专利名称：SjHSP60在制备监测血吸虫病患者综合肝脏病理损伤程度的诊断试剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体涉及血吸虫感染宿主血清日本血吸虫热休克蛋白60KDa (Schistosoma japonicum heat shock protein 60KDa, SjHSP60) IgG 及其亚型 IgGl抗体及其应用。
背景技术：
血吸虫病是当前我国乃至世界最严重的寄生虫病之一。全球范围内现在大约有6亿人受威胁，2亿人被感染，其中有2千万人有较重的临床症状并伴有不同程度的劳动力丧失。在我国，至2008年底，尚有七个省、市、自治区的105个县流行日本血吸虫病，报告血吸虫病约46万例，近I亿人口受感染威胁，疫区的家畜感染则更为普遍(Gryseels，Polman etal. 2006;Hotez, Brindley et al. 2008)。血吸虫病因具有高度流行、造成进行性发展的难以逆转的肝脏免疫病理损害的致病特点，及其与农业经济发展(涉及农村劳动力和牛、猪、羊等多种重要家畜)和水利建设的关系密切，因此成为影响流行国家的社会、经济发展的严重公共卫生问题之一 (Zhou, Guo et al. 2007; Wang, Utzinger et al. 2008)。血吸虫感染后，对人及动物宿主造成的最主要伤害是肝脏中的虫卵引起的免疫病理损伤(Pearce and MacDonald2002)。即寄生于门静脉血管系统中的血吸虫成虫产下的虫卵随血流沉积于肝脏内，肝脏内抗原递呈细胞(主要是巨噬细胞ΜΦ)呑噬血吸虫卵抗原(SEA)并递呈给⑶4+T细胞后，产生相应的细胞因子及趋化因子吸引大量巨噬细胞(ΜΦ)、噬酸性粒细胞、中性粒细胞、T细胞、成纤维细胞等包绕虫卵，在肝脏内形成以虫卵为中心的肉芽肿并继发纤维化(窦前性肝硬化)，最终导致门脉高压症并引发消化道出血、腹水、肝昏迷等多种严重的继发病症(统称为晚期血吸虫病)，使宿主丧失劳动力、生活自理能力乃至造成死亡等严重后果。
血吸虫病肝脏免疫病理损害具有进行性、不均衡发展的特点。进行性发展是指即使患者以化疗清除了体内所有血吸虫，肝脏免疫病理损害的进程也仍会持续发展，因此这不仅是现在流行区每个血吸虫病人的归宿，即使在许多早就宣布已经彻底消灭血吸虫的老流行区，上述晚期血吸虫病损害仍然在�：ψ乓徊糠旨韧腥菊叩纳】怠２痪夥⒄故侵覆糠只颊叩母卧嗝庖卟±硭鸷寡杆俣糠只郝�、部分慢性血吸虫病人会很快引起晚期血吸虫病的严重后果，而部分可能终身不会进入晚期。同时，同一个患者因反复感染次数、感染虫荷、不同生活环境、不同健康状态、不同生活方式等因素的变化也会造成血吸虫性肝脏免疫病理损害的进展速度不同。目前认为，重复感染次数多、感染虫荷多、合并病毒性肝炎等其它损害肝脏的疾病、经常使用损害肝脏的药物、经常酗酒、个人免疫力强(或使用增强免疫的药物)等诸多因素均可使血吸虫性肝脏免疫病理损害的进展加速，反之亦然。因此及时对血吸虫病流行区患者的肝脏免疫病理损害进行定期或动态监测，以指导临床及时进行干预，具有十分重要的意义。然而，目前临床上尚无法使用肝炎患者常用的血清酶学(肝细胞损伤相关酶学)办法对血吸虫性肝脏免疫病理损害进行早期估测，因为血吸虫卵引起的肝脏肉芽肿和纤维化病变为窦前性，即肉芽肿和纤维化发生于肝细胞与细胞之间，因而在相当长时间内不会破坏显著肝细胞、不显著影响肝脏功能(但肝炎病毒、药物或某些毒素等直接引起肝细胞破坏、立即显著影响肝功能而容易被检测到)，只有较长时间后其肝脏纤维化进展到相当严重的程度、影响肝细胞血供从而使之破坏时才能被血清酶学检查发现。对此，理论上临床监测的方法主要选择B超和CT等物理方法(Guangjin, Mingdao et al. 2002)。