可使检测限于靶标的精确核酸序列。因此，使用高度严格的基因检测可区分靶核酸序列存在小变异的微生物菌株。基因检测可以基于核酸杂交，其中，单链核酸探针与微生物的变性核酸杂交，使得产生包含探针链的双链核酸。本领域技术人员应熟悉用于在凝胶电泳、毛细管电泳或其它分离方法之后检测杂交物的探针标记，例如放射性标记、荧光标记以及化学发光标记。特别有用的基因检测方法是基于引物定向的核酸扩增。引物定向的核酸扩增方法包括(例如)热循环方法(例如，聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)以及连接酶链反应(LCR))以及等温法和链置换扩增(SDA)(以及它们的组合，优选地，为PCR或RT-PCR)。用于检测扩增产物的方法包括(但不限于)例如凝胶电泳分离和溴化乙锭染色以及检测产物中掺入的荧光标记或放射性标记。还可使用在检测扩增产物之前不需要分离步骤的方法(例如,实时PCR或均相检测)。生物发光检测方法是熟知的，并且包括(例如)腺苷酸三磷酸(ATP)检测方法，包括美国专利号7，422，868 (Fan等人)中所描述的那些，将其说明内容以引用方式并入本文中。也可使用其它基于发光的检测方法。由于本发明方法是非菌株特异性的，它提供了容许在同一样品中靶向多种微生物菌株以检测的通用捕集系统。例如，在测定食品样品的污染时，将同一样品中的单核细胞增多性李斯特菌、大肠杆菌以及沙门氏菌一并检测是合乎需要的。在单个捕集步骤之后接着可进行例如PCR或RT-PCR测定，其使用特异性引物来扩增来自这些微生物菌株中每个菌株的不同核酸序列。因此，可避免需要对每个菌株分开进行样品处理和制备程序。诊断试剂盒用于实施本发明方法的诊断试剂盒包括(a)上述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂(优选地，粒状)；(b)检测容器(优选地，无菌检测容器)；和(C)关于使用所述浓集剂实施本发明方法的说明书。优选地，所述诊断试剂盒还包括一种或多种选自以下的组件微生物培养基或生长培养基、裂解试剂、缓冲剂、生物发光检测分析组件(例如，光度计、裂解试剂、萤光素酶、酶底物、反应缓冲剂等)、基因检测分析组件以及它们的组合。优选的裂解试剂是在缓冲剂中提供的水解酶，优选的基因检测分析组件包括靶微生物的一种或多种特异性引物。例如，本发明的诊断试剂盒的优选实施例包括吸附缓冲剂改性的粒状无机浓集齐U (例如，在诸如玻璃或聚丙烯瓶的无菌一次性容器中)，连同关于使用所述浓集剂实施本发明方法的说明书(例如，通过将浓集剂与待分析的流体样品混合，通过重力使得浓集剂沉降，去除产生的上清液，以及检测至少一种被浓集剂结合的靶微生物株系的存在)。浓集剂可任选地装在/等分在撕开式密封袋中以避免污染。浓集剂可为粉末形式。优选地，诊断试剂盒包括预量出的等份的(例如，基于样品体积)吸附缓冲剂改性的粒状无机浓集剂(更优选地，装在一个或多个撕开式密封袋内)。实M下面的实例将进一步说明本发明的目的和优点，但这些实例中列举的具体材料及其量以及其他条件和细节不应被解释为是对本发明的不当限制。除非另外指明，否则下述实例中的所有份数、百分数、比率等均按重量计。所有微生物培养物均购自美国种质保藏中心(ATCC;Manassas，VA)。除非另外指明，否则溶剂和其他试剂均来自 Sigma-Aldrich Chemical 公司(Milwaukee, WI)。表面改性的硅藻土粒状浓集剂的制备硅藻土粉(硅藻土)以白色粉末(325目；所有粒子的粒度均为小于44微米)购自·Alfa Aesar (Ward Hill, MA)(它是 Johnson Matthey Company 旗下的公司)。此材料通过 X射线衍射(XRD)显示包含无定形二氧化硅以及结晶a-方石英和石英。通过以下述方式表面处理硅藻土来制备包含两种不同表面改性剂(S卩，二氧化钛和氧化铁)的粒状浓集剂二氧化钛的沉积通过在揽拌下将20. 0 克的 TiO (SO4) *2H20 (Noah Technologies Corporation (SanAntonio, TX))溶于80. 