专利名称：超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法
技术领域：
本发明属于一种超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法。
背景技术：
一般而言，必需氨基酸种类和含量齐全并能提供人体需要的蛋白质可以称为优质蛋白质，也叫完全蛋白质。必需氨基酸是指人体必需但自身不能合成，必须从食物中摄取的氨基酸。在植物蛋白质中只有大豆蛋白属于完全蛋白质，但是大豆蛋白在吸收上不及优质的动物蛋白。乳清蛋白属于优质的完全蛋白质，也是动物性蛋白。它含有人体必需的8种氨基酸，且配比合理，接近人体的需求比例，是人体生长、发育、抗衰老等生命活动不可缺少的精华物质。在各种蛋白质中，乳清蛋白的营养价值是最高的，它较易被消化吸收，母乳中乳清蛋白含60%，酪蛋白含40%，故喝母乳的婴儿粪便较软，量也较少。另外，乳清中富含半胱氨酸和蛋氨酸，它们能维持人体内抗氧化剂的水平。还有许多实验研究都证明，服用乳清蛋白浓缩物能促进体液免疫和细胞免疫，刺激人体免疫系统，阻止化学诱发性癌症的发生。 所以乳清蛋白又是一种非�：玫脑銮棵庖吡Φ牡鞍�。从营养学的角度来看，经动物性蛋白质来源的食物中含有对人体有害的过量饱和脂肪、胆固醇等有害物质，过量食用易导致人体脂肪和胆固醇升高，从而导致心血管疾病的发生。乳清蛋白中脂肪、乳糖含量低，但它含有β _乳球蛋白、α -乳白蛋白、免疫球蛋白，还有其他多种活性成分。正是这些活性成分使乳清蛋白具备了有益于人体的诸多保健功能， 因此它被认为是人体所需的优质蛋白质来源之一。乳清蛋白是一类营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分的蛋白质，尤其适合婴幼儿、老年人、运动人群和术前术后病人。在食品工业中被越来越广泛地应用，如儿童营养蛋白粉、婴儿配方奶粉等。然而，对乳清蛋白的检测方法还相当局限，一种简便、快速、有效且检测成本相对低廉的检测方法应时代的需求而应运而生。乳清蛋白是牛奶中的主要蛋白质，乳清蛋白主要包括α-牛乳白蛋白 (B α -Lactalbumin, B α -La)、β -牛乳球蛋白(B β -Lactoglbulin，B β _Lg)、蛋白酶-胨和牛血清白蛋白等，前两者是乳清蛋白的主要成分，分别占其总量的10-20%和40-50%，β -牛乳球蛋白包括B β b-Lg和B β a-Lg两个遗传变异体。在《中华人民共和国食品安全国家标准》“婴幼儿食品和乳品中乳清蛋白的测定 (征求意见稿)”改进“GB/T 5413. 2-1997《婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定》”， 论述了 第一法高效液相色谱-质谱联用法，采用1.7 ym硅烷基C18柱，质荷比(m/z) 1-3000质荷比(m/z);分辨率为0.1原子质量单位的液相色谱-质谱联用仪系统，使α _乳白蛋白、0b-乳球蛋白和i3a-乳球蛋白的检出限为5 mg/100g，定量测定范围均为5-50 mg/100g;第二法凝胶渗透色谱法，适用于婴幼儿食品和乳品中α-乳白蛋白的测定，检出限为50 mg/100g。由于国标法中所用的3000质核比的质谱仪价格昂贵，和凝胶渗透色谱法检测的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速检测奶粉和牛奶中的牛乳清蛋白含量的超高效液相色谱方法。本发明的目 的是实现所述的利用超高效液相色谱，测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，具体步骤为
在待测的奶粉或牛奶中加入含Triton X-100的盐酸提取液、超声溶解，用乙酸钠水溶液调整PH在4. 4-4. 6之间，用水定容、均质，室温静置后过滤，上ACQUITY UPLC BEH300 C18 色谱柱，采用ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色谱系统测定奶粉或牛奶中B α -La、B β b_Lg 和B β a-Lg三种牛乳清蛋白的含量。含Triton X-100的盐酸提取液优选0. 2% Triton X-100的0. lmol/L盐酸提取液。所述的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH300 C18 2. ImmX 100mm, 1. 