专利名称：一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法
技术领域：
本发明涉及植物研究技术，特别是一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法。
背景技术：
小麦叶片气孔是由两个哑铃状的保卫细胞组成，研究表明，气孔保卫细胞的长度可作为鉴定小麦植株染色体倍性的一个指标(王培等，1989)，并且根据水浇地及旱地条件下旗叶尖气孔保卫细胞长度差值可初步判断基因型的耐旱性(范光年等，1990，1991)。由于气孔保卫细胞的观察具有简单、快速、成本低的特点，在染色体倍性及基因型耐旱性的间接鉴定中发挥着重要的作用。小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备一般采用直接撕取法(刘沛和顾沛雯，1993)、刮制法(王培等，1989)、透明胶带法粘取法(陈佰鸿等，2004;段云峰等，2008)及离析法(封涛和胡东，2008;师长海等，2010)。由于小麦叶片细长，直接撕取法往往将叶肉带下，无法准确观察；胶带粘取法也存在表皮粘着叶肉的问题；铬酸离析法将叶片中的叶肉破坏掉，再剥离表皮，在撕取过程中容易将表皮撕取的支离破碎；以上几种方法都需要经过撕取叶片表皮的步骤，都存在表皮与叶肉难分离的问题，不易撕取成功，从而影响样品观察的效率。刮制法在刮制时刀片的刮制力度和角度不易掌握，会出现叶肉刮除不彻底的现象，从而影响样品观察的清晰度。这些方法在实际应用中都不同程度的存在不易操作、效率低等缺点，不适合大量样品的制备观察。整体透明技术是植物学研究中常用的一种技术，常被用于观察植物花粉粒、胚和子房(赵世绪等，1993;Van baarlen等，2002;杨鹭生和李国平，2004;陈庆亮等，2005;Noyes等，2005)，其原理是植物组织或器官经过透明剂处理后，由于不同组织的厚度和折射率的不同，因此呈现出不同的状态，透明处理后不需经过染色，利用明视野等显微镜即可进行组织结构观察。常用的透明剂有强碱、冬青油、甘油、“4V2”复合透明剂、水合氯醛、二甲苯、氯仿、丁香油等(Herr，1971;郝建华和强盛，2007)。郝建华和强盛等[2007]利用甘油做为透明剂研究了番茄侧根原基的发育，以冬青油为透明剂研究了菊科植物苏门白酒草有性生殖过程；李彦坤等(2011)以悬铃叶苎麻雌花为试验材料研究了生殖过程中胚胎的发育，比较了不同固定液和透明液组合对透明效果的影响；赵志敬等(2010)利用强碱氢氧化钾为透明剂，观察了半夏叶表皮形态，获得了较好的效果。但以目前已知的这些方案用于小麦叶片样品中效果不好。
发明内容
本发明基于上述领域的空白，提供用于小麦叶片观察样品的整体透明技术，技术方案如下一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法，包括准备待处理材料，对待处理材料进行固定，脱水，整体透明三个步骤，其特征在于所述整体透明采用的透明剂为水合三氯乙醛、蒸馏水和甘油以重量比4g lml 0 O. 5ml(这个比例可以合理扩大成范围)的比例混合而得。所述透明剂为水合三氯乙醛、蒸馏水和甘油以4g lml 0. 5ml的比例混合而得。所述固体采用无水乙醇与冰醋酸按6 1体积比的混合液。透明的时间为6小时。所述脱水指用70%乙醇室温浸泡固定后的待处理材料30分钟，然后用无水乙醇室温浸泡2次，每次30分钟。本发明首次将整体透明技术应用于小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备。并提供了能获得较好效果的透明剂配方，饱和三氯乙醛、水合三氯乙醛和甘油混合液2种透明剂处理后，均获得了清晰的显微观察图像；加入甘油后对样品具有保存作用，可以延长叶片样品的保存时间，为样品观察提供方便。与对照相比，赵志敬等观察半夏叶表皮形态采用的10%氢氧化钾透明剂，在小麦叶片样品制备中效果不好，利用10%氢氧化钾处理小麦叶片后，叶片结构受到破坏，用镊子夹取时极易使叶片破碎，显微观察时保卫细胞边界不清晰，不利于准确测量保卫细胞长度。本样品制备技术只需对叶片进行固定、脱水、透明三个步骤即可在普通显微镜下观察到清晰的叶表皮组织及气孔器观察图像，免去了表皮撕取或叶肉刮制这一步骤，操作简便易行，取材少，成本低，压片清晰度高，气孔真实性好，适用于小麦幼嫩和成熟叶片的气孔观察，为小麦花粉植株倍性鉴定研究中大量的、成批的气孔保卫细胞观察，提供了一种方便、快捷、高效的技术方法。
