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专利名称：臭茉莉hplc标准指纹图谱及其建立方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物分析技术领域，更为具体地，涉及臭茉莉HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
背景技术：
臭茉莉(别名:臭矢茉莉，臭茉莉，大髻婆，单茉莉，过墙风)，为马鞭草科植物臭茉莉的干燥茎或根，为常用中草药，现收载于《广东省中药材标准》，具有祛风除湿，利水消肿的功效，常用于治疗风湿骨痛，脚气水肿，支气管炎、高血压症及湿疹疥疮，皮肤瘙痒等皮肤疾病。广东省各地有产，以阳山，宝安，三水等地产出较多。其根茎均可入药微苦，平。归肝、脾、肾经，有祛风除湿，利水消肿的功效。用于风湿骨痛，脚气水肿；可治疗支气管炎、高血压病。外用治湿疹疥疮，皮肤瘙痒。臭茉莉原定名为Clerodendron fragrans auct.non.Vent., Clerodendronphilippinum Schauer var.simplex Moldenke,变种臭茉莉Clerodendron lindleyi Decne.ex Planch.和原变种重瓣臭茉莉 C.phi lippinum Schauer Var.philippinum。现有标准对臭茉莉质量控制只有性状鉴别及显微鉴别，国内外关于臭茉莉的研究报道极少见，尚没有对臭茉莉的指纹图谱的质量控制方法的相关报道。本发明是在对臭茉莉根和茎进行了系统的化学成分研究上，采用HPLC方法，建立能较全面反映臭茉莉药材质量的指纹图谱，对控制臭茉莉原料和产品的质量有重要意义。

发明内容
现有标准对臭茉莉质量控制只有性状鉴别及显微鉴别，质量控制方法水平不高，本发明所要解决的是对现有的臭茉莉的质量控制方法水平不高，提供了一种臭茉莉的标准指纹图谱，利用该标准图谱更好的控制臭茉莉的质量，保证药品使用的安全有效，同时本发明还提供了一种臭茉莉标准指纹图谱的建立方法和应用。本发明通过以下技术方案予以实现上述目的:
一种臭茉莉HPLC标准指纹图谱，其特征在于，包括13个共有特征峰，保留时间分别为:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、
18.541min。—种臭茉莉HPLC标准指纹图谱，其特征在于，包括21个共有特征峰:以9号峰为对照峰(9号峰为毛蕊花糖苷峰，保留时间为18.54Imin )，其他的20个共有峰的相对保留时间为:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、1.493,1.517,1.605,1.635,1.743,1.795,2.044,2.203。一种臭茉莉HPLC标准指纹图谱的建立方法，包括如下步骤:
51.供试品溶液的制备:称取样品，加入提取溶剂，浸润1(Γ60分钟，超声提取3(Γ60分钟，过滤蒸干后溶解即得供试品溶液；
52.指纹图谱的制作:将SI所得溶液过色谱分离柱，加入乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，流速0.8 1.2mL/min,乙腈在洗脱过程中体积分数变化规律:(Tl2min, 14 17%; 12 18miη, 17 20%18 20min, 20 20%2(T35min，20 40%; 35 40min, 40 78%; 40 50min，78 88% ;检测波长327nm，柱温25 35°C ;在此条件下分析供试品溶液，得到臭茉莉的指纹图谱；
S3.标准指纹图谱的确定:对11批臭茉莉建立HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定共有特征峰，这些共有特征峰作为臭茉莉的标准指纹图谱。优选地，SI中所述提取溶剂为石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、50%甲醇、70%甲醇或70%乙醇；更为优选地，SI中所述提取溶剂为甲醇。优选地，SI中所述样品与提取溶剂的重量与体积比为1:25 50。优选地，SI中所述浸润的时间为30分钟，超声提取的时间为45分钟。优选地，S2中所述色谱分离柱为安捷伦Z0RBAX-C18 (250 mmX4.6 mm，5ym)、赛默飞 Hypersil 0DS2 (4.6mmX 250mm, 5 μ m)或菲罗门 Phenomenex Synergi 4uFusion-RP 80A (250 mmX4.6 mm)。优选地，S2中所述色谱分离柱为安捷伦Z0RBAX-C18 (250 mmX4.6 mm, 5 μ m)。优选地，S2中所述流速为1.0mL/min。优选地，S2中所述柱温为35 °C。一种如上所述臭茉莉HPLC标准指纹图谱在臭茉莉质量控制中的应用。利用臭茉莉HPLC标准指纹图谱控制臭茉莉质量的具体步骤如下:
Sll.待测样品溶液的制备:称取样品，加入提取溶剂，浸润(Γ60分钟，超声提取3(Γ60分钟，过滤蒸干后溶解即得供试品溶液；
