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专利名称：确定草药品质的新颖方法
技术领域：
本发明涉及一种确定草药品质的方法。特别是，本发明是利用生物芯片的技术检测出存在于草药中所需的生物活性成份。
背景技术：
许多年来，草药(整株植物)已应用于医疗上。通常是以熬煮液或茶的方式服用草药，或以糊浆的方式外用糊覆草药。然而，实际经验显示，相同品种的草药的个体，当以相同的方式处理时，可存有医疗功效上显著的差异。
草药的成份通常是许多化合物的混合物，其中某些化合物可能具有生物活性且可能对人体和动物具有治疗功效。草药的成份中化合物种类和/或其相对含量可能会改变，该改变取决于草药个体的遗传信息及该草药生长时的天然条件，诸如栽种的地理位置，土壤组成，水质，气候(包括温度和湿度)，阳光照射强度及生长时间。
草药对人体和动物的医疗功效取决于该草药所含有的数种活性化合物及其相对含量。草药个体所含有的活性化合物量愈高，该草药个体显示愈高的治疗功效。科学上对检测草药所含有的所需活性成份及其相对含量并无指引，甚至当该草药已知具有特定的治疗功效时也是这样。判断已知对人体和动物具有治疗功效的草药个体的品质，通常基于熟悉草药人士的经验，其系藉由观察草药的体型、外观及颜色、嗅闻草药的气味、和/或咀嚼草药的组织。对人体和动物具有治疗功效的草药，现有技术并未教示或暗示可藉由科学的方法能确定该草药的品质(即，存在所需的活性成份和/或其相对含量)。
美国专利号6,156,291揭示一种可重复萃取植物的化学成份的药理活性混合物的方法，其中该方法可改进该药理活性成份的混合物的品质控制。
为确定具有特定医疗用途的草药个体的品质，本领域首先需要发展出一种科学性方法，其能够检测出并确定草药个体含有所需的医疗活性成份，使得该含有所需的医疗活性成份及治疗功效的草药个体能够被筛选得到，而其它不含有该医疗活性成份的草药个体，甚至包括相同物种的其它草药个体，可被排除而不予使用。
发明简述本发明的一个方面涉及一种确定草药品质的方法，其是通过利用生物芯片的技术以检测出存在于草药中所需的生物活性成份。
本发明的另一个方面涉及一种确定在不同地区所栽种的人参的品质的方法，它是通过利用生物芯片的技术以检测出存在于人参中能够与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)专一性结合的生物活性成份。
附图简述

图1A显示韩国所栽种的人参(Pana ginseng C.A.Meyer；称为高丽参)的粗干根的粉末的甲醇萃取液的高效液相层析(HPLC)的轮廓图，及该HPLC分级液的荧光图像。
图1B显示中国吉林地区所栽种的人参(Pana ginseng C.A.Meyer称为吉林参)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC轮廓图，及该HPLC分级液的荧光图像。
图1C显示韩国所栽种的人参(Pana ginseng C.A.Meyer称为白高丽参)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC轮廓图，及该HPLC分级液的荧光图像。
图1D显示中国长白山地区所栽种的人参(Pana ginseng C.A.Meyer称为东洋参)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC轮廓图，及该HPLC分级液的荧光图像。
图1E显示美国Wisconsin州所栽种的人参(Pana ginseng C.A.Meyer称为西洋参)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC轮廓图，及该HPLC分级液的荧光图像。
图2A显示中国西南地区所栽种的三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC轮廓图，及该HPLC分级液的荧光图像。
图2B显示中国西南地区所栽种的三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的粗干根(称为三七粒)的粉末的甲醇萃取液的HPLC轮廓图，及该HPLC分级液的荧光图像。
发明详述本发明提供一种确定草药品质的方法，它是通过利用生物芯片的技术以检测出存在于草药中所需的生物活性成份。
本发明的方法包括下述的步骤利用HPLC分级草药萃取液以得到草药萃取液的分级样品，将该草药萃取液的分级样品以微阵列的方式加载至已经预先处理过的涂覆塑料载片上，及进行杂交反应及信号检测。
草药系首先经研磨成微细粉末并利用溶剂进行萃取。可用于本发明的溶剂包括水、C1-6醇、C1-6醚，及其组合。随后，离心该草药萃取液，并浓缩所得到的上清液。利用HPLC分级该浓缩的上清液，同时监控该分级液的吸光度。收集所得到的分级液。