图1 01ympusSZX16体式显微镜下不同处理后的小麦叶片A :新鲜叶片；B :固定处理后叶片；C :脱水处理后叶片；D :10%氢氧化钾处理后叶片；E :甘油溶液处理后叶片；F :饱和三氯乙醛溶液处理后叶片；G :三氯乙醛和甘油混合液处理后叶片；图2 01ympusBX51显微镜下不同透明剂处理叶片的观察结果A: 10%氢氧化钾处理后叶片，10倍物镜；B: 10%氢氧化钾处理后叶片，40倍物镜；C:甘油溶液处理后叶片，10倍物镜；D:饱和三氯乙醛溶液处理后叶片，10倍物镜；E:饱和三氯乙醛溶液处理后叶片，40倍物镜；F:三氯乙醛和甘油混合液处理后叶片，10倍物镜；G:三氯乙醛和甘油混合液处理后叶片，40倍物镜
具体实施例方式材料与方法1.实验材料试验材料为利用花药离体培养技术获得的小麦花粉植株，花药培养过程中未进行加倍处理，花粉植株既有单倍体也有二倍体。全部花粉植株种于中国农业科学院中圃厂试验田，于植株拔节前对花粉植株进行取样并挂牌标记。2实验方法2.1溶液配制
固定剂乙醇/乙酸混合液6份无水乙醇与I份冰醋酸混合，用于样品固定处理。透明剂10%氢氧化钾溶液I克氢氧化钾溶于10毫升蒸馏水。甘油溶液1毫升甘油溶于2毫升蒸馏水。饱和水合三氯乙醛溶液4克水合三氯乙醛溶于I毫升蒸馏水。三氯乙醛和甘油混合液8克水合三氯乙醛溶于I毫升甘油和2毫升蒸馏水。所用试剂均购自北京化学试剂公司2. 2叶片处理方法(I)取材与固定用剪刀采取已挂牌小麦花粉植株的倒二叶叶片叶尖部分1. O厘米左右，放入装有乙醇/乙酸混合液的离心管中室温固定24小时。(2)冲洗与脱水去掉乙醇乙酸混合液，先用70%乙醇室温浸泡30分钟，之后无水乙醇室温浸泡2次，每次30分钟。(3)透明去掉乙醇溶液，用手术刀片将叶片切成长和宽均为O. 5厘米左右的小块，换用4种透明液分别处理样品6小时。2. 3制片观察小麦叶片样品利用OlympusSZXie体式显微镜进行观察，拍照背景为黑色。透明处理过的叶片样品置于载玻片上，用手术刀片将叶片切成I毫米左右大�。谘反Φ我坏瓮该饕汉蟾巧细遣Ｆ�01ympusBX51显微镜下进行观察。2. 4保卫细胞长度测量及花粉植株育性统计利用DP2-BSW软件对花粉植株叶片进行气孔保卫细胞长度的测量，每个叶片测量10个气孔，以10个气孔保卫细胞长度的平均值做为该样品值。育性统计于成熟期调查，以结实率10%为划分标准，花粉植株各分蘖结实率均小于10%的为不育株，花粉植株各分蘖结实率均大于10%的为可育株。3.实验结果3.1小麦叶片样品的制备本实验的小麦叶片样品制备经过了三个步骤，首先利用乙醇和乙酸混合液对剪取的叶片样品进行固定，以使叶片样品停止分裂并保持活体状态，由图1B可以看出，小麦花粉植株叶片经过固定处理后肉眼可见叶片完全褪色，叶片变成黄色并且变脆。之后利用无水乙醇和70%乙醇分别进行脱水处理，以利于下一步的透明处理达到较好效果，由图1C可以看出，叶片脱水处理后仍然为黄色，但叶片变软，易于利用手术刀片进行切割。本实验选用10%氢氧化钾溶液、甘油溶液、饱和水合三氯乙醛及水合三氯乙醛和甘油的混合液4种透明剂，对经过固定和脱水处理后的叶片样品进行了透明处理，结果表明，小麦叶片经10%K0H溶液透明处理后，叶片呈浅黄色，叶片结构受到破坏，用镊子夹取时极易使叶片破碎(图1D);甘油溶液、饱和水合三氯乙醛及水合三氯乙醛和甘油的混合液3种透明剂处理小麦叶片后，对叶片结构均无破坏，叶片结构保持完整，其中甘油溶液处理后叶片呈浅黄色(图1E)，饱合三氯乙醛进行透明处理后叶片呈白色(图1F)，水合三氯乙醛和甘油的混合液对小麦叶片进行处理后，叶片变得完全透明(图1G)。