但是,血吸虫病流行区均是在偏远、贫穷的农村地区，甚至有些地区都没有电力供应(尤其在我国的偏远山区和非洲、中东、南美等落后地区)，这种监测方法的使用条件和成本受到极大的限制，因而不可能进行早期估测和动态监测以及时指导临床干预，当然，更不可能在流行区反复进行大规模的人群应用。因此，能否通过相关应用基础研究，以指导发展某些简单可靠廉价的诊断方法，将来能大规模应用于血吸虫病流行区人群肝脏免疫病理损害发生发展的早期估测、病情评估与监控，以指导及时进行临床干预，对于血吸虫病临床治疗中目前面临的血吸虫病患者肝脏纤维化病理损害这一最棘手的问题的控制具有极其重要的意义。对于为何在相当一部分血吸虫病人中会很快引起晚期血吸虫病的严重免疫病理损伤后果、即血吸虫病肝脏肉芽肿纤维化迅速发生与发展所涉及的免疫病理机制还缺乏了解，但肯定非常复杂。迄今已有大量报道证明在血吸虫病感染后，宿主针对血吸虫抗原(尤其是沉积在肝脏中的虫卵抗原)的Th2类应答的强弱，是决定肝脏肉芽肿和纤维化等免疫损害严重程度的关键因素之一(MacDonald, Araujo et al. 2002;Pearce and MacDonald2002;Pearce, C et al. 2004;Pearce 2005;Anthony, Rutitzky et al. 2007)),但是毫无疑问，血吸虫抗原是引起和影响宿主出现肝脏免疫病理损害的第一要素和始动因素。宿主体内血吸虫抗原的存在与否、以及量的多少等，会直接影响到今后免疫病理损害的程度。同时，影响宿主体内血吸虫抗原的存在以及数量的因素，例如化疗、再感染及重复感染等，也会影响到今后免疫病理损害的程度。影响肝脏免疫病理损害进程与严重程度的第二要素可能应该是宿主的遗传因素，目前虽然对这种因素的确切机制尚不清楚，但无论是在动物、人体实验还是其它病原体的感染中，均已有大量报道，认为不同个体针对类似数量的同一病原体(或抗原、疫苗接种等)，产生的免疫应答强度不同，这种差异目前认为可能是宿主遗传背景差异引起的。然而，在以上两种影响免疫病理损伤进程与程度的要素中，无论是哪一种/或共同，均会明显影响宿主免疫应答的强弱、包括免疫病理损伤程度、细胞免疫及抗体应答的强弱等。此外，还有其它许多因素影响血吸虫病患者肝脏免疫病理损害的进程与严重程度如感染的血吸虫荷、重复感染次数多少、合并病毒性肝炎等其它损害肝脏的疾病、经常使用损害肝脏的药物、经常酗酒、个人免疫力强弱(或使用增强或抑制免疫的药物)等。因而我们设想，是否可能只用一种较为简单的免疫学方法，在血吸虫感染早期即可检测宿主对血吸虫感染免疫应答的强弱、从而在血吸虫感染早期即可估测特定患者今后可能引起免疫病理损害的进展速度和/或程度，或用于感染后动态监测患者免疫病理损害的进程与程度，并可能在流行区人群中低成本、大规模地反复应用。热休克蛋白(HSP)是细胞内的组成性表达蛋白，表达稳定且量大(可达细胞蛋白总量的5-10%)。近年的研究提示，在感染免疫反应中，微生物来源的HSP能激活并增强免疫应答，且其诱导的特异性抗体水平与所诱导的免疫病理程度相关(Zugel andKaufmann1999; Okada, Ayada et al. 2007; Suba, Shiny et al. 2007),其原因可能有二首先，研究表明，当人和动物受到细菌等感染时，这些病原体HSP作为一种重要的显性异种抗原，容易激发机体产生针对病原体HSP的先天性免疫应答(Bethke，Staib et al. 2002; Tsanand Gao2004;Quintana and Cohen2005)和获得性免疫应答。同时，因为病原体HSP与宿主HSP具有一定同源性，还可能诱导机体产生自身免疫损伤。