塑料载片的材料可为同聚物或共聚物，其是由一种或多种单体的聚合所制备，该单体系选自乙烯、卤化乙烯、丙烯、卤化丙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丁二烯、丙烯腈、降冰片烯或苯乙烯，其中苯乙烯的聚合物是优选的。该塑料载片的材料亦可为聚碳酸酯。该塑料载片的大小相当于微阵列器或激光扫描仪所常用的载片大小。本发明的方法所使用的塑料载片的优点在于可使用各种不同的化学药剂以处理该塑料载片的表面，使得不仅是大分子(诸如蛋白质和DNA)，亦包括小分子(诸如草药的代谢物)可固定于该塑料载片的表面上。此优点若对照常用的玻璃载片仅能用于固定大分子(诸如蛋白质和DNA)的事实尤显得重要。再者，塑料材料可易于模制成所需的形状，且亦具有成本低的优异性。于本发明的优选体系中，该塑料载片具有2个凹槽。得自于草药的分级液的样品可栏格化地点样于该凹槽的表面上，且随后可将含有探针的溶液加到该凹槽上以进行杂交反应。该2个凹槽的深度可为相同或不同，且介于低于0.03毫米至高达0.5毫米的范围内。进一步，经模制后，每1个凹槽的相对2边可分别含有栏杆以用于支撑盖玻片，其中该盖玻片用于防止蒸发或损失该加载至该凹槽上的含有探针的溶液。
该塑料载片的预先处理可利用多官能团醛及随后浸没于提供NH2基团的前体溶液中，以使得所生成的塑料载片在其表面上含有活性胺基。该提供NH2基团的前体可以是有机物或无机物，且可选自NH4OH、伯胺，仲胺或叔胺，其中该伯胺，仲胺及叔胺的脂族和/或芳香族部份可用于充作额外的间隔子。对于该提供NH2基团的前体，能直接提供自由NH2基团的NH4OH是优选的。
在本发明中，该塑料载片上的涂层可由多官能团分子(例如，多官能团环氧化物)所构成，它起到间隔子的作用。该多官能团环氧化物的作用将草药所含的成份连接到该经先期处理的塑料载片上。该多官能团环氧化物的一端的活性环氧基与该经先期处理的塑料载片的表面上的胺基反应，而该多官能团环氧化物的另一端的活性环氧基吸附草药所含的成份或与草药所含的成份反应。具体说，草药成份中含有自由羟基、巯基和/或胺基的化合物能与该多官能团环氧化物的另一端的活性环氧基形成共价键，因而该化合物能够连接至该经涂覆的塑料载片上。该多官能团环氧化物优选含有6-24个碳原子长的化学链，使得草药所含的成份不会直接地结合或吸附到该经先期处理的塑料载片上。在本发明中，每1个点样样品对经涂覆的塑料载片的结合是牢固的，甚至经严谨的脱离冲洗后亦然。重要的是在本发明中，不仅是大分子(诸如蛋白质和DNA)，亦包括小分子(诸如代谢物)都可以以均一相或非均一相的方式固定于该经涂覆的塑料载片的表面上。
在本发明的方法中，对将草药萃取液的分级样品以微阵列的方式加载至该经涂覆的塑料载片上的步骤，该草药萃取液的分级样品系藉由应用高密度栏格技术并利用微阵列器以微阵列的方式点样且固定于该经涂覆的塑料载片的栏格面积上，其中每1个样品点可含有呈均一相或非均一相的草药成份。在本发明的方法中，可使用整合性微小化技术(integrating miniaturizationtechnology)以增加该经涂覆的塑料载片上栏格样品的密度。
在本发明的方法中，检测草药中存在所需的生物活性成份以确定该草药的品质是基于标的物导向的方式，其包括将含有标记探针的溶液加载至该经涂覆的塑料载片的凹槽上以进行杂交反应(其中可利用玻璃片盖住每一个凹槽以防止该含有标记探针的溶液的蒸发)，及利用仪器(例如，激光扫描仪)以显像并鉴定出能与该标记探针结合或反应的样品点样点。本发明的方法所使用的探针是基于已确定的分子机制且呈均一相或非均一相的已知标的物，其可为，例如，拮抗诸如选择的细胞、受体、肽或蛋白质类的小分子化合物，竞争性配体、或抗体。该连接探针的标记物可为染料或放射性物质。
本发明的优选方面是提供一种确定在不同地区所栽种的人参的品质的方法，其是利用生物芯片的技术检测出存在于人参中能够与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)专一性结合的生物活性成份。具体的，经生物素标记的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和经Cy3标记的链霉亲和素(strepavidin)作为探针进行杂交反应。在本发明的方法中，若观察到显示经处理的塑料载片上样品点样点中的成份与经生物素标记的TNF-α结合的信号，其显示该样品点样点的成份中存有至少1种候选化合物，其具有类似于拮抗TNF-α的生物活性。这些候选化合物可用于治疗自身免疫疾�。�诸如类风湿性关节炎。
在功效上，本发明的方法可用简单的方式迅速地检测出存在于草药中所需的生物活性成份并进一步确定该草药的品质。
下述的实施例仅用于进一步举例说明本发明的方法，但本发明的范围不应以下述的实施例为限。
