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专利名称：生物芯片定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片检测方法，特别涉及其中使用的定量原理的检测方法。
背景技术：
在本方法发明之前，现有的临床指标，以AMI(心肌梗死)为例说明，它含四项指标，肌酸肌酶同工酶CK-MB、肌红蛋白MB、肌钙蛋白I cTnI、高敏C反应蛋白HsCRP)传统定量检测方法如下分析测定CK-MB的方法主要有电泳、柱层析、免疫抑制、免疫沉淀以及其他免疫方法，其中电泳和柱层析方法操作复杂、耗时多。
定量测定MB一般用免疫化学发光检测仪来进行，同理也是操作复杂，耗时。
定量检测cTnI的试剂、方法很多。最早使用多克隆抗体检测的放射免疫法。随后，相继报道了运用单克隆抗体检测的各种不同的酶免疫法和胶体金层析法。临床应用研究中发现，各种方法测定结果之间差异很大，最大可差36倍。其原因在于各种cTnI检测方法采用的抗体各不相同；cTnI分子内的不同片段和不同抗原决定簇受氧化-还原反应、磷酸化反应或蛋白水解酶作用等而降解的影响各不相同；不同形式(游离或复合物形式)的cTnI对不同抗体的免疫反应性也各不相同；且各生产厂商的cTnI校准品各不相同，甚至使用同一份标定cTnI值的人血清进行校准也未能完全消除不同测定系统之间测定值的差异。为加快检测速度，许多检测系统设计采用血浆或全血标本。抗凝剂的选用是否得当将直接影响检测结果。例如，使EDTA(Ca2+螯合剂)可促使cTnI-TnC复合物的解离，使游离型cTnI增加；什素亦可引起cTnI或cTnI检测值降低，因此有人提出采用血清标本可能更合适。溶血或纤维蛋白原甚至为风湿因子有时也可对某些cTnI测定方法产生一些影响。此外，还有标本中cTnI的稳定性，注意标本保存时间和保存温度，也会对结果产生影响。用于检测cTnI的快速诊断试剂盒也有多种，与定量检测存在的问题相同，由于各种试剂盒出自不同的试剂厂商，缺乏方法上的标准化，其测定值的可靠性同样存在问题。
测定CRP的方法最早是1930年由Tillett建立的。在试管中将患者血清与肺炎双球菌混合，通过肉眼观察是否有凝集现象来判断患者是否有感染。到1950年，Anderson McCarly首次利用兔建立抗CRP血清的毛细管沉淀实验，以及后来基于沉淀实验改进的各种免疫扩散法，这些方法由于灵敏度差、检测时间长、影响因素多而限制了临床应用。目前，临床实验室测定CRP的常规方法主要有胶乳凝集试验和免疫浊度法(如散射、透射比浊法，并且已实现了自动化)以及标记免疫测定方法(放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法和化学发光法)欧盟临床实验室标准化委员会(ECCLS)在WHO和IFCC支持下，研制成人血浆蛋白参考标准CRM470，CRP是其中14个被测物之一。该制品已供给各厂商标化。这些方法同样也存在着上述缺陷和问题。
其他疾病临床指标也存在着上述缺陷和问题。

发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，设计一种生物芯片来进行定量测试。
本发明的技术方案生物芯片定量检测方法，其主要技术特征在于(1)生物芯片为双孔芯片，分别为检测窗口和校正窗口；(2)在检测窗口中，将多种包被抗体用点样机以矩阵形式固化于硝酸纤维素膜(NC膜)上；(3)在校正窗口中，将与检测窗口相应的多种校正体以矩阵形式固化于硝酸纤维素膜(NC膜)上，直接加入生物素标记的配对抗体及亲和素标记的胶体金，在膜上形成可见红色斑点。
