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专利名称：由间接竞争时间分辨荧光免疫分析体系检测烟草中菌核净残留的方法
技术领域：
本发明涉及一种由CI-TRFIA检测体系检测烟草中菌核净残留的方法。
背景技术：
菌核净(N-3，5_ 二氯苯基丁二酰胺)是一种高效、低毒的亚胺类杀菌剂。它具有广谱、杀菌、内吸、渗透、持效期长等特点，广泛用于烟草赤星病和水稻纹枯病的防治。考虑到菌核净残留对人类健康和环境存在潜在风险，建立烟草中菌核净残留的检测方法势在必行。然而，我国烟草中菌核净的残留限量尚未制定，检测标准也仅有烟草行业标准制定的气相色谱法[烟草及烟草制品菌核净农药残留量的测定气相色谱法.中华人民共和国烟草行业标准· YC/T218-2007]。Liu 等[Liu H C，Li Q ff, Tang L B. Capillary gas chromatographic determination of dimethachlon residues in fresh tobacco leaves and cut-tobacco. Zhejiang Univ. Sci. B，2007，8 (4) :272 276]报道了菌核净在鲜烟叶和烟丝中的气相色谱法检测方法，检测线性范围为0. 01 0. lmg/kg。刘蓉蓉等釆用菌核净-2-戊二酸半酯为半抗原，制备了菌核净多克隆抗体，并釆用酶联免疫吸附方法(ELISA) 检测烟草中菌核净残留[刘蓉蓉，刘贤金，刘媛，方敦煌，胡秋辉.菌核净残留免疫分析半抗原的制备和鉴定.食品科学，2007，2 :223-226][刘蓉蓉.菌核净的免疫检测技术研究，南京南京农业大学硕士学位论文，2007]，抗体的抑制终浓度I5tl为2830 μ g/L，检测灵敏度偏低。时间分辨荧光免疫分析是20世纪80年代发展起来的非放射型免疫分析方法，它采用稀土族元素作为标记物，克服了 ELISA的稳定性差的缺点，也避免了放射性免疫分析 (RIA)的同位素污染等问题，具有灵敏度高、抗基质干扰能力强、试剂稳定等优点。建立菌核净农药高灵敏度检测的CI-TRFIA分析体系，并通过CI-TRFIA分析体系检测烟草中菌核净残留，目前未报道。

发明内容
本发明的目的在于针对目前菌核净检测方法研究较少，且已报道的气相色谱检测方法和酶联免疫检测方法灵敏度偏低的问题，本发明提供了一种菌核净残留的时间分辨荧光免疫分析方法，并将其应用于烟草中菌核净残留检测，开发了简便快速、无需样本净化的前处理方法。本发明的目的是这样实现的一种由CI-TRFIA检测体系检测烟草中菌核净残留的方法，其特征在于所述的CI-TRFIA检测体系中，以菌核净-OVA作为包被抗原，以菌核净多克隆抗体作为识别抗体，以Eu-Nl标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立与菌核净农药对应的标准抑制曲线，方法是将菌核净-卵清蛋白OVA连接物作为包被抗原固定于酶标板，再加入梯度稀释的菌核净标准品和菌核净多克隆抗体，让菌核净标准品与包被抗原共同竞争结合抗体，再采用Eu-Nl标记的羊抗兔IgG作为二抗，通过时间分辨检测模式读数后，绘制菌核净时间分辨免疫分析的标准抑制曲线，建立线性回归方程，计算抑制中浓度，确定最低检测限和线性检测范围；所述的检测烟草中菌核净残留是指对烟草样品前处理后，通过CI-TRFIA检测体系对其进行检测，判断与样品对应的烟草中菌核净残留量。在本发明中所述的Eu-Nl标记的羊抗兔IgG是这样获得的称取4mgEu_Nl，用 350 μ L蒸馏水溶解，备用^flmg亲和纯化后的羊抗兔IgG溶于150 μ L蒸馏水，加入pH 9.8 的15 μ L O. 5mol/L碳酸盐缓冲液，混合均匀后，将溶解的Eu-Nl与羊抗兔IgG混合，4°C静置过夜，次日将过夜的反应物装入截留分子量为8000Da的透析袋中，对超纯水透析3天，截留物为Eu-Nl标记的羊抗兔IgG，于_20°C保存备用。在本发明中对烟草样品前处理是指将烟草样品粉碎后，称取Ig放入IOOmL三角瓶中，加20mL丙酮混合均匀，180rpm振荡提取I小时，抽滤后浓缩近干，再用IOml丙酮复溶残余物并定容，取100 μ L丙酮复溶物，用检测缓冲液稀释10倍后，直接用于CI-TRFIA检测。本发明采用了菌核净-OVA作为包被抗原、菌核净多克隆抗体作为识别抗体和镧系元素螯合物Eu-Nl标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立了高灵敏度的菌核净时间分辨荧光免疫分析方法，并将其应用于烟草中菌核净残留检测，开发了简便快速、无需样本净化的前处理方法，为国内外首次报道。