0克的去离子水中来制备20重量％的硫酸氧钛(IV)脱水溶液。将50. 0克的此溶液与175mL的去离子水混合，以形成二氧化钛前体化合物溶液。通过在快速搅拌下将50. 0克的娃藻土分散于大烧杯中的500mL的去离子水中来制备娃藻土的分散体。将硅藻土分散体加热至约80°C之后，经约I小时的时间段逐滴加入二氧化钛前体化合物溶液，同时快速搅拌。添加之后，将烧杯用表面皿盖住并将其内容物加热到沸腾20分钟。将氢氧化铵溶液添加到烧杯中，直到内容物的PH值为约9。通过沉降/滗析来洗涤所得产物，直到洗涤水的PH值为中性。通过过滤分离产物并将其在100°C下干燥过夜。将干燥产物的一部分置于瓷坩埚内并通过下述方式进行煅烧，即以约3°C /分钟的加热速率从室温加热至350°C并随后在350°C下保持I小时。氧化铁的沉积基本上使用上述二氧化钛沉积方法来将氧化铁沉积到硅藻土上，不同的是用20. 0克的 Fe (NO3) 3 9H20(J. T. Baker, Inc. (Phillipsburg, N. J.))溶于 175mL 的去离子水中所得的溶液来替代硫酸氧钛溶液。将所得氧化铁改性的硅藻土的一部分按相似方法煅烧至350°C以用于进一步的检测。材料18 兆欧的水通过使用得自 Millipore 公司(Bedford, MA)的 Milli-Q Gradient去离子系统获得的18兆欧的无菌去离子水。3MTMPetrifilmTM好氧性微生物计数板(包含干燥、可再水合的培养基的平膜培养装置)得自3M公司(St. Paul, MN)。3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数板(包括至少一种可发酵营养物质的平膜培养装置)得自3M公司(St. Paul, MN)。
吸附缓冲剂通过如下方式制备的pH为7. 2的含阳离子盐溶液，所述方式为在一升18兆欧的水中混合5mM KClUmM CaCl2、0. ImMMgCl2和ImM K2HPO4 (使用磁性搅拌)并且随后通过使该溶液穿过具有0. 22微米尼龙过滤膜的VWR 真空过滤系统(得自VWR (WestChester, PA))来对该溶液过滤灭菌。100X吸附缓冲剂通过如下方式制备的pH为7. 2的含阳离子盐溶液，所述方式为混合等量的(l)500mM KClUOOmM CaCl2和IOmMMgCl2在100毫升18兆欧的水中的过滤灭菌(基本上如上文所述)溶液以及⑵IOOmM K2HPO4在100毫升18兆欧的水中的过滤灭菌(基本上如上文所述)溶液(所有溶液均是在磁性搅拌下制备的)。粒度范围为30-50微米的胺官能化(得自与胺官能化有机硅烷的反应的有机涂料)玻璃珠得自 PolySciences, Inc. (Warrington, PA)。CM-Ill :无定形、球化硅酸镁；成型为实体球的微球，其中粒子密度为2.3克/立 方厘米；表面积为3. 3m2/克；粒度90%小于约11微米、50%小于约5微米、10%小于约2微米；以 3M Cosmetic Microspheres CM-111 得自 3M 公司(St. Paul, MN)。Fe-DE :基本上如上文所述沉积到硅藻土的氧化铁。Ti-DE :基本上如上文所述沉积到硅藻土上的二氧化钛。W-210 :碱性矾土硅酸盐陶瓷；成型为实体球的微球，其中粒子密度为2. 4克/立方厘米；表面积为5m2/cc ;粒度95%小于约12微米、90%小于约9微米、50%小于约3微米、10%小于约I微米；以3M 陶瓷微球W-210得自3M公司(St. Paul, MN)。实例1-4和比较例C-1-C-6吸附缓冲剂改性的无机浓集剂的制备将5克CM-Ill粉末的等分试样分成两部分,将所述部分放置在两个50mL的聚丙烯离心管中并且通过在VWR模拟涡旋混合器(VWR, West Chester, PA)上以14，000转/分钟(rpm ;最高速度)涡旋10秒来悬浮/分散于50毫升18兆欧的无菌水中。然后将所得的悬浮液在 3000rpm下离心 5 分钟(Eppendorf centrifuge 5804, VffR(West Chester, PA))以获得粒状CM-111。