此外，病原体HSP还具有佐剂的作用而能大大增强免疫应答，因为它不仅可以作为分子伴侣促进其它抗原的免疫原性，也可携带抗原在抗原递呈细胞中迁移从而增强抗原递呈，而且还可以作为危险信号活化抗原递呈细胞、刺激其表面共刺激分子的表达和诱导细胞因子释放、刺激固有免疫反应，从而起到免疫佐剂和细胞因子样的作用，最终使得包括特异性抗体产生和免疫病理在内的整个免疫应答显著增强(Cohen-Sfady, Nussbaum et al. 2005; Ausiello, Fedele etal. 2006;Okada, Ayada et al. 2007)。其次，和病原体特异性抗原(即与宿主同源性不高的、仅仅是病原体所特有的抗原)的抗体水平相比，与宿主高度同源的病原体HSP抗体水平可能更能够准确反映处于不同状态下患者因病原体造成的综合免疫病理损伤。以血吸虫为例，从理论上分析，尽管众所周知血吸虫HSP因与宿主HSP具有较高同源性而不适合作为“判断是否是血吸虫感染”为目的的诊断抗原，但是，也正因为血吸虫HSP和小鼠、家兔以及人群等宿主的HSP具有高度的保守性，因此在运用其它方法确认是血吸虫病后，当该患者因感染严重、重复感染次数多、合并病毒性肝炎等其它损害肝脏的疾病、经常使用损害肝脏的药物、经常酗酒、个人免疫力强而加重对肝脏的损伤时，具有一定程度免疫交叉反应的血吸虫HSP抗体水平有理由能够比没有免疫交叉反应的特异性血吸虫抗原(SEA或者SWA)的抗体水平更准确真实的反映宿主肝脏的综合免疫病理损伤。因此，类似于上述理论分析，近年来国外已经有许多研究用病原体HSP抗体水平来估测宿主的免疫病理损伤程度，尤其用于常规病理检查不方便实施时，例如沙眼衣原体ant1-Ct-HSP60抗体水平和慢性非淋菌性尿道炎的发展有相关性(Sanchez-CampiIlo, Bini et al. 1999);在衣原体感染的无尾熊模型中，衣原体HSP60和HSPlO的特异性抗体与生殖泌尿道纤维化有相关性(Higgins, Hemsley et al. 2005);衣原体anti_cHSP60IgG抗体和冠状动脉硬化疾病有相关性，而ant1-humanHSP60抗体与冠状动脉硬化疾病没有相关性(Mahdi, Horne etal. 2002);幽门螺旋杆菌来源的HSP60特异性抗体和胃癌有相关性(Tanaka, Kamada etal. 2009);微生物来源的HSP65特异性抗体与小鼠的关节炎的病理有相关性(Kim，Kim etal. 2006);衣原体来源的HSP60特异性抗体水平与急性冠状动脉综合症有很强的相关性(Biasucci, Liuzzo et al. 2003)等等。但是,迄今尚未见任何报道有人将血吸虫HSP用于血吸虫病患者肝脏免疫病理损伤的早期估测与进程监控以指导临床干预，尽管国外早在90年代已有关于血吸虫HSP免疫调控功能的报道(Moser, Doumbo et al. 1990)。目前已经已公开的日本血吸虫热休克蛋白 60KDa (Schistosoma japonicum heat shock protein60KDa,SjHSP60)基因在 Genebank 中序列号为 AY813151。总之，建立日本血吸虫感染小鼠及家兔模型，同时到现场筛选粪检虫卵阳性的日本血吸虫患者，通过平行检测肝脏病理指标和SjHSPeo特异性抗体滴度，并进行相关性分析，来研发可能用于监测血吸虫患者肝脏病理损伤程度的新型诊断试剂。
发明内容
本发明旨在寻找用于监测血吸虫患者肝脏病理损伤程度的新型诊断试剂。