本发明的优点在于本发明采用了菌核净-OVA作为包被抗原、菌核净多克隆抗体作为识别抗体和Eu-Nl标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立了高灵敏度的菌核净时间分辨荧光免疫分析方法，并将其应用于烟草中菌核净残留检测，开发了简便快速、无需样本净化的 CI-TRFIA分析体系，它与传统的ELISA法相比，具有检测信号高，抗基质干扰能力强等优点。本发明的抑制中浓度(I5tl)为32. 00 μ g/L，最低检出限Iltl为I. 981^/1，检测线性范围为3. 97 128. 76 μ g/L，检测灵敏度明显优于现有报道的气相色谱检测方法和ELISA检测方法。本发明的优点还在于在烟草样品的前处理过程中，无需样品净化，用丙酮提�。� 再经过检测缓冲液稀释后，直接用于时间分辨荧光免疫分析方法检测。检测时间为165min， 检测通量可达20 30样/板(以96孔，I个样做3个重复计算)，样品中菌核净的最低实际检出浓度为lmg/L，在大量烟叶样品中菌核净残留的快速筛查检测，具有较高的应用前
旦
-5^ O


图Ia菌核净CI-TRFIA分析的标准抑制曲线。图Ib菌核净CI-TRFIA分析的线性回归方程。图2是不同浓度烟叶基质对菌核净CI-TRFIA分析体系的影响。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步的描述。实施例I. Eu-Nl标记的羊抗兔IgG制备
称取4mg Eu-Nl (芬兰Wallac公司提供)，用350 μ L蒸馏水溶解，备用。将Img亲和纯化后的羊抗兔IgG(武汉博士德公司提供)溶于150 μ L蒸馏水，加入15 μ L O. 5mol/L 碳酸盐缓冲液(pH 9. 8)，混合均匀后，将溶解的Eu-Nl与羊抗兔IgG混合，4°C静置过夜。次日反应物装入透析袋中(截留分子量8000)，透析3天，截留物分装后于_20°C保存备用。实施例2. CI-TRFIA(Competitive indirect time-resolved fluorescence immunoassay)的建立用洗涤缓冲液预洗酶标板I次，加入100 μ L终浓度为6. 9mg/L,检测缓冲液(无锡市江原实业技贸总公司)稀释的菌核净-OVA (实验室自制)，室温下以700r/min振荡孵育30min后，洗涤缓冲液(无锡市江原实业技贸总公司)洗板4次；在孔板中加入50 μ L稀释2000倍的菌核净多克隆抗体(实验室自制)及50 μ L不同浓度的菌核净标准液，室温下以700r/min振荡孵育Ih后，洗板4次；再加入100 μ L稀释1000倍的Eu-Nl标记的羊抗兔 IgG，室温下以700r/min振荡孵育Ih后，洗板4次；每孔加入荧光增强液(无锡市江原实业技贸总公司UOOyLJOOr/min振荡15min，用多功能微孔板分析仪(德国Bethold LB940 多功能微孔板分析仪)的时间分辨荧光检测模式读数。如图I所示，采用了 CI-TRFIA法建立了菌核净农药的标准抑制曲线。线性回归方程为I = 33. 081ogC+0. 20 (R2 = O. 97)，其中，I为抑制率，C为样本浓度(μ g/L)。计算得到方法的检出限Iltl为I. 98 μ g/L,抑制终浓度I5tl为32. 00 μ g/L,检测线性范围(I2tl I7tl) 在 3. 97 128. 76 μ g/L ο实施例3.烟叶基质对时间分辨荧光检测体系的影响研究考虑到免疫学检测方法主要用于大量样本的快速筛查，所采用的样品前处理方法通常不采用复杂的样本净化步骤，而是对样本进行简单提取后，再进行稀释，减小或去除样本基质对检测的干扰。但是样本稀释又会导致检测方法的实际灵敏度的降低。本实验通过研究烟叶在经丙酮提取后，不同浓度的基质对CI-TRFIA分析体系(线性范围内)的影响， 确定了烟叶样品前处理后对检测方法所需的稀释倍数。具体步骤如下称取3组Ig烟叶(每组8份)，放入IOOmL三角瓶中，分别添加ImL稀释2倍的菌核净标样(丙酮溶解)，充分混匀，避光静置2h ;加20mL丙酮，ISOrpm振荡提取lh，抽滤后旋转浓缩近干；3组残余物分别用0. 3、I. O和IOmL丙酮溶解，再用检测缓冲液稀释10倍， 直接用于CI-TRFIA检测。由于烟叶的成分复杂，内源性物质对以“抗原-抗体”结合为基础的CI-TRFIA检测反映体系干扰较大。