(4)在检测窗口中加入待检标本，如待检标本中有特异性抗原则与之发生特异性免疫结合反应，并在NC膜上形成抗原-抗体免疫复合物，再加入生物素标记的配对抗体及亲和素标记的胶体金即可在膜上形成可见红色斑点。
(5)生物芯片识别仪判读时，先对检测窗口进行灰度扫描，再对校正窗口进行灰度扫描，根据校正窗口的灰度值先对检测品的灰度进行校正，将校正后的灰度值带入预先设置在识别仪中的标准曲线中，即可得出该样本中目的抗原的含量。
采用本发明方法的优点和效果在于利用生物芯片高通量的特点，将数个指标集成在一张芯片上，一次操作可同时得出数个指标的检测结果。
具体而言，仍然以AMI(心肌梗死)为例说明选择的检测指标中MB、CK-MB、cTnI是目前国际上公认的急性心梗(AMI)病人特异性诊断指标，联合测定其敏感性和特异性分别高达98.9％和99.9％。再加上近年来发现的一个新的心脏损伤生化标志物——高敏C反应蛋白，更有利于快速和准确地诊断心肌梗塞。防止心梗的漏诊、误诊、延误病情。
CK-MB采用质量分析的方法，测定时间短，避免了活性检测中可能遇到的干扰，具有良好的灵敏性和准确性，并适合于自动化，因而优于其他检测CK-MB的方法。
C-反应蛋白的检测为高敏检测，可检测出低水平(0.2-6.4mg/L)的CRP浓度变化，这一变化范围对急性心肌梗死预测和预防具有重要意义。
采用专用阻断剂，消除了人体内抗鼠抗体的干扰，使检测结果更加准确、可靠。
采用专有的芯片识别仪系统实现了全定量、自动化检测，避免了传统方法中由于人为因素造成的误差，还可对病人进行跟踪检测，了解病情发展情况。生物芯片采用独立包装，可单人份操作。
芯片操作简单、快速，十几分钟即可出结果，适合于床边检验(POCT)。


图1——生物芯片定量检测AMI病症临床指标原理示意图。
图2——Mb剂量反应检测曲线示意图(其它指标同理)。
图1说明(每三个相同的空心圆点为同一指标点)1CK-MB指标检测点 5CK-MB指标校正点2MB指标检测点 6MB指标校正点3cTnI指标检测点 7cTnI指标校正点4HsCRP指标检测点 8HsCRP指标校正点9质控点(所有实心黑点)具体实施方式
以检测AMI(心肌梗死为例)指标为说明如下(具体操作步骤如图1所示)1.在芯片上标记样品编号。
2.在芯片的检测、校正窗口内分别滴加4滴试剂A通用洗涤液，使NC膜表面完全湿润。
3.将待检血清100μl，滴入2滴试剂Y阻断剂，混匀后室温放置30秒，将人血清中可能存在的抗鼠抗体先结合掉，以避免抗鼠抗体对反应的干扰。
4.待试剂A通用洗涤液完全渗入后，将试剂Y阻断剂处理后的血清均匀加入芯片检测窗口内，若无试剂Y阻断剂，则将血清直接加入芯片检测窗口内。
5.待血清完全渗入后，加入6滴试剂B通用洗涤液，以冲掉附在NC膜上血清中的杂质。
6.待试剂B通用洗涤液完全渗入后，加入2滴试剂X生物素化抗体，以待测的特异性抗原结合。
7.当校正窗口试剂A通用洗涤液完全渗入后，也加入2滴试剂X生物素化抗体。
8.待试剂X生物素化抗体完全渗入后，分别加10滴试剂C金标亲和素入芯片检测窗口、校正窗口，与生物素化抗体结合进行显色。
9.待试剂C金标亲和素完全渗入后，分别加入6滴试剂D通用洗涤液，冲掉附在NC膜上的未与生物素化抗体结合的试剂C金标亲和素，使背景更加清晰。
10.待试剂D通用洗涤液完全渗入后，于30分钟内将芯片放入识别仪中进行自动资料储存及结果分析。检测顺序，先阅读检测窗口，然后是校正窗口。
芯片组成如下表

