专利名称：荧光光谱校正方法和荧光光谱测量装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光光谱校正方法和荧光光谱测量装置。具体而言，本发明涉及用于针对每个染料(pigment，色素)而对从标记有多个荧光染料的微粒获得的荧光光谱进行分离的技术。
背景技术：
一般而言，当分析诸如细胞、微生物和脂质体的微粒时，使用流式细胞术(流式细胞仪)(例如，参加2006年8月31日Shujunsha有限公司出版的第二版Hiromitsu Nakauchi 编辑的"Cell Engineering Additional Volume Experiment Protocol Series Flow Cytometry Freely”)。流式细胞术是一种利用特定波长的激光(激发光)照射在流路中在一行中流动的微粒，并且检测由微粒发出的荧光或散射光，从而对多个微粒进行逐个分析的方法。在流式细胞术中，将光学检测器检测到的光转换为电信号值，进而执行统计分析从而确定单个微粒的类型、大小、结构等。
近来，在基础医疗科学和临床领域，为了促进综合分析，存在着很多同时使用多个分子探针的情况。因此，快速积累生物知识，并且增进了对生命现象的理解。因此，即使在流式细胞术中，使用多个荧光染料的多色分析也已广泛使用(例如，参加日本未审查专利申请公开第2006-230333号和PCT日文翻译专利公开第2008-500558号)。
同时，当在一个测量中按照与多色分析相同的方式使用多个荧光染料时，与荧光染料数量相对应的高灵敏度检测器是必需的。来自检测器的非预期荧光染料的光混入，因此分析质量控制降低。在相关技术的流式细胞仪中，由于仅从预期荧光像素获取期望的光学信息，因此当将光学检测器检测到的光转换为具有一定值的电信号时，执行数学校正，即荧光校正。
然而，在相当多的荧光校正中，由于是通过观察者的肉眼区分检测器所检测到的非预期光，因而可能发生人为误差，并因此可能不正确。因此，观察者必须熟知该装置且必须经培训来使用该装置，同时具有细胞、荧光染料、抗体等知识。因此，观察者必须具有高度专业化的知识。
在相关技术中，提出了光谱去卷积方法，将已使用过的荧光标记的光发射光谱提前注册在计算机中、使用数据将测量目标的光发射光谱分离为荧光标记的光发射光谱，并且确定荧光标记的存在率(参见日本未审查专利申请公开第2005-181276号)。在相关技术中，在诸如红外光谱方法的光谱吸收光测量中，基于标准光谱或参考光谱，执行对测量到的光谱的校正或分析(例如，参见日本未审查专利申请公开第2005-195586号以及第 2009-162667 号)。发明内容
然而，在相关技术的设置有多个高灵敏度检测器的微粒分析装置中，由期望检测器以外的检测器所检测的杂散荧光是一个大问题，并且必须准备对应于期望的荧光染料数量的高灵敏度检测器。具体地，在光谱接近于荧光染料的实例中，由于杂散荧光因此不能执行荧光校正。
因此，即使在布置了多个高灵敏度检测器时，对于相关技术的微粒分析装置同时可检测到的荧光染料的数量也有限制。例如，类似于不具有多个高灵敏度检测器的光谱型流式细胞仪，可在杂散荧光存在的情况下使用的下一代流式细胞仪是必需的。
如上所述，每个荧光染料具有特定的光谱，并且表示荧光染料本身特性的光谱信息成为重要数据。然而，为了准确估计在每个光谱之间的重叠，并且以高精确度执行荧光校正，单染色样本的数据是必需的。
为此，工作者必须准备用于每个荧光染料的单染色样本，并且随着所使用的染料数量的增加，工作量也增加。相应地，工作者的负担增加，工作效率降低。荧光校正操作的数量基本上与所用的荧光染料数量的平方成比例，进而这对于观察者来说很麻烦。作为实际问题，诸如可收集血液的测试目标对象的量是有限的，因此存在着以下情况，难以为每个荧光染料制作单染色样本。
