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专利名称：一种快速检测转基因抗蚜棉的方法
技术领域：
本发明属于转基因植物安全性评价技术领域，特别是一种转基因抗蚜棉的快速检测方法。
背景技术：
目前关于转基因抗虫棉的检测技术主要涉及以下几种(1)蛋白质的检测方法 该方法基于免疫学原理，主要针对转基因植物外源基因表达的目的蛋白建立的特异性检测方法；(2)核酸检测方法主要利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)进行外源基因和标记基因序列等的检测；(3)抗生素溶液涂抹检测法将抗生素溶液涂抹在抗性再生植株心叶，3到7天后观察叶片颜色变化，转基因植株叶片生长正常，非转基因植株叶片出现退绿条带；(4)人工饲料饲喂法中国专利200610064877公开了一种利用转基因抗虫棉萌动的棉籽与昆虫人工饲料混合物直接饲喂昆虫，测定昆虫幼虫的死亡率，以此判断是否为转基因抗虫棉。上述转基因抗虫棉的方法存在以下不足(1)蛋白和分子生物学方法都需要昂贵的测定仪器，且蛋白质检测需要试剂盒，核酸的检测需要提取棉花的DNA或者RNA以及合成外源基因的特异引物，成本较高，在测定过程中能产生有毒的化学物质；(2)抗生素法检测周期长；(3)人工饲料饲喂法适用对象为抗咀嚼式口器棉铃虫的转基因棉花，目前不适用抗刺吸式口器棉蚜的转基因棉的检测。

发明内容
本发明目的在于提供一种快速、无污染且使用方便的抗蚜转基因棉花的检测方法。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案 该快速检测转基因抗蚜棉的方法。包括以下步骤
(1)设备和待测材料的准备
检测仪器为昆虫刺吸电位仪(electrical penetration graph, EPG)，检测的转基因棉花生育期为4-5片真叶期，首先用水溶性导电银胶将1头棉蚜的背板和一根金丝电极相连， 放置该棉蚜于待测转基因棉苗叶背上适应1-3小时后，金丝电极另外一端连接昆虫刺吸电位仪；
(2)检测和记录
检测开始，棉蚜在转基因棉花上的刺吸取食行为产生的一系列电信号经昆虫刺吸电位仪放大处理后，通过信号采集软件和模拟一数字转化卡记录在电脑硬盘上，记录一段时间后结束；
(3)信号分析和计算利用分析软件分析每头棉蚜口器口针在测定转基因棉花叶片韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和，计算该时间总和占测定时间的百分比，然后计算所有测定的棉蚜该百分比的平均值；
(4)判断转基因棉花是否为转基因抗蚜棉
判断标准是对于一个测定的转基因棉花品系，棉蚜口针在该品系棉花叶片韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比小于10%，则该棉花为转基因抗蚜棉；棉蚜口针在棉花韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比大于20%，则该棉花为非转基因抗蚜棉。与现有同类检测方法相比，本发明具有以下优点
(1)检测速度快，方法简单测定时间只用4-6小时，八通道刺吸电位系统2天时间就可以测定20头棉蚜的刺吸行为。而蛋白和核酸检测方法需要首先提取植物的蛋白和核酸，样品较多时更费时间。本发明可以直接以转基因棉花植株为测定对象，不用对植株进行其他处理。(2)检测成本低，无污染一台昆虫刺吸电位系统的价格为3万多人民币，远低于 PCR仪以及酶联免疫吸附仪等仪器。检测时不需其他的化学试剂，不用额外购买其他的试剂盒。不涉及如核酸检测有关的溴化乙啶等有毒的化学物质。棉蚜成本极低，且容易在室内饲养。而蛋白和核酸检测方法成本较高，如果涉及植物较多时成本更加昂贵。(3)确性高，重复性好检测了多个转基因抗蚜棉，准确率达到100%。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，这些描述并非是对本发明内容的限制。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换或相应改进，仍属于本发明的保护范围之内。实施例1:
(1)设备和待测材料的准备
检测仪器为4通道昆虫刺吸电位仪(electrical penetration graph，EPG)，待测棉花品系为Al和A2，生育期为苗期4片真叶期，4通道昆虫刺吸电位仪每次检测4株棉花；用水溶性导电银胶将棉蚜无翅成蚜的背板和金丝电极相连，放在1株棉苗叶片上适应1小时，每株棉花上只能放置一头测定棉蚜；然后金丝电极另外一端连接刺吸电位仪的一个通道，每个通道连接一根金丝电极；
(2)检测和记录
检测开始，刺吸电位仪记录开始，输出信号使用WinDaq Lite采集软件(Dataq instruments, Inc.)，通过模拟一数字转化卡(DI—720， Dataq instruments, Inc. ) i己录在电脑硬盘上，记录6小时结束，每个待测品系棉花成功测定20株棉苗，每株棉苗和每头棉蚜只能使用一次；
(3)信号分析和计算
利用分析软件WinDaq Lite (Dataq instruments, Inc.)分析每头棉蚜口器口针在转基因棉花韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和，计算该时间总和占测定时间的百分比，然后计算20头棉蚜该百分比的平均值；(4)测定结果及判断棉花是否为转基因抗蚜棉花