日本血吸虫热休克蛋白60Kda (SjHSP60)在制备监测血吸虫患者肝脏病理损伤程度的诊断试剂中的应用。本发明所说的用于监测血吸虫患者肝脏病理损伤程度的新型诊断试剂SjHSP60，可检测日本血吸虫热休克蛋白60KDa (SjHSP60)抗体的IgG以及亚型IgGl。本发明所说的蛋白SjHSP60抗体水平，在血吸虫感染小鼠和家兔模型以及现场人群中都与血吸虫感染宿主肝脏病理损伤程度有正相关性本发明公开了 SjHSP60蛋白血清中抗体IgG及其亚型IgGl水平与其对应肝脏的单个虫卵肉芽肿平均面积及纤维化程度呈正相关。本发明公开了血吸虫感染小鼠模型中，同时存在其他促进肝脏纤维化的因素时，血清SjHSP60抗体滴度也与肝脏纤维化程度呈正相关。本发明公开了血吸虫感染小鼠模型中，同时存在其他促进肝脏纤维化的因素时，血清SjHSP60抗体滴度也与肝脏纤维化程度呈正相关。本发明公开了日本血吸虫病患者血清SjHSP60_IgG以及亚型IgGl抗体水平与对应的肝脏病理超声检测结果之间存在相关性本发明所说的用于监测血吸虫患者肝脏病理损伤程度的新型诊断试剂具有比较广阔的应用前景。
图1日本血吸虫感染小鼠模型中，Sjhsp60抗体水平与肝脏病理有相关性，***P
<O. 001A血吸虫感染小鼠模型中，SjHSP60IgG，IgGl抗体在感染后增加，IgG2a没有明显变化，B SJHSP60 IgG抗体滴度与肝脏虫卵肉芽肿的大小呈正相关，C SJHSP60 IgGl抗体滴度与肝脏虫卵肉芽肿的大小呈正相关。图2日本血吸虫感染家兔模型中，Sjhsp60抗体水平与肝脏病理有相关性，***P
<O. 001A血吸虫感染家兔模型中，SjHSP60 IgG抗体在感染后增加B SJHSP60 IgG抗体与肝脏虫卵肉芽肿的大小呈正相关。图3在血吸虫感染小鼠模型中，同时存在其他影响肝脏纤维化的因素时，SjHSP60抗体也能反映其肝脏病理损伤，**p < 0.01, ***P < O. 001A在血吸虫感染小鼠模型中，同时用CC14处理组感染虫卵肉芽肿面积明显大于单独感染组小鼠，B在血吸虫感染小鼠模型中，同时用CC14处理，SjHSP60 IgG抗体水平明显高于单纯感染组，C SJHSP60与mouseHSP60之间存在交叉反应，D SjHSP60IgG，IgGl抗体与小鼠的年龄没有关系。图4在现场血吸虫感染人群中，SJHSP60抗体水平能反映病人的肝脏病理损伤感染病人血清SjHSP60IgG和IgGl抗体水平明显高于正常人群，< O. 001。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解为这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。SjHSP60是已公开的物质，可通过常规途径及方法得到，例如本发明中是通过下述方法获得根据Genebank中SjHSP60基因(序列号为AY813151)全长cDNA序列，先行设计引物上游引物为 5，— cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag 一 3，(SEQ ID NO.1,含BamH I酶切位点及起始密码字ATG),下游引物为5’ -ccgctcgagattaagagcaggcagtgtttac一 3’ (SEQ ID NO. 2,含Xhol I酶切位点及终止密码子TAA)，由上海英潍捷基贸易有限公司(Invitrogen)合成；通过PCR方法从日本血吸虫总cDNA中扩增SjHSP60 ORF全长序列，送生物技术公司(上海英潍捷基贸易有限公司，InvitiOgen)测序，并回收PCR产物；用BamH I (NEB，#R3136V)和 Xhol I (NEB, #R0146V)将质粒 pgex-6P_l (Invitrogen)和上述回收的PCR产物进行双酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定后，再分别割胶回收质�：蚉CR片断的双酶切产物；通过T4DNA连接酶(NEB，#M0202S)进行载体和PCR产物的连接，构建重组表达载体 pGEX - SJHSP60 ;转化E. coli BL21感受态细胞，37°C培养过夜后，挑取单克隆菌落，接种于含Amp的LB培养液中，37°C振摇培养过夜后，抽提质粒后行双酶切鉴定，进一步送测序公司鉴定。