在本发明中，期望提供一种荧光光谱校正方法和荧光光谱测量装置，其即使在没有准备用于每个荧光染料的单染色样本时，也能够以高精确度消除每个光谱之间的重叠。
根据本发明的实施方式，提供了一种荧光光谱校正方法，包括将从标记有多个荧光染料的微粒获取的荧光光谱与参考光谱进行比较，从而将荧光光谱分离为针对每个染料的荧光光谱，其中将先前测得的光谱数据用作参考光谱。
在该校正方法中，可以将与单染色样本的误差等于或小于8%的光谱数据用作参考光谱。
在该校正方法中，将测量日期、检测器的电位、耦合抗体的类型以及当微粒是细胞时的细胞类型中的任一项不同的荧光光谱数据用作参考光谱。
在该校正方法中，当微粒是细胞时，可以将使用细胞测得的荧光光谱数据用作参考光谱。
根据本发明的另一实施方式，提供了一种荧光光谱测量装置，包括检测单元，在任意波长区域中同时检测从微粒发射出的荧光光线；分析单元，将检测单元检测到的数据分离为针对每个染料的荧光光谱；以及存储单元，存储由分析单元分离出的荧光光谱数据， 其中分析单元将存储在存储单元中的先前测得的荧光光谱数据用作参考光谱，从而执行对荧光光谱的分离。
在该装置中，检测单元可以设置有多通道光电倍增管。
根据本发明的实施方式，由于使用了先前测得的荧光光谱数据，因此单染色样本不是必需的，能够以高精确度消除每个光谱之间的重叠，此外单染色样本也不是必需的。
图1是示出了根据本发明第一实施方式的荧光光谱测量装置的构造的框图。
图2A是示出了测量日期和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号，垂直轴是荧光强度，图2B是示出了在每个波长(FITC:CD14)中的误差的曲线图。
图3A是示出了测量日期和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号，垂直轴是荧光强度，图3B是示出了在每个波长(PE :CD3)中的误差的曲线图。
图4A是示出了测量日期和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号，垂直轴是荧光强度，图4B是示出了在每个波长(对应于BD 7色设置微球的FITC 的光谱)中的误差的曲线图。
图5A是示出了测量日期和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号，垂直轴是荧光强度，图5B是说明在每个波长(对应于BD 7色设置微球的PE的光谱)中的误差的曲线图。
图6A是示出了检测器的电位和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图6B是示出了每个波长中的误差的曲线图。
图7A是示出了耦合抗体和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图7B是示出了在每个波长(FITC ⑶45对FITC ⑶45RA)中的误差的曲线图。
图8A是示出了耦合抗体和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图8B是示出了在每个波长(PE ⑶8对PE:⑶3) 中的误差的曲线图。
图9是用于管理精确度的血液细胞的密度点图，其中水平轴是荧光染料FITC、抗体CD45的数据，垂直轴是荧光染料PE、抗体CD8的数据。
图10是分析结果，其中水平轴是荧光染料FITC、抗体CD45RA的数据，垂直轴是荧光染料PE、抗体CD3的数据。
图IlA是示出了微粒的类型和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图1IB是示出了每个波长中的误差的曲线图。
图12A是示出了微粒的类型和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图12B是示出了在每个波长中的误差的曲线图。