7 μ m;液相系统为沃特世ACQUITY UPLC 配ACQUITY TUV紫外检测器；色谱柱的柱温35°C，流动相A: 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液；流动相B: 0.1%三氟乙酸水溶液；采用梯度洗脱，流速为0.2 mL/min; 检测波长280 nm ；分析时间15 min ；通过外标法测定B α -La、B β b_Lg和B β a-Lg三种牛乳清蛋白的含量。上述％为重量百分比。所述的色谱柱优选采用Waters孔径为300A的ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱进行分离。本发明的检测方法的主要特点
本发明参考国标方法，采用更为简便的前处理方法，及改进的流动相与检测方式，以 "ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱，ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色谱系统”测定奶粉和牛奶中三种牛乳清蛋白(α-牛乳白蛋白(Ba-Lactalbumin，Βα-La)、β-牛乳球蛋白 (B^-Lactoglbulin,B^-Lg))的含量。在满足牛乳、奶粉等样品检出限为1 mg/kg要求的前提下力求简单、快速、成本低并能够高通量处理样品，通过方法优化，使三种牛乳清蛋白的检出限达到0. 1 mg/100g，定量测定范围0. 1-10 mg/100g，更有利于低浓度含量的样品中三种牛乳清蛋白的定量测定，所处理的样品在辛烷磺酸钠缓冲盐甲醇的流动相体系中还可测定维生素B6、烟酸的检测，有利于生产检测中的广泛运用。本发明优点为本发明建立了用ACQUITY UPLC-TUV系统检测奶粉和牛奶实际样品中B α -La、B β b_Lg和B β a-Lg三种牛乳清蛋白的定量分析方法，减少了实验初期在实验试剂、仪器设备等方面的资金投入的同时，运用相对简单高效的纯化步骤进行操作，实现 B α -La、B β b_Lg和B β a-Lg,的分离，保证了定量精度，并有效去除酪蛋白质和脂类等杂质干扰，提高了最终检测的灵敏度。方法的检出限为ι μ g/g，相较同类高效液相色谱一质谱联用法，在检出限上有所提高，更有效地确保实验数据的准确度，有利于乳清蛋白含量相对较低的样品检测。盐酸与氢氧化钠混合生成氯化钠，有利于乳清蛋白的提�。馊ネ嘈偷募觳夥椒ㄖ校然埔┢返奶砑�。
图1为本发明的α-La牛乳白蛋白紫外光谱图。图2为本发明的β b-Lg牛乳白蛋白紫外光谱图。图3为本发明的β a-Lg牛乳白蛋白紫外光谱图。
图4为三种乳清蛋 白280nm波长检测色谱图。图5为选择1-4四种流动相梯度方法下得到的四张色谱图。图6为本发明的前处理方法的pH选择实验图。图7为本发明的α -La标准曲线图。图8为本发明的β b-Lg标准曲线图。
图9为本发明的β a-Lg标准曲线图。图10为1. 000 mg/L三种乳清蛋白标准色谱图。图11为奶粉样品A色谱图。图12为奶粉样品B色谱图。图13为液态牛奶样品色谱图。图14为标准品、实际样品和样品提取液空白重叠色谱图。图15为牛奶样品和牛奶样品最后添加标准品的色谱图。图16为两种定溶液标准品的重叠色谱图。图17为B6、烟酸样品加标的重叠色谱图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明实验方法
材料、试剂和仪器
乙腈(色谱纯)，三氟乙酸(优级纯)，Triton X-100，氯化钠(优级纯)，盐酸(优级纯)，氢氧化钠(分析纯)，实验用水为超纯水(18 ΜΩ·αιι, TOC 3 ppb)，牛乳清蛋白标准品B α-La 、Β β b-Lg和 B β a-Lg ；ACQUITY UPLC 超高效液相色谱系统，配Acquity TUV检测器、FILTER MIXER (425 μ L, Ρ/Ν 205000403)。试验用试剂
1.0. 1%三氟乙酸乙腈溶液吸取1 mL三氟乙酸用乙腈稀释至1000 mL ；
2.0. 1%三氟乙酸水溶液吸取1 mL三氟乙酸用水稀释至1000 mL ；
3.0.1 mol/L盐酸吸取9 mL盐酸，用水用水稀释至1000 mL，加入2 g Triton X-100，超声溶解；