Al棉上棉蚜口针在棉叶韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和占测定时间百分比的平均值为5. 89%，小于10%，按照判断标准，则Al为转基因抗蚜棉；A2棉上棉蚜口针在棉叶韧皮部筛管中被动吸食植物汁液对应波形出现的时间总和占测定时间百分比的平均值为20. 19%，大于20%，按照判断标准，则A2为非转基因抗蚜棉。待测品系Al是转基因抗蚜转基因棉花，A2为其亲本常规棉花，为非转基因常规棉。因此本发明的实验结果与实际相符。实施例2:
与实施例1的操作条件相同，所不同的是待测棉花品系分别为Bl和B2。计算结果显示Bl棉上棉蚜口针在棉叶韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间占测定时间百分比的平均值为5. ，小于10%，按照判断标准，则Bl为转基因抗蚜棉；B2棉上棉蚜口针在棉叶韧皮部筛管中被动吸食植物汁液对应波形出现的总时间占测定时间百分比的平均值为28. 27%，大于20%，按照判断标准，则B2为非转基因抗蚜棉。待测品系Bl是转基因抗蚜转基因棉花，B2为其亲本非转基因常规棉花，因此本发明的实验结果与实际相符。
权利要求
1.一种快速检测转基因抗蚜棉的方法，包括以下步骤(1)设备和待测材料的准备检测仪器为昆虫刺吸电位仪(electrical penetration graph, EPG)，检测的转基因棉花生育期为4-5片真叶期，用水溶性导电银胶将1头棉蚜的背板和一根金丝电极相连，放置该棉蚜于待测转基因棉苗叶背上适应1-3小时后，金丝电极的另外一端连接昆虫刺吸电位仪；(2)检测和记录检测开始，棉蚜在转基因棉花上的刺吸取食行为产生的一系列电信号经昆虫刺吸电位仪放大处理后，通过信号采集软件和模拟一数字转化卡记录在电脑硬盘上，记录一段时间后结束；(3)信号分析和计算利用分析软件分析每头棉蚜口器口针在测定转基因棉花叶片韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和，计算该时间总和占测定时间的百分比，然后计算所有测定的棉蚜该百分比的平均值；(4)判断转基因棉花是否为转基因抗蚜棉判断标准是对于一个测定的棉花品系，棉蚜口针在该品系棉花叶片韧皮部筛管中的被动吸食汁液对应波形出现的时间总和测定时间的百分比小于10%，则该棉花为转基因抗蚜棉；棉蚜口针在棉花韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比大于20%，则该棉花为非转基因抗蚜棉。
2.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步骤⑴ 中的检测仪器昆虫刺吸电位仪(electrical penetration graph)系荷兰Wageningen University生产，为4通道(Giga4型号)或者8通道(Giga8型号)。
3.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步骤⑴中昆虫刺吸电位仪每个通道每次只能测定一株待测转基因棉苗，4通道型号或者8通道型号可以同时检测4株或者8株待测转基因棉苗。
4.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步骤⑴中的一根金丝电极的一端只能连接1头棉蚜，另外一端连接在刺吸电位仪的一个通道上，刺吸电位仪的一个通道只能连接一根金丝电极。
5.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步骤⑴中每株待测转基因棉苗上只能放置1头棉蚜无翅成蚜。
6.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于每个品系的待测转基因棉苗至少要成功测定20株，每株棉苗和每头棉蚜只能使用一次。
7.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步骤⑵测定记录的时间为4-6小时。
8.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步骤⑷中棉蚜口针在棉花叶片韧皮部筛管中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比为所有测定蚜虫该百分比的平均值。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测转基因抗蚜棉的方法。检测的仪器为昆虫刺吸电位仪。步骤包括连接棉蚜和金丝电极；检测和记录棉蚜在待测棉花上刺吸取食时产生的电信号；记录一段时间后结束，分析和计算棉蚜在测定棉花上刺吸取食产生的波形及出现时间；判断棉花是否为转基因抗蚜棉棉蚜口针在测定棉花叶片韧皮部筛管子中被动吸食汁液对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比小于10%，则该棉花品系为转基因抗蚜棉；棉蚜口针在测定棉花韧皮部筛管子中被动吸食汁液产生的波形出现的时间总和占测定时间的百分比大于20%，则该棉花品系为非转基因抗蚜棉。与现有同类检测方法相比，本发明检测速度快，方法简单，成本低，无污染，重复性好，准确率高。
文档编号G01N27/00GK102175720SQ201010610888
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者卢绍辉, 崔金杰, 李为争, 汤清波, 白素芬, 闫凤鸣, 雒珺瑜, 马英, 高佳 申请人:河南农业大学