然后将每个粒料再悬浮于50mL18兆欧的水中并且基本上按上述方式进行处理，由此来再次洗涤粒料。然后在50mL 18兆欧的水中再次实施预洗涤CM-Ill的步骤，共计洗涤三次。接下来，将所得的预洗涤的CM-Ill粒料通过基本上如上文所述的涡旋来分散于50mL体积的吸附缓冲剂中并且随后基本上如上文所述进行离心以获得粒状CM-111。在CM-Ill在50ml吸附缓冲剂的洗涤步骤执行三次。在最后洗涤之后，丢弃所得的上清液，并且将所得的至少部分润湿的粒料放置到无菌玻璃培养皿(VWR，West Chester, PA)上。将至少部分润湿的粒料在80°C下干燥(使用得自SciGene (Sunnyvale, CA)的RobbinsScientific Model 400Hybridization Incubator) 5-6 小时(实例 I )。将所得的干燥粉末(吸附缓冲剂改性的无机浓集剂)保存于室温(约23°C)下。使用基本上相同的方法(将100毫克的试剂在50毫升18兆欧的水中洗涤三次并且随后在50毫升的吸附缓冲剂中洗涤三次)来处理100毫克的下述其他无机浓集剂=Ti-DE(实例2)、Fe-DE (实例3)、胺官能化玻璃珠(比较例C-6)和W-210 (实例4)。保留相应的未处理过的试剂以用于比较未处理过的CM-Ill (比较例C-1)、未处理过的Ti-DE (比较例C-2)、未处理过的Fe-DE (比较例C-3)、未处理过的胺官能化玻璃珠(比较例C-4)和未处理过的W-210 (比较例C-5)。
含微生物的样品的浓集在3mL巴特菲尔德氏缓冲液(pH为7. 2，VWR(West Chester, PA))中使用得自胰酶大豆琼脂板(4重量％(wt%)的Difco 膜酶大豆肉汤，Becton Dickinson (Sparks, MD))的大肠杆菌(ATCC 51813)的过夜划线培养物的菌环量(标准四毫米细菌环)来制备
0.5McFarland 标准(Vitek DENSICHEK, bioMerieux 公司(Durham, NC))。该标准对应于 IO8菌落形成单位/毫升(CFU/mL)。在过滤灭菌(基本上如上文所述)的去离子的18兆欧的水中进行连续稀释。将105CFU/mL稀释液在15mL过滤灭菌的18兆欧的水中进行1:1000的进一步稀释，从而导致约100CFU/mL的最终浓度。将粒状无机浓集剂(处理过的(实例1-5) 和未处理过的(比较例C1-C5))在5mL聚丙烯试管(BD Falcon, VWR, West Chester, PA)中称重并且在I. OmL体积的100CFU/mL的测试样品中使用IOmg浓集剂来测试细菌捕集。然后盖住试管并且将其内容物通过在室温(23°C )下手动摇动来混合约I分钟。混合之后，将试管在Thermolyne Vari Mix 振动平台(BarnsteadInternational, Iowa, 14周期/分)上培养15分钟。培养之后,将试管在工作台顶部上放置10分钟以沉降粒状浓集剂。沉降之后，将ImL的所得上清液利用吸管移除并且铺板于3MTMPetrifilm 好氧性微生物计数板(3M公司，St. Paul，丽)上。将沉降的粒料再悬浮于
1.OmL的水中并且以类似方式进行铺板。将得自初始105CFU/mL的稀释液(不含粒状浓集剂)的1:1000稀释液铺板于3MTMPetrifilm 好氧性微生物计数板(3M公司，St. Paul，MN)上作为对照组。另外将粒状浓集剂(未接触样品)进行铺板作为无菌对照组。将所得板在37°C的培养箱(VWR OrbitalShaking Incubator, VWR, West Chester PA)中培养过夜。根据制造商的说明书，使用3MTMPetrifilmTM读板机(PPR，3M公司，St. Paul ；自动化光学检测系统)来分析所述板并且获得菌落计数。使用下式计算结果捕集效率=(浓集剂上的菌落数/对照组的菌落总数)X 100结果(2个数据点的平均和标准偏差)示于下表I中。在表I和后续表的浓集剂描述中，“AB-洗涤的”用于指示已利用吸附缓冲剂处理过的浓集剂。表I.