图13是分析结果，其中水平轴是包含BD 7色设置微球的荧光染料FITC的聚苯乙烯微球的数据，垂直轴是包含BD 7色设置微球的聚苯乙烯微球的数据。
具体实施方式
在下文中，将参照附图详细描述本发明的实施方式。本发明并不受限于下述实施方式。按以下顺序进行描述。
1.第一实施方式
未使用单染色样本的荧光光谱校正方法的实施例
2.第二实施方式
未使用单染色样本的荧光光谱测量装置的实施例
1.第一实施方式
校正方法
首先，将描述根据本发明第一实施方式的荧光光谱校正方法(以下，简称为校正方法)。在该实施方式的校正方法中，当对从标记有多个荧光染料的微粒获取的荧光光谱进行针对每个染料的分离时，将先前测得的荧光光谱用作参考光谱。
此处，“微粒”宽泛地包括诸如细胞、微生物和脂质体的仿生微粒，或者诸如乳胶颗粒、凝胶颗�：凸ひ悼帕５暮铣煽帕�。仿生微粒包括构成各种细胞、脂质体、线粒体、细胞器(细胞器官)等的染色体。细胞包括植物细胞、动物细胞、血球细胞等。微生物包括诸如大肠杆菌的杆菌、诸如烟草花叶病毒的病毒、诸如酵母菌的细菌等。仿生微�？梢园� 诸如己烷、蛋白质及其复合物的聚合物。
工业颗粒可以(例如)由有机聚合物材料、无机材料或金属材料形成。可以将聚苯乙烯，苯乙烯二乙烯苯，聚甲基丙烯酸甲酯等用作有机聚合物材料。可以将玻璃、硅、磁性材料等用作无机材料。例如，可以将金胶体、铝等用作金属材料。微粒的形状一般是球形的， 但也可以是非球形的，并且大小、质量(mass)等也不受特别地限制。
在该实施方式的校正方法中，在用作参考光谱的光谱数据中，与测量目标微粒的单染色样本光谱的误差优选地小于或等于8%，更优选地为小于或等于3%。因此，与测量数据的匹配误差较�。芄灰愿呔范戎葱杏庑Ｕ�。
具体而言，在每个染料的参考光谱中，可以使用例如，测量日期、检测器的电位、激光器的输出、微粒的通量、耦合抗体的类型、或当微粒是细胞时不同类型细胞的数据(荧光光谱)。由于这些条件对荧光光谱没有大的影响，因此即使在参考光谱中使用这种光谱数据来执行校正时，也能够以高精确度消除重叠。
然而，当微粒是细胞时，例如即使当微粒标记有相同的荧光染料时，也不将从使用了微球的测量所获取的结果用作参考光谱，微粒不是细胞的情况也是一样。如上所述，即使细胞的类型之间存在差异，也可以将它们用作参考光谱。当然，即使微球的类型之间存在差异，也可以将它们用作参考光谱。
在该实施方式的校正方法中，由于将与先前测得的测量目标微粒的单染色样本的误差小于或等于8%的光谱数据用作参考光谱，因此无需在测量阶段准备单染色光谱。因此，减轻了工作者的负担，进而也提高了工作效率。即使在测试目标对象的量较小时，诸如老鼠的小型动物，也可以在不降低精确度的情况下执行分析。
在本实施方式的荧光光谱校正方法是具有以下处理的方法时，即利用参考光谱将从标记有多个荧光染料的微粒获取的荧光光谱针对每个染料进行分离的处理，则不论在该方法前后的处理，均可以适用该方法。
2.第二实施方式
装置的总体构造
接下来，将根据本发明第二实施方式来描述荧光光谱测量装置。图1是示出了该实施方式的荧光光谱测量装置构造的框图。如图1所示，该实施方式的荧光光谱测量装置 1至少包括检测单元2、存储单元3、以及分析单元4，并且执行第一实施方式的校正方法。 图1所示的荧光光谱测量装置1可进一步包括液体传送单元。
检测单元2的配置
检测单元2可以具有以下配置，可以在任意波长区域中同时检测从分析目标微粒发出的荧光。具体而言，布置能够针对每个波长区域检测波长区的多个独立传感器，或者可以设置能够同时检测多个光线的一个或多个检测器，诸如多通道光电倍增管(PMT)。检测器 2检测到的波长区域的数量，即，在检测器2中设置的通道或传感器的数量优选地等于或大于所使用染料的数量。CN 102539397 A