4.氢氧化钠溶液称取50 g氢氧化钠，溶解于1000 mL水中。5.三种乳清蛋白标准均用超纯水稀释，配制成不同浓度的标样进行检测，可得到较好色谱峰形，并且配制简单。6.标准物质
1)牛乳α-乳白蛋白，纯度不低于85%;
2)牛乳β -乳球蛋白，纯度不低于90%。其中的β b-乳球蛋白和β 乳球蛋白应经液相色谱分离，在波长280 nm处检测吸收强度。根据色谱峰的面积，由面积归一法分别确定各自的含量比。前处理方法
称取1. 00 g奶粉样品或10 mL牛奶样品，添加30 mL (对于牛奶添加20 mL)0. 1 mol/ L的盐酸溶液溶解，超声15 min，冷却至室温后用乙酸钠水溶液调节pH至4.5士0. 1，用水定容至50 mL，静置5 min，室温静置后过滤，滤液通过0.2 μ m滤膜，上机检测。试验中发现盐酸溶液采用含Triton X-100的盐酸提取液，含Triton X-100对乳清蛋白的提取和稳定效果较好，优选0. 2% Triton X-100的0. lmol/L盐酸提取液。色谱条件
权利要求
1.一种超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，其特征在于在待测的奶粉或牛奶中加入含Triton X-100的盐酸提取液、超声溶解，用乙酸钠水溶液调整pH 在4. 4-4. 6之间，用水定容、均质，室温静置后过滤，滤液通过滤膜，上ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱，采用ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色谱系统测定奶粉或牛奶中B α -La、 B β b-Lg和B β a-Lg三种牛乳清蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法， 其特征在于所述滤液通过0. 2 μ m滤膜，所述的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH300 C18 2. ImmX 100mm, 1. 7 μ m ；ACQUITY UPLC-TUV 超高效液相色谱系统为沃特世 ACQUITY UPLC 配ACQUITY TUV紫外检测器；色谱柱的柱温35°C，流动相A: 0.1%三氟乙酸乙腈溶液； 流动相B 0. 1%三氟乙酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0. 2 mL/min ；检测波长280 nm ； 分析时间15 min ；通过外标法测定Ba-La、B β b-Lg和B β a-Lg三种牛乳清蛋白的含量。
3.根据权利要求1或2所述的超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，其特征在于所述的色谱柱采用Waters孔径为300A的ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱进行分离。
全文摘要
本发明公开一种超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，其特点是在待测的奶粉和牛奶中加入含TritonX-100的盐酸提取液、超声溶解，用乙酸钠水溶液调整pH在4.4-4.6之间，用水定容、均质，室温静置后过滤，滤液通过滤膜，上ACQUITYUPLCBEH300C18色谱柱，采用ACQUITYUPLC-TUV超高效液相色谱系统测定奶粉和牛奶中Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种牛乳清蛋白的含量。运用相对简单高效的纯化步骤进行操作，实现Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg，的分离，保证了定量精度，并有效去除酪蛋白质和脂类等杂质干扰，提高了最终检测的灵敏度。方法的检出限为1μg/g。
文档编号G01N30/60GK102331471SQ20111028326
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者林玉宙, 陈光耀 申请人:明一(福建)婴幼儿营养品有限公司
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