权利要求
1.ー种方法，该方法包括(a)提供吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过如下エ序制备的，所述エ序包括(I)使至少ー种无机浓集剂与至少ー种含阳离子的盐溶液接触，以润湿所述无机浓集剂的至少一部分以及(2)干燥所得的至少部分润湿的无机浓集剂；(b)提供包含至少ー种微生物菌株的样品；以及(C)使所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂与所述样品接触以使得所述至少ー种微生物菌株的至少一部分结合至所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂或者被所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂捕集。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述无机浓集剂为粒状浓集剂。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述无机浓集剂选自含硅的无机材料以及它们的组合。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述含娃的无机材料选自金属氧化物改性的娃藻土、金属招娃酸盐、无定形金属娃酸盐以及它们的组合。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述无机浓集剂选自无定形金属硅酸盐以及它们的组合。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述无机浓集剂为无定形、球化硅酸镁。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述含阳离子的盐溶液为水性的。
8.根据权利要求I所述的方法，其中所述含阳离子的盐溶液包含至少ー种下述阳离子，所述阳离子选自镁阳离子、钙阳离子、钠阳离子、钾阳离子、亚铁阳离子、镧阳离子、铝阳离子以及它们的组合。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述含阳离子的盐溶液包含至少ー种多价阳离子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多价阳离子为ニ价阳离子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述ニ价阳离子选自ニ价钙阳离子、ニ价镁阳离子以及它们的组合。
12.根据权利要求I所述的方法，其中所述含阳离子的盐溶液对于每升水包含5mMKCl、ImM CaCl2、0. ImM MgCl2 和 ImM K2HPO4 并且具有 7. 2 的 pH。
13.根据权利要求I所述的方法，其中通过洗涤来实施所述无机浓集剂与所述含阳离子的盐溶液的所述接触。
14.根据权利要求I所述的方法，其中通过将所述至少部分润湿的无机浓集剂加热至高于约25°C的温度来实施所述干燥。
15.根据权利要求I所述的方法，其中所述样品为流体的形式。
16.根据权利要求I所述的方法，其中所述微生物菌株选自如下物质的菌株细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合。
17.根据权利要求I所述的方法，其中通过混合所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂与所述样品来实施所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂与所述样品的所述接触。
18.根据权利要求I所述的方法，其中所述方法还包括离析所得的微生物结合的、吸附缓冲剂改性的无机浓集剂；从所述样品中分离所得的经离析的微生物结合的、吸附缓冲剂改性的无机浓集剂；和/或检测至少ー种结合的微生物菌株的存在。
19.ー种方法，该方法包括(a)提供吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过如下エ序制备的，所述エ序包括利用包含至少ー种阳离子的至少ー种吸附缓冲剂来处理至少ー种含硅的无机浓集剂，以提供具有如下表面组成的含硅的无机浓集剂，所述表面组成具有高于相应的未处理过的含硅的无机浓集剂的所述至少一种阳离子原子与硅原子的比率，其如经X射线光电子能谱(XPS)所測定；(b)提供包含至少ー种微生物菌株的样品；以及(C)使所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂与所述样品接触以使得所述至少ー种微生物菌株的至少一部分结合至所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂或者被所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂捕集。
20.一种制备用于实施根据权利要求I所述的方法的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂的方法，所述制备方法包括(a)使至少ー种无机浓集剂与至少ー种含阳离子的盐溶液接触，以润湿所述无机浓集剂的至少一部分；以及(b)干燥所得的至少部分润湿的无机浓集剂；前提条件是在基本上不存在含微生物的样品的情况下来实施所述制备方法。
21.一种制备用于实施根据权利要求I所述的方法的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂的方法，所述制备方法包括利用包含至少ー种阳离子的至少ー种吸附缓冲剂来处理至少ー种含硅的无机浓集剂，以提供具有如下表面组成的含硅的无机浓集剂，所述表面组成具有高于相应的未处理过的含硅的无机浓集剂的所述至少一种阳离子原子与硅原子的比率，其如经X射线光电子能谱(XPS)所測定；前提条件是在基本上不存在含微生物的样品的情况下来实施所述制备方法。
22.一种用于实施根据权利要求I所述的方法的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过根据权利要求20所述的方法制备的。
23.一种用于实施根据权利要求I所述的方法的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过根据权利要求21所述的方法制备的。
24.ー种试剂盒，其包括(a)根据权利要求22所述的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂；(b)检测容器；和(c)关于使用所述浓集剂来实施根据权利要求I所述的方法的说明书。
25.—种试剂盒，其包括(a)根据权利要求23所述的吸附缓冲剂改性的无机浓集剂；(b)检测容器；和(c)关于使用所述浓集剂来实施根据权利要求I所述的方法的说明书。
全文摘要
本发明公开一种用于捕集或浓集微生物以检测或测定的方法，包括(a)提供吸附缓冲剂改性的无机浓集剂，所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂是通过如下工序制备的，所述工序包括(1)使至少一种无机浓集剂与至少一种含阳离子的盐溶液接触，以润湿所述无机浓集剂的至少一部分以及(2)干燥所得的至少部分润湿的无机浓集剂；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品；以及(c)使所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂与所述样品接触以使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分结合至所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂或者被所述吸附缓冲剂改性的无机浓集剂捕集。
文档编号G01N1/40GK102686995SQ201080059065
公开日2012年9月19日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月22日
发明者曼基里·T·克希尔萨加尔 申请人:3M创新有限公司
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