实施例实施例1利用高效液相层析(HPLC)分级人参萃取液将栽种于不同地区所得到的干燥人参(参阅表1)研磨成微细粉末，随后于真空下进行包装以利长期贮存。室温下，对每一种人参的研磨粉末(50克)，利用甲醇(500毫升，HPLC等级)藉由匀浆机(OMNI)进行连续掺合5分钟以完成萃取。在4℃和8000rpm下，离心所生成的萃取液达30分钟，随后以上述相同的方法，对该残余物(片状沉淀)进行再次萃取和离心(重复2次)。收集所得到的澄清上清液，随后利用旋转式蒸发器(Laborota 4000，HEIDOLPH)将该上清液浓缩为最终体积30毫升。将由50％水和50％乙醇所组成的混合物加入到该浓缩的上清液中，使其体积为50毫升，随后利用磁性搅拌棒进行混合20分钟。在4℃和8000rpm下，离心所生成的溶液30分钟。在室温和12000rpm下，离心所得到的澄清上清液10分钟，随后分析所生成的澄清上清液。
利用HPLC进行分析。将上述所生成的澄清上清液(0.1毫升)加载TSK凝胶ODS-80TM管柱(4.6毫米×15厘米，5微米填料，TOSOH，先前已用水平衡)中，随后以0-100％乙醇的二次蒸馏水梯度溶液进行洗脱(流速0.75毫升/分钟)96分钟。在波长205纳米下，持续监控洗脱液的吸光度。该吸光度的结果显示于图中，其中图1E(关于栽种于美国Wisconsin州的人参)所显示的轮廓图系不同于图1A、1B、1C和1D所显示的轮廓图，此结果显示该HPLC轮廓图的差异是由于栽种人参的地理区域的不同。在该0到96分钟期间，以0.75毫升/分钟/分级液的方式收集洗脱液，其中每一个分级液(含有人参的成份)的0.225毫升是由利用自动化液体处理系统(MultiProbe II，PACKARD)转移到一式三份的每一个96孔圆底微量滴定板上。所生成的含有干燥的人参成份的微量滴定板可立即进行活性分析或可加以贮存以便于以后使用。
实施例2预先处理塑料载片及制备经涂覆的塑料载片利用苯乙烯的聚合物制备模制的塑料载片，它含有2个凹槽。该模制塑料载片的大小相当于微阵列器或激光扫描仪所使用的常用玻璃载片，其中该凹槽的深度是0.05毫米。
首先，在室温下将该模制塑料载片浸没于0.4％戊二醛溶液(pH5.0)中达4小时，随后经水冲洗并在60℃下浸渍于3M NH4OH(pH11.0)的溶液中达4小时。在37℃下，利用100mM 1，4-丁二醇二醛水甘油醚(pH11.0)过夜处理所生成的塑料载片。最终，利用0.1M NaHCO3溶液(pH8.0)冲洗该塑料载片，并令其干燥。
实施例3利用微阵列方式加载样品至经涂覆的塑料载片上利用微阵列器(BioGrid II，BIOROBOTIC)将样品点样至实施例2所制备的经涂覆的塑料载片上。令上述实施例1的微量滴定板所含有的干燥人参成份溶解在30％ DMSO/0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.5)中以形成最终体积为16微升/孔。利用4号针(内径0.4毫米)管件，将该人参成份样品自该96孔微量滴定板加到该经涂覆的塑料载片的凹槽表面上。将生物素肼(biotin hydrazide)溶液(20微克/毫升)点样于该经涂覆的塑料载片的凹槽表面上，作为对照组。在该经涂覆的塑料载片的凹槽表面上的斑点经干燥后，将所生成的塑料载片在37℃下浸没于1M乙醇胺溶液(pH8.0)中达2小时。
实施例4杂交反应及信号检测利用生物素化的肿瘤坏死因子-α(B-TNF-α)和经Cy3标记的链霉亲和素(strepavidin)作为进行杂交反应的探针。对实施例3的每一个经处理的塑料载片的2个凹槽分别覆盖玻璃片(22毫米×22毫米)，随后将20微升B-TNF-α的TBST缓冲液(0.5微克/毫升，含有50mM Tris-HCl，pH7.3，0.15M NaCl和0.05％Tween 20)加到该经处理的塑料载片的凹槽上，并于37℃下进行培育2小时。利用该TBST缓冲液冲洗经处理的塑料载片4次，随后在37℃下干燥，并覆盖如上所述的玻璃片。对每一个凹槽加载经Cy3标记的链霉亲和素(20微升)。随后令该塑料载片于37℃下静置2小时，进而利用该TBST缓冲液冲洗4次，并利用二次蒸馏水轻洗4次。令经处理的塑料载片于37℃下干燥，并利用激光扫描仪(GenePix4000，AXON)进行扫描。该扫描的图像如图所示。
图像上的绿色荧光斑点显示在该人参样品中存有至少一种活性成份，它能与B-TNFα结合。自图像上所显示的人参(Pana ginseng C.A.Meyer)样品的显影结果可知，仅有源自于图1A的分级液60-72(其得自于韩国所栽种的人参粗干根的萃取液)的样品显示与B-TNFα结合的活性。该存在于上述的分级液60-72中具有与B-TNFα结合的活性的活性成份可能系一种人参皂苷(ginsenoside)，因为人参皂苷是人参主要的具生物活性的化合物，且已显示于鼠或人体的巨噬细胞中作为TNFα拮抗剂(参阅文献Planta Med.2001 67213-218)。另外，源自于图2B的分级液3-16(其系得自于三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的粗干根的萃取液)的样品，亦显示能与B-TNFα结合的活性。