该实施方式的荧光光谱测量装置1可以具有以下配置，即其中检测器2设置有分光镜，从微粒发出的荧光光线被分光镜色散，然后进入诸如多通道PMT的检测器。根据需要，检测单元2可以设置有物镜、聚光透镜、小孔、带截止滤光器、分色镜等。
分析单元3的构造
在分析单元3中，将检测单元2检测到的每个波长区域的光进行量化，从而使用电子计算器等获得总荧光数量(强度)。根据需要来使用参考光谱执行荧光光谱校正。将结果(荧光光谱数据)存储在存储单元4中。
存储单元4的构造
存储单元4存储由分析单元3处理的荧光光谱数据。例如，可以将单染色样本的荧光光谱数据以及先前测得的荧光光谱数据存储在存储单元4中。
荧光光谱测量装置1的操作
接下来，将要描述该实施方式的荧光光谱测量装置1的操作。由该实施方式的荧光光谱测量装置1分析的微粒并不受特别限制，而是可以为例如细胞或微球。修饰微粒的荧光染料的类型或数量并不受特别限制，而是可以根据需要适当地选择并使用现有的染料，诸如FITC (异硫氰化物荧光素=C21H11NO5S)、PE (藻红蛋白)、PerCP (多甲藻黄素叶绿素蛋白质)和PE-Cy5以及PE-Cy7。可以用多个荧光染料修饰微粒。
当使用该实施方式的荧光光谱测量装置1对微粒进行光学分析时，首先，从光源输出激发光并且用激发光照射在流路中流动的微粒。然后，用检测单元2检测从微粒输出的荧光。具体而言，使用分色镜、带通滤光器等，在从微粒输出的光线中仅分离特定波长的光(预期荧光)，并且使用诸如32通道PMT的检测器检测光。在该实例中，使用例如分光镜来色散荧光，并且在检测器的每个通道中检测不同波长的光。因此，可以获取检测光(荧光)的光谱信息。
此后，在检测单元2中获取的数个检测器的信息在例如转换单元(未示出)中被转换为数字信号，并且进一步在分析单元3中被量化。此时，将存储在存储单元4中的先前测得的荧光光谱数据用作参考光谱来执行荧光校正。具体而言，在每个染料的参考光谱中， 使用与微粒的单染色样本的光谱的误差小于或等于8%的荧光光谱数据，例如，测量日期、 检测器的电位、耦合抗体的类型、或者当微粒是细胞时不同类型的细胞。将经校正后的荧光光谱数据存储在存储单元4中。
在本发明的荧光光谱测量装置中，由于将与测量目标微粒的单染色样本的光谱的误差小于或等于8%的光谱数据用作参考光谱，因此即使在不使用单染色样本时，也能以高精确度执行校正。作为参考光谱的荧光光谱数据在存储单元4中顺序积累，因此可以构造适合于真实使用情况的数据库。
特别地，在将细胞用作样本时，存在难以避免检测器的电位和激光输出变化的情况。在这种情况下，在相关技术的装置中，需要再次执行校正以取得荧光校正的一致性。然而，在该实施方式的荧光光谱装置中，无需如此。
实施例
在下文中，将参照本发明的实施例详细描述本发明的优点。在该实施例中，测量日期、检测器的电位、耦合抗体的类型、以及微粒的类型是变化的，比较荧光光谱，并且研究其差异。
在该实施例中，将市售的、作为精确管理细胞的Immuno-TROL(Beckman Coulter有限公司生产)或者Multi-Check(Becton Dickinson有限公司生产)用作样本。它们是用于流式细胞术(全血液控制检查目标对象)的阳性处理控制，并且表示散射光、细胞群的分布、荧光强度、以及抗原密度，原因在于特定表面抗原的阳性率和绝对数是在单细胞中校准的。市售产品(由Beckman Coulter有限公司或者Becton Dickinson有限公司生产)用作标记有荧光染料的抗体。
根据滴定法执行对样本的染色。具体而言，将样本的温度保持为室温，然后将标记有预期荧光染料的抗体滴入专用塑料管，将50 μ L的血液滴入其中以平稳地渗透，进而抗体和细胞进行反应。将其在室温中置于暗处达20分钟。然后，将Iml的溶血剂(Beckman Coulter有限公司的FACS Lyse溶液氯化铵溶液)滴入其中。相应地，红血球溶解，粒细胞、单核细胞、以及淋巴细胞保持。使其离心分离并且用合适的溶液洗涤，因而获得高纯度的样本溶液。