3.2小麦叶片样品的显微观察利用01ympusBX51显微镜对经过4种透明剂处理后的小麦花粉植株叶片样品进行了观察，结果表明，10%氢氧化钾溶液透明处理后，10倍物镜下可观察到清晰的小麦叶表皮图像(图2A)，40倍物镜下可观察到气孔器结构，但保卫细胞边界不清晰，不利于准确测量保卫细胞长度(图2B)。甘油溶液透明处理效果不好，10倍物镜下图像不清晰(图2C)。饱和三氯乙醛、水合三氯乙醛和甘油混合液2种透明剂处理后，显微观察均获得了较好效果，在显微镜物镜放大倍数为10倍时可清楚地观察到小麦叶片表皮的长细胞及长细胞之间的短细胞，维管束、气孔器及表皮绒毛结构(图2D、2F)，利于进行叶片表皮长细胞、短细胞，维管束、气孔器及表皮绒毛结构分布的观察；在显微镜物镜放大倍数为40倍时可观察到清晰的气孔、保卫细胞、副卫细胞及气孔结构(图2E、2G)，为小麦气孔保卫细胞的准确测量奠定了基础。考虑到加入甘油后对样品具有保存作用，可以延长叶片样品的保存时间，为样品观察提供方便，因此在进行小麦叶片样品制备研究工作中建议以水合三氯乙醛和甘油的混合液做为透明剂。3.3本样品制备方法应用于小麦 花粉植株倍性鉴定的效果利用此样品制备方法对231株小麦花粉植株的叶片进行了处理，通过利用01ympUsBX51显微镜对样品的观察发现，所有小麦花粉植株的叶片样品均获得了清晰的气孔器图像，说明利用此样品制备方法处理小麦叶片，不仅可获得清晰的样品图像，同时可以保证叶片样品处理效果的稳定性。利用DP2-BSW软件对小麦花粉植株叶片样品的保卫细胞长度进行了测量，按照王培等[I]研究结果对保卫细胞长度测量结果进行分析，将保卫细胞长度大于65 μ m的小麦花粉植株归为二倍体，其成熟期植株表现可育；保卫细胞长度小于65 μ m的小麦花粉植株归为单倍体，其成熟期植株表现不育。并根据在小麦花粉植株成熟期获得的田间育性调查结果，对利用气孔保卫细胞长度进行的倍性鉴定结果进行了验证，结果表明利用本样品制备方法进行的小麦花粉植株倍性鉴定平均准确率可达到98.16% (表I )，证明了本实验中的小麦叶片样品制备方法用于保卫细胞长度测量，进而进行花粉植株倍性鉴定的可行性。表I本样品制备方法应用于小麦花粉植株倍性鉴定的准确率
权利要求
1.一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法，包括准备待处理材料，对待处理材料进行固定，脱水，整体透明三个步骤，其特征在于:所述整体透明采用的透明剂为:水合三氯乙醛、蒸馏水和甘油以重量比4g:lml:0 0.5ml (这个比例可以合理扩大成范围)的比例混合而得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，所述透明剂为水合三氯乙醛、蒸馏水和甘油以4g:Iml:0 0.5ml的比例混合而得。
3.根据权利要求1所述的制备方法，所述固体采用无水乙醇与冰醋酸按6:1体积比的混合液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，透明的时间为6小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，所述脱水指:用70%乙醇室温浸泡固定后的待处理材料30分钟，然后用无 水乙醇室温浸泡2次，每次30分钟。
全文摘要
本发明“一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法”，涉及植物研究技术。包括准备待处理材料，对待处理材料进行固定，脱水和整体透明，其特征在于所述整体透明采用的透明剂为水合三氯乙醛、蒸馏水和甘油以重量比4g∶1ml∶0～0.5ml(这个比例可以合理扩大成范围)的比例混合而得。用于制备小麦叶片气孔保卫细胞观察样品，获得了清晰的显微观察图像。
文档编号G01N1/28GK103076217SQ20121058992
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者赵林姝, 刘录祥, 古佳玉, 郭会君, 李军辉, 谢永盾, 赵世荣 申请人:中国农业科学院作物科学研究所
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