鉴定成功后，将菌液进行1:100扩大培养，至OD值达O. 6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为O. 05mmol/L, 37°C诱导表达5h ;收集菌液，4°C高速离心20min，用IXPBS重悬细菌沉淀；通过超声破碎仪和反复冻融法裂菌；再次4°C高速离心20min，分别取上清和沉淀，以及未裂解的总蛋白进行SDS — PAGE电泳分析蛋白的表达量及分布情况；鉴定为可溶性表达后，通过融合蛋白GST亲和层析法,用GlutathioneSepharose 4B (GE Healthcare, 17-0751-01)进行融合蛋白 GST — SjHSP60 的纯化；并用蛋白酶PreScission Protease (GE Healthcare, 270843)对融合蛋白进行酶切，最后得到纯化的SjHSP60 ;经过SDS-PAGE电泳分析纯化结果，纯度> 95%。实施例一为了研究在日本血吸虫感染家兔模型中，血清SjHSP60_IgG及其亚型IgGl抗体滴度和其对应肝脏的单个虫卵肉芽肿平均面积及纤维化程度是否呈正相关。1.将钉螺置于清洁去氯水中，25°C，光照条件下逸出尾蝴。用接种环挑取尾蝴，移至盖玻片(12mmX 12mm)上，解剖镜下计数。每组小鼠分别感染12、20、40条尾蝴。将小鼠和家兔捆绑固定，腹部剃毛，以去氯水湿润皮肤，将附有尾蝴的盖玻片覆于其上，保留20分钟。小鼠与家兔分别于感染后8周和23周剖杀(Xu，Wen et al. 2010)。2.均取右前叶肝脏。10%中性甲醛固定后，常规脱水、石蜡包埋，用常规方法将切片进行H. E染色。用Zeiss显微镜下观察单个虫卵肉芽肿面积，每只小观察30个面积，并计算平均值。3. ELISA检测血清中日本血吸虫HSP60IgG、IgGl和IgG2a特异性抗体的滴度用I μ g/ml的SjHSP60包板，然后4°C冰箱过夜，第二天置于37°C孵育2小时。弃去包被液，用PBS-T洗板3次，然后每孔加200 μ 15%脱脂奶粉封闭，置于37°C孵育2小时。弃去封闭液，用PBS-T洗板3次，每孔加入100 μ I稀释血清，4°C冰箱过夜，次日置37°C温育2小时。弃去血清，用PBS-T洗涤5次。然后每孔加入100 μ I相应的HRP标记的二抗，置于37°C，孵育I小时。弃去二抗，用PBS-T洗涤5次，每次静置5分钟，洗完后每孔加入100 μ I TMB显色，室温孵育大约15分钟。每孔加入50μ 12mol/L H2S04终止反应。用多功能酶标仪于450nm处测吸光度OD值。结果如图1所示，在感染BLAB/C小鼠模型中，血清S jHSP60_IgG和IgGl抗体水平显著升高，且与对应的肝脏虫卵肉芽肿面积呈正相关，而SjHSP60-1gG2a抗体水平没有明
显变化。实施例二 为了研究在日本血吸虫感染家兔模型中，血清SjHSP60_IgG抗体滴度和其对应肝脏的单个虫卵肉芽肿平均面积及纤维化程度是否呈正相关。1.按实施例一中方法，每组家兔分别感染20、40以及800条尾蝴。用ELISA检测血清中SjHSP60IgG抗体水平。2.然后均取右前叶肝 脏。10%中性甲醛固定后，常规脱水、石蜡包埋，用常规方法将切片进行H. E染色。用Zeiss显微镜下观察单个虫卵肉芽肿面积，每只小观察30个面积，并计算平均值。为了评价感染家兔肝纤维程度，胶原纤维1、III和α-SMA被石蜡切片进行然后，一个有经验的病理学家评价每个样本的蛋白表达水平。I级较少，着色浅，高倍镜下明显阳性者；2级少量，着色中等，低倍镜下明确阳性者；3级大量，条索状或小片状分布，着色深。结果如图2和表I所示，日本血吸虫感染家兔模型中，血清SjHSP60_IgG抗体滴度和其对应肝脏的单个虫卵肉芽肿平均面积及纤维化程度呈正相关。表I感染家兔血清中SjHSP60IgG抗体滴度与其肝脏纤维化相关蛋白表达水平相关