S12.指纹图谱的制作:将SI所得溶液过色谱分离柱，加入乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，流速0.8^1.2mL/min,乙腈在洗脱过程中体积分数变化规律:(Tl2min， Γ 7%; 12 18min, 17 20%18 20min, 2(T20%2(T35min，20 40%; 35 40min, 40 78%; 4(T50min, 78 88% ;检测波长327nm，柱温25 35°C ;在此条件下分析待测样品溶液，得到待测臭茉莉的指纹图谱；
S2.将待测样品的HPLC图谱如上所述标准图谱对比，确定待测样品质量。本发明的有益效果是:
(O目前执行的标准中尚无建立臭茉莉指纹图谱的检测方法标准，标准对臭茉莉质量控制只有性状鉴别及显微鉴别，质量控制方法水平不高，发明是在对臭茉莉根和茎进行了系统的化学成分研究上，采用HPLC方法，建立能较全面反映臭茉莉药材质量的标准指纹图谱。为药品生产及检测中提供了臭茉莉质量控制的高标准，可以更好的控制臭茉莉的质量，使质量可控，保证药品使用的安全有效。(2)本发明提供了一种建立臭茉莉标准指纹图谱的建立方法，提供了臭茉莉高水平的检测的操作标准和规范，方法简单，易操作，重复性好，可以全面监控臭茉莉的产品，以确保产品质量的稳定性。(3)本发明提供的臭茉莉的标准指纹图谱和检测方法，为行业内臭茉莉的质量控制提供了标准和操作规范，方法简单，易操作，重复性好，可以在原料采购、产品生产工艺流程中的各个步骤的质量进行监控，广泛推广应用。

(4)利用本发明的测定方法，可得到臭茉莉样品的指纹图谱色谱图。再借助计算机相似度辅助评价软件，将样品图与共有模式图谱比较，通过相似度计算，即可评价原料品种、产地、真伪优劣，以及判断产品质量的稳定性。


图1.超声提取和热回流提取比较。图2.浸润时间的比较。图3.不同提取溶剂比较。图4.不同料液比提取比较。图5.不同洗脱系统的比较。图6.不同洗脱系统的比较。图7.不同流速的比较。图8.不同柱温的比较。图9.不同色谱柱的比较。 图10.臭末利指纹图谱；1.臭末利20100617 ；2.臭末利20100930 ；3.臭末利
20101101；4.臭茉莉 20101102 ;5.臭茉莉 20110301 ;6.臭茉莉 220110302 ;7.臭茉莉20110303 ；8.臭茉莉 20110304 ;9.臭茉莉 20110501 ;10.臭茉莉 20120723 ;11.臭茉莉20120830。图11.对照品色谱图；S.为毛蕊花糖苷对照品。图12.臭茉莉的标准指纹图谱。图13.专属性考察。图14.精密度考察。图15.重复性考察。图16.稳定性考察。图17.臭茉莉指纹图谱共有模式图谱；9号峰为毛蕊花糖苷；17号峰为3"，4〃 -0-acetyImartynoside ；18 号峰为 friedelin 。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。实施例1 S1.仪器与试剂
电热重蒸馏水器(上海三申医疗器械有限公司)、电热恒温水浴锅DK-S24 (上海森信实验仪器有限公司)、FEJ-200电子称(d=0.lg)、万分之一电子天平AB204-S (METTLERTOLEOD)、十万分之一电子天平AUW220D (岛津公司)安捷伦1200RLC快速液相色谱仪(配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD蒸发光检测器、G1312B 二元泵、G1329B自动进样器、G1322A 脱气机G1316B 柱温箱，Agilent Chemstation 色谱工作站、Agilent ZORBAX-C185 μ m(250 mmX4.6 mm)、Agilent ZORBAX-C181.8 μ m(50 mmX4.6 mm)、菲罗门PhenomenexSynergi 4u Fusion-RP 80A (250 mmX 4.6 mm)色谱柱、KQ-400K0E 型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。对照品:(1)桦木酸(betulinic acid) ； (2)单乙酰马蒂罗苷(monoacety Imartinoside) ； (3) 4 " -O-乙酸马蒂罗苷(4 " -O-acetylmartynoside)；(4)贞桐苷 A (clerodendronoside A) ； (5) 3 " , 4 " -O-乙酸马蒂罗苷(3〃 ,4" -O-acetylmartynoside) ； (6)阿克替苷(acteoside) ； (7)木栓酮(friedelin) ； (8)粘霉烯醇(glutinol) ; (9)蒲公英職醇(taraxerol) ; (10)钩大青酮(uncinatone) ； (11)mandarone E ; (12) (24S)-乙基胆留-5,22,25-三稀-3 β -醇[(24S) -24-ethylcholesta-5, 22, 25-trien-3 β -οI ] ； (13) hedyotol C 4" -0-β -D-glucopyranoside。对照品均是对臭茉莉根和茎进行了系统的化学成分研究上所得到的。乙腈(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、甲醇(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、磷酸(天津市福晨化学试剂厂)，冰醋酸(天津市福晨化学试剂厂)、乙醇(分析纯，天津市大茂化学试剂有限公司)、石油醚(分析纯，天津市大茂化学试剂有限公司)、甲醇(分析纯，天津市大茂化学试剂有限公司)、重蒸水(自制)。S2.试验药材