在测量中，将用上述方法调整的细胞溶液(样本溶液)引入由塑料组成的、用于细胞分析的特殊测量单元中，通过用于流式细胞仪的鞘溶液执行三维聚焦，然后用激发光对其进行照射。将波长为488nm和640nm的激光束用作激发源。利用棱镜分光镜等对从每个细胞发出的荧光进行色散，然后用32通道PMT进行检测。在该实施例中，将32通道PMT用作检测器，将两个激光束用作为激发光。相应地，64个通道的光谱数据作为信息量传送至分析单元和存储单元。
每日的差异
图2A、图3A、图4A和图5A是曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图2B、图;3B、图4B和图5B是示出了每个波长中的误差的曲线图。 图2A和图2B所示的荧光光谱是将FITC用作荧光染料并且将CD14用作抗体测得的数据， 图3A和图;3B所示的荧光光谱是将PE用作荧光染料并且将CD3用作抗体测得的数据。在任何日期上使用相同的时隙。
图4A和图4B是包含BD 7色设置微球的荧光染料FITC的聚苯乙烯微球的荧光光谱。图5A和图5B是包含BD 7色设置微球的荧光染料PE的聚苯乙烯微球的荧光光谱。将 PMT用作所有的检测器，施加电压为630V。
如图2A至图5B所示，在通过调整到其他日期测得的细胞样本或者微球的光谱A 中，与光谱B的误差小于或等于8%，进而确认具有不同测量日期的光谱可用作参考光谱。
检测器的电位
图6A是示出了检测器的电位和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图6B是示出了每个波长中的误差的曲线图。图6A和图6B所示的荧光光谱是将PE用作荧光染料、将CD3用作抗体、并且将PMT用作检测器所测得的数据。在施加电压中，PMTV150是525V，PMTV160是560V、PMTV170是595V、 PMTV180 是 630V、PMTV190 是 665V、PMTV200 是 700V。
如图6A和图6B所示，即使在检测器的电位变化时，光谱的误差也小于或等于3%。 因此，确认具有不同检测电位的荧光光谱数据可用作参考光谱。
耦合抗体的类型
图7A和图8A是示出了耦合抗体和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是检测器的通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图7B和图8B是示出了每个波长中的误差的曲线图。图7A和图7B所示的荧光光谱是使用A:FITC用作荧光染料并且将CD45用作抗体，以及使用B 将FITC用作荧光染料并且将CD45RA用作抗体，所测得的数据。图8A和图8B所示的荧光光谱是使用A =PE用作荧光染料并且将CD8用作抗体，以及使用B 将FE 用作荧光染料并且将CD3用作抗体，所测得的数据。将PMT用作检测器，且所有施加电压都是 525V。
使用从其他单染色集获取的参考光谱分析当将FITC用作荧光染料并且将CD45用作抗体时的数据，以及当将PE用作荧光染料并且将CD8用作抗体时的数据。图9是示出了其结果的密度点图。如图9所示，使用单染色产生的参考光谱执行分析，并且可以将其分为三个细胞群。每个群指示在正交位置上令人满意地执行了荧光校正。在遍及设门的区域中存在的数量是FITC+PE+:278和PICT+PE-:750，其比率为0. 37 1。
然后，对于当FITC用作荧光染料并且⑶45RA用作抗体时的数据、以及当PE用作荧光染料并且CD3用作抗体时的数据执行相同的分析。图10是示出了其结果的密度点图。如图10所示，在基于FITC和PE作为荧光染料的2维展开图中，清楚地划分了三个细胞群，并且每一细胞群位于正交位置上。比较遍及设门的分布，数量是FITV+PE+ 280和 PITC+PE-:750，并且其比率是0.37 1，且等于图9所示数据的存在比例。