表1

权利要求
1.一种确定草药品质的方法，其特征在于，该方法包括步骤利用高效液相层析(HPLC)分级草药萃取液，得到草药萃取液之分级样品；将该草药萃取液的分级样品以微阵列方式加到已经预先处理的涂层塑料载片上；和进行杂交反应及信号检测以检测出存在于该草药中所需的生物活性成份。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在该方法中首先利用溶剂萃取所述草药，所述溶剂选自水、C1-6醇、C1-6醚，或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过HPLC所得到的草药分级液呈均一相或非均一相。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述草药分级液含有所述草药的二级代谢物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该塑料载片具有2个凹槽且该分级样品固定于该凹槽表面。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该塑料载片的材料是聚碳酸酯、或由1种或多种单体所制备的同聚物或共聚物，所述单体选自乙烯、卤化乙烯、丙烯、卤化丙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丁二烯、丙烯腈、降冰片烯或苯乙烯。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该塑料载片的材料是苯乙烯的聚合物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在涂覆所述塑料载片前，利用多官能团醛和随后浸没于提供NH2基团的前体溶液中以预先处理该塑料载片。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多官能团醛是戊二醛。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述提供NH2基团的前体是NH4OH。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述涂层是由多官能团分子所构成的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多官能团分子是在每1个末端含有至少1个环氧基的多官能团环氧化物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在该多官能团环氧化物的一端的环氧基与该经预先处理的塑料载片的表面上的胺基反应。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在该多官能团环氧化物另一端的环氧基与草药成份的自由羟基、巯基或胺基反应。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该多官能团环氧化物含有6-24个碳原子长的化学链。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该草药是人参。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，该人参栽种在不同的地区。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，该人参所含的所需的生物活性成份能够与肿瘤坏死因子-α专一性结合。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法利用含有标记探针的溶液进行杂交反应。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，该含有标记探针的溶液呈均一相或非均一相。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该标记是染料或放射性物质。
全文摘要
本发明涉及一种确定草药品质的新颖方法，它包括利用生物芯片技术检测出存在于草药中所需的生物活性成份。
文档编号G01N33/543GK1459631SQ0212005
公开日2003年12月3日 申请日期2002年5月14日 优先权日2002年5月14日
发明者徐立伟, 张素真 申请人:先进基因股份有限公司