在上述试剂中，试剂C金标亲和素、试剂X生物素化抗体对检测系统有放大检测信号作用，使灵敏度更高。试剂C金标亲和素即亲和素标记的胶体金，与包被抗体-抗原-生物素化抗体复合物中的生物素结合，生物素与亲和素有很强的亲和力，一经结合就极为稳定，又由于亲和素与红色的金颗粒结合，因而可以起到显色作用，使抗原抗体反应可视化。试剂X生物素化抗体与包被在NC膜上的抗体是针对某一抗原的一对配对抗体；如果待检样本中有待测抗原，该抗原就会先与膜上的抗体结合，在加入试剂X生物素化抗体后，会与此抗原抗体的复合物结合。试剂Y阻断剂采用的是鼠抗IgG，在双抗夹习实验中，血清中如存在抗鼠抗体(HAMA)，就会在鼠包被抗体与鼠标记抗体之间起桥联作用而假阳性结果；抗鼠抗体也同样可与鼠包被抗体或鼠标记抗体结合，使其不能与待测物结合而导致假阴性结果；因此，血清加入芯片前先用阻断剂处理，将血清中可能存在的抗鼠抗体结合掉，使之不会干扰下面的芯片反应，避免由于抗鼠抗体的存在而可能造成的假阳性、假阴性结果。
结果判定原则生物识别仪分别测定检测、校正窗口中各点的灰度值。根据各抗原校正点的灰度值自动校正与之对应的检测点的原始灰度值，然后将检测点的校正灰度值代入剂量-反应曲线给出各指标的检测结果。校正原理剂量-反应曲线Y＝aXb(注这里的灰度值X为软件读出的灰度值)假设出厂时校正窗口的理论灰度值为Xa；实际检测时，校正窗口的实际灰度值为Xb，检测窗口的实际灰度值为Xo，则检测窗口的理论灰度值为X，X＝Xo*Xa/Xb，将X带入方程Y＝aXb中，即可计算出相应的浓度值Y。
例如出厂时校正窗口的理论灰度值为110，实际检测时，校正窗口的实际灰度值为100，检测窗口的实际灰度值为150，则检测窗口的理论灰度值为X＝150*110/100＝165，将灰度值165带入剂量-反应曲线方程中，可计算出Mb(Y)的含量为342.1ng/ml。如图2所示。其他指标的曲线类似。
本发明实施例中只是以AMI(心肌梗死)病症临床指标检测为例来说明本发明的原理和步骤及方法，本发明并不仅仅局限于AMI(心肌梗死)病症临床指标的检测，对其他病症临床指标的检测都有实际意义。诸如细胞因子、唐氏综合症之定量检测均适用本方法。
权利要求
1.生物芯片定量检测方法，其特征在于(1)生物芯片为双孔芯片，分别为检测窗口和校正窗口；(2)在检测窗口中，将多种包被抗体用点样机以矩阵形式固化于硝酸纤维素膜(NC膜)上；(3)在校正窗口中，将与检测窗口多种包被抗体相应的多种校正抗原以矩阵形式固化于硝酸纤维素膜(NC膜)上，直接加入生物素标记的配对抗体及亲和素标记的胶体金，在膜上形成可见红色斑点。(4)在检测窗口中加入待检标本，如待检标本中有特异性抗原则与之发生特异性免疫结合反应，并在NC膜上形成抗原-抗体免疫复合物，再加入生物素标记的配对抗体及亲和素标记的胶体金即可在膜上形成可见红色斑点。(5)生物芯片识别仪判读时，先对检测窗口进行灰度扫描，再对校正窗口进行灰度扫描，根据校正窗口的灰度值先对检测品的灰度进行校正，将校正后的灰度值带入预先设置在识别仪中的标准曲线中，即可得出该样本中目的抗原的含量。
全文摘要
本发明涉及一种生物芯片的定量检测方法。本发明采用将生物芯片分为检测、校正窗口，在检测窗口中放入多种包被抗体并固化于硝酸纤维素膜上，在校正窗口中放入与检测窗口包被抗体相应的校正抗原并固化于硝酸纤维素膜上，加入配对抗体、胶体金；在检测窗口中加入待检标本，使特异性抗原与抗体反应，形成抗原－抗体免疫复合物；先对检测窗口进行灰度扫描，再对校正窗口扫描，将校正窗口灰度值对检测品灰度进行校正，再将校正后的灰度值代入标准曲线中，得出待检标本中的抗原含量。本发明利用生物芯片高通量特点，将数个指标集成一张芯片上，同时得出数个指标的检测结果，解决了以往方法存在的操作复杂、费时、可靠性差及无法标准化的缺陷。
文档编号G01N33/547GK1588075SQ200410064799
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者关海军 申请人:南京大渊生物技术工程有限责任公司