根据上述结果，在使用参考光谱的独立荧光校正方法中，如图7A至图8B所示，即使在不同类型的耦合抗体中，荧光光谱的差异也小于或等于8%，并且确认该光谱可用作参考光谱。
微粒的类型
图IlA和图12A是示出了微粒类型和荧光光谱之间关系的曲线图，其中水平轴是通道号(波长依赖号)，垂直轴是荧光强度，图IlB和图12B是示出了每个波长中的误差的曲线图。图IlA和图IlB是A 当FITC用作染料并且⑶45用作抗体时的荧光光谱，以及B: 当使用包含BD 7色设置微球的荧光染料FITC的聚苯乙烯微球时的荧光光谱。图12A和图 12B是A 当PE作用染料并且⑶8用作抗体时的荧光光谱，以及B 当使用包含BD 7色设置微球的荧光染料PE的聚苯乙烯微球时的荧光光谱。所有的施加电压都为630V。
使用从其他单染色集获取的参考光谱分析当使用包含BD 7色设置微球的荧光染料FITC的聚苯乙烯微球时的数据，以及当使用包含BD 7色设置微球的荧光染料PE的聚苯乙烯微球时的数据。图13是示出了其结果的密度点图。如图13所示，将细胞群分类为三个，并且每个群位于正交位置。比较遍及设门的分布，数量是FITV+PE+ 272和PITC+PE- 213，其比率是1. 1，并且不等于图9和图10所示数据的存在比率。
通过上述结果，在使用参考光谱的独立荧光校正方法中，如图13所示，即使细胞和微球使用相同的染料，荧光光谱的差异也大于10%，并且确认该光谱不可用作参考光谱。
如上所述，根据本发明，确认即使在没有为每个探针准备单染色样本时，也可以用高精确度消除每个光谱的重叠。
本发明包含与2010年11月11日在日本专利局提交的日本优先权专利申请JP 2010-252863中公开的相关主题，以引用的方式将其全部内容结合于此。
本领域的技术人员应当理解，根据设计要求和其他因素可以做出多种修改、组合、 子组合和更改，只要它们处于所附权利要求及其等价物的范围内。
权利要求
1.一种荧光光谱校正方法，包括将从标记有多个荧光染料的微粒获得的荧光光谱与参考光谱进行比较，从而将所述荧光光谱分离为针对每个染料的荧光光谱，其中，先前测得的光谱数据被用作所述参考光谱。
2.根据权利要求1所述的荧光光谱校正方法，其中，在所述参考光谱中，与单染色样本的误差小于或等于8%。
3.根据权利要求2所述的荧光光谱校正方法，其中，测量日期、检测器的电位、耦合抗体的类型、以及当所述微粒是细胞时的细胞类型中的任一项不同的荧光光谱数据被用作所述参考光谱。
4.根据权利要求3所述的荧光光谱校正方法，其中，当所述微粒是细胞时，使用细胞测得的所述荧光光谱数据被用作所述参考光谱。
5.一种荧光光谱测量装置，包括检测单元，在任意波长区域中同时检测从微粒发射出的荧光；分析单元，将所述检测单元检测到的数据分离为针对每个染料的荧光光谱；以及存储单元，存储由所述分析单元分离的荧光光谱数据，其中，所述分析单元将存储在所述存储单元中的先前测得的所述荧光光谱数据用作参考光谱，从而执行对所述荧光光谱的分离。
6.根据权利要求5所述的荧光光谱测量装置，其中，所述检测单元设置有多通道光电倍增管。
全文摘要
本发明公开了一种荧光光谱校正方法和荧光光谱测量装置。一种荧光光谱校正方法，包括对从标记有多个荧光染料的微粒获取的荧光光谱与参考光谱进行比较，从而将荧光光谱分离为针对每个染料的荧光光谱，并且将先前测得的光谱数据用作为参考光谱。
文档编号G01N21/64GK102539397SQ20111035312
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月9日 优先权日2010年11月11日
发明者二村孝治, 加藤泰信, 角田正也, 酒井启嗣 申请人:索尼公司
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