由图2所示，33%烟叶基质对检测体系干扰严重，抗体几乎完全失去识别能力；10%烟叶基质存在时，菌核净的抑制曲线与标准抑制曲线相比斜率明显降低，曲线的平行性较差；1%烟叶基质存在时，曲线的平行性较好，可以通过基质影响因子(Im)对检测结果进行矫正，因此确定烟叶样品前处理的稀释倍数为100倍。计算得到的I %烟叶基质的基质影响因子为17. I。菌核净基质影响因子计算公式Im = [ (B0-Bm0) /B0] X 100式中=Btl-TRFIA检测方法中，O %烟叶基质中(标准抑制曲线)，零浓度的菌核净对应的荧光值。BmO-TRFIA检测方法中，I %烟叶基质中，零浓度的菌核净对应的荧光值。实施例4.烟草中菌核净CI-TRFIA的添加回收实验
为考察本发明所建立的烟草中菌核净CI-TRFIA分析方法的精密度和重现性，进行了烟草的添加回收实验。具体步骤如下在CI-TRFIA检测的线性范围内，连续3天对空白烟叶样本进行1、7和24mg/L的 3个水平的添加(由于样品在前处理中稀释了 100倍，且在CI-TRFIA加样时与等体积的抗体混合，因此菌核净在CI-TRFIA检测体系中的终浓度分别为5、35和120 μ g/L)。Ig烟叶样品经过20ml丙酮提取后，浓缩近干再用IOml丙酮复溶残余物并定溶。取IOOul丙酮定容物，用检测缓冲液稀释10倍后用于检测，检测结果经过基质影响因子进行矫正。样品中菌核净浓度的实际浓度的折算公式CX = Cd[ (IOO-Im)/100]式中Cx-样品中菌核净的实际浓度，Cd-样品中菌核净的计算浓度。如表I所示，连续3天的样品的总添加回收率为73% 128%，变异系数(CV)在 4. 3 13. 2之间。添加回收实验表明，该方法可以用于烟草中菌核净农药的快速筛选检测。表I烟叶中菌核净农药的CI-TRFIA检测方法的添加回收率和变异系数

权利要求
1.一种由间接竞争时间分辨荧光免疫分析体系检测烟草中菌核净残留的方法，其特征在于所述的检测体系中，以菌核净-OVA作为包被抗原，以菌核净多克隆抗体作为识别抗体，以Eu-Nl标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立与菌核净农药对应的标准抑制曲线，方法是: 将菌核净-卵清蛋白OVA连接物作为包被抗原固定于酶标板，再加入梯度稀释的菌核净标准品和菌核净多克隆抗体，让菌核净标准品与包被抗原共同竞争结合抗体，再采用Eu-Nl 标记的羊抗兔IgG作为二抗，通过时间分辨检测模式读数后，绘制菌核净时间分辨免疫分析的标准抑制曲线，建立线性回归方程，计算抑制中浓度，确定最低检测限和线性检测范围；所述的检测烟草中菌核净残留是指对烟草样品前处理后，通过检测体系对其进行检测，判断与样品对应的烟草中菌核净残留量。
2.根据权利要求I所述的由间接竞争时间分辨荧光免疫分析体系检测烟草中菌核净残留的方法，其特征在于所述的Eu-Nl标记的羊抗兔IgG是这样获得的称取4 mg Eu-Nl, 用350 μ L蒸馏水溶解，备用；将I mg亲和纯化后的羊抗兔IgG溶于150 μ L蒸馏水，加入 pH 9. 8的15 μ L O. 5 mo I/L碳酸盐缓冲液，混合均匀后，将溶解的Eu-Nl与羊抗兔IgG混合，4°C静置过夜，次日将过夜的反应物装入截留分子量为8000Da的透析袋中，对超纯水透析3天，截留物为Eu-Nl标记的羊抗兔IgG，于-20°C保存备用。
3.根据权利要求广2之一所述的由间接竞争时间分辨荧光免疫分析体系检测烟草中菌核净残留的方法，其特征在于对烟草样品前处理是指将烟草样品粉碎后，称取Ig放入 IOOmL三角瓶中，加20mL丙酮混合均匀，180rpm振荡提取I小时，抽滤后浓缩近干，再用 IOml丙酮复溶残余物并定容，取100 μ L丙酮复溶物，用检测缓冲液稀释10倍后，直接用于 CI-TRFIA 检测。
全文摘要
本发明涉及一种由间接竞争时间分辨荧光免疫分析体系检测烟草中菌核净残留的方法，其中所述的CI-TRFIA检测体系是以菌核净-OVA作为包被抗原，以菌核净多克隆抗体作为识别抗体，以Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立与菌核净农药对应的标准抑制曲线；所述的检测烟草中菌核净残留是指对烟草样品前处理后，通过CI-TRFIA检测体系对其进行检测，判断与样品对应的烟草中菌核净残留量。
文档编号G01N33/558GK102590499SQ20121001164
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者刘媛, 刘贤金, 张霄, 王冬兰 申请人:江苏省农业科学院