11批臭茉莉药材均由不同产地采集，样品均按照《广东省中药材标准》进行检测与鉴定，符合规定。样品粉碎过50目筛，详细信息见表1:
表1.11批臭茉莉样品信息
权利要求
1.一种臭茉莉HPLC标准指纹图谱，其特征在于，包括13个共有特征峰，保留时间分别为:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、18.541min。
2.一种臭茉莉HPLC标准指纹图谱，其特征在于，包括21个共有特征峰，保留时间分别为:0.183,0.204,0.243,0.493,0.514,0.669,0.718,0.892,1.151,1.179,1.245,1.482、1.493,1.517,1.605,1.635,1.743,1.795,18.541、2.044,2.203 min。
3.一种臭茉莉HPLC标准指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.供试品溶液的制备:精密称取样品，加入提取溶剂，浸润(Γ60分钟，超声提取3(Γ60分钟，过滤蒸干后溶解即得供试品溶液； 52.指纹图谱的制作:将SI所得溶液过色谱分离柱，加入乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，流速0.8" .2mL/min,乙腈在洗脱过程中体积分数变化规律:(Tl2min, 14 17%; 12 18miη, 17 20%18 20min, 20 20%2(T35min，20 40%; 35 40min, 40 78%; 40 50min，78 88% ;检测波长327nm，柱温25 35°C ;在此条件下分析供试品溶液，得到臭茉莉的指纹图谱； 53.标准指纹图谱的 确定:对11批臭茉莉建立HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定共有特征峰，这些共有特征峰作为臭茉莉的标准指纹图谱。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，SI中所述提取溶剂可以为石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、50%甲醇、70%甲醇或70%乙醇；S1中所述提取溶剂为甲醇。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，SI中所述样品与提取溶剂的重量与体积比为1:25 50。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，再优选供试品的制作SI中所述浸润的时间为30分钟，超声提取的时间为45分钟。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2中所述色谱分离柱为安捷伦ZORBAX-C18、赛默飞 Hypersil 0DS2 或菲罗门 Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，S2中所述流速为1.0mL/min，S2中所述柱温为 35。。。
9.一种如权利要求1至3任一项所述臭茉莉HPLC标准指纹图谱在臭茉莉质量控制中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，利用臭茉莉HPLC标准指纹图谱控制臭茉莉质量的具体步骤如下:·51.按权利要求3中SI和S2所述方法分析待测样品的HPLC图谱；·52.将待测样品的HPLC图谱与权利要求1所述标准图谱对比，确定待测样品质量。
全文摘要
本发明提供了一种臭茉莉HPLC标准指纹图谱及其建立方法与应用，所述方法包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，色谱条件的选择，并用高效液相色谱仪进行测定，得到臭茉莉药材的指纹图谱。通过对11批次臭茉莉药材HPLC指纹图谱的对比，确定其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰多、准确可靠等特点。所建立的标准指纹图谱能有效地表征臭茉莉药材的质量。
文档编号G01N30/86GK103076408SQ20121058776
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者成金乐, 彭丽华, 王慧玲, 闵欢 申请人:中山市中智药业集团有限公司