K；COlbgen Icolbgen IIIa -SMA -· N
I SjHSPeo- - -1
IgG.抗体滴度 I II IIII II III I II III
；_病人数1) 病人数(n=21) 痛人数(F2iy200*'0*' Cl·':1*·I； 0*; Oji l‘:- 0 0。* 400^ li; Ο-· 2- - 0‘; 0- 3-'￥ 800^ 4….1 3*<* Ij.:, 3 -* 5s··1 0**~5 6*^* 2*.. 0‘.'-
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3200(、l+:1 2~·O*· 3^::1 : Of- O*: 4*·: ·
■uuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuu""""^a实验例三为了研究在血吸虫感染小鼠模型中，同时存在其他促进肝脏纤维化的因素时，血清SjHSPeo抗体滴度是否也与肝脏纤维化程度呈正相关。1.按实施例一(I)中方法，用日本血吸虫感染小鼠，同时分组别人用四氯化碳和PBS处理小鼠后，检测各组小鼠血清中SjHSP60IgG及其亚型IgGl抗体水平。2.然后均取右前叶肝脏。10%中性甲醛固定后，常规脱水、石蜡包埋，用常规方法将切片进行H. E染色。用Zeiss显微镜下观察单个虫卵肉芽肿面积，每只小观察30个面积，并计算平均值。3.分别用SjHSP60和MouseHSP60和OVA蛋白包板，ELISA检测正常小鼠和四氯化碳处理小鼠血清中对应的抗体水平。
结果如图3所示，血吸虫感染小鼠模型中，同时存在其他促进肝脏纤维化的因素时，血清SjHSP60抗体滴度也与肝脏纤维化程度呈正相关。实施例四为了研究日本血吸虫病患者血清SjHSP60_IgGl抗体水平与对应的肝脏病理超声检测结果之间是否存在相关性。1.我们到江西省星子县寥南乡新华村进行了人群实验。采用kato-katz法共检查1800人粪便，然后对选定的目标人群(粪检阳性和阴性对照者)进行B超检查并参照WH01991年的血吸虫患者肝脏超声病理诊断标准进行病理分级。采血并化疗，共检查140人。2.按实施例一(I)中方法，ELISA检测各组血吸虫患者以及健康人血清中SjHSP60IgG及其亚型IgGl抗体水平。结果如图4和表2所示，SjHSP60_IgG及其亚型IgGl抗体水平可以反映血吸虫病患者肝脏病理损伤程度。表2感染病人血清中SjHSP60IgG和IgGl抗体滴度与病人肝脏病理的B超检查结
果有相关性
权利要求
1.日本血吸虫热休克蛋白60Kda在制备监测血吸虫病患者肝脏病理综合病理损伤程度的免疫诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种血吸虫来源的蛋白抗原分子—日本血吸虫热休克蛋白60KDa(SjHSP60)的应用。日本血吸虫热休克蛋白60Kda在制备监测血吸虫病患者肝脏病理综合病理损伤程度的免疫诊断试剂中的应用。日本血吸虫感染宿主血清中SjHSP60IgG及其亚型IgG1抗体水平与肝脏肉芽肿和纤维化程度呈正相关，提示血清SjHSP60-IgG及其亚型IgG1抗体水平可以作为评价血吸虫患者肝脏病理程度的一个指标，具有潜在的临床应用价值。未来可能用于监测血吸虫患者肝脏病理损伤程度的新型诊断试剂。
文档编号G01N33/68GK103063846SQ20121055669
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者苏川, 陈晓军, 周莎 申请人:南京医科大学
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