专利名称：Rta蛋白的制备方法及其在鼻咽癌检测试剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学诊断试剂，具体地，本发明涉及一种利用真核表达系统表达BRLFl全长基因获得纯化的表达产物Rta的方法，及以获得的Rta蛋白应用于鼻咽癌的血清学检测中。
背景技术：
EB病毒是一种Y疱疫病毒，全球接近95%的成人感染有该病毒。EB病毒感染可分为潜伏感染期和裂解复制期两种状态，在初次感染后，该·病毒可在宿主体内建立起终身潜伏感染，持续性的EB病毒裂解复制状态感染可导致一系列的人类恶性肿瘤(RickinsonAB, Lee SP,Steven NM. Cytotoxic T lymphocyte responses to Epstein-Barr virus. CurrOpin Immunol. 1996Aug;8(4) : 492-7) oBRLFl 基因位于EB 病毒基因组0RF50，是EB病毒进入裂解复制状态早期表达的立即早期基因。BRLFl基因编码转录激活蛋白Rta (又称EBl)，长度为1818bp。有研究表明BRLFl基因能够在B淋巴细胞以及上皮细胞中有效的激活EB病毒进入裂解复制状态(Zalani S, Holley-Guthrie E, Kenney S. Epstein-Barr viral latencyis disrupted by the immediate-early BRLFl protein through a cell-specificmechanism. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Aug 20;93 (17):9194-9;Ragoczy T, HestonL, Miller G. The Epstein-Barr virus Rta protein activates lytic cycle genes andcan disrupt latency in B lymphocytes. J Virol. 19980ct; 72 (10) : 7978-84)。Rta 蛋白可以激活多种病毒基因的启动子，如BMLFl，BaRFl，BALF5等(Ragoczy T, Heston L, MillerG. The Epstein-Barr virus Rta protein activates lytic cycle genes and candisrupt latency in B lymphocytes. J Virol. 1998 Oct; 72 (10) : 7978-84)。因此由 BRLFl基因表达的Rta蛋白是EB病毒进入裂解复制状态必需的激活元件。EB病毒终生在口咽部产生并通过口腔传染，初始感染可引起传染性单核细胞增多症，多发于儿童和年轻成人。经多年研究发现EB病毒与鼻咽癌、胃癌、肺癌以及一系列常见淋巴瘤均有相关。其中鼻咽癌与EB病毒关系最为密切，近年来通过对肿瘤上皮细胞中的病毒基因组与抗原的检测证实了二者的密切相关性(zur Hausen H，Schulte-HolthausenH，Klein G, Henle ff, Henle G, Clifford P, Santesson L. EBV DNA in biopsies ofBurkitt tumours and anaplastic carcinomas of the nasopharynx. Nature.1970Dec 12;228 (5276):1056-8;Yeung WM, Zong YS,Chiu CT, Chan KH, Sham JS, Choy DT, NgMH. Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngeal carcinoma in situ. Int JCancer. 1993 Mar 12; 53 (5) : 746-50)。鼻咽癌是东南亚地区常见肿瘤，与食道癌、肝癌并称中国三大肿瘤，且高发于我国南方数�。谀戏礁髦侄裥灾琢鲋姓嫉谝晃�。对于EB病毒相关肿瘤控制的主要策略为1、早期检测诊断后进行治疗，2、将疾病的发生理想的推迟至平均寿命之外，3、预防。由于EB病毒无法单独在体外培养，而大量细胞培养以及纯化带来的困难和不安全因素使直接从形态学检测EB病毒很难在临床上实现，更无法应用于大规模筛查工作。因此早期诊断多应用病毒特异性的抗原、抗体或遗传物质对EB病毒相关肿瘤进行早期诊断是目前控制EB病毒相关肿瘤行之有效的方法，现在诊断EB病毒相关疾病的主要指标为EB病毒壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、及其抗体。其中EBNAl在EB病毒潜伏期和裂解期均有表达，而VCA与EA虽然在鼻咽癌(Nasopharngeal carcinoma) (NPC)病人中检出率高，但其特异性不好，在健康人群中仍有较高的检出率。因此选择灵敏度与特异性好的检测指标是现在本研究领域急需解决的问题之一。
、
在中国专利ZL200610113403，作者通过原核重组表达Rta蛋白的两个基因片段，并以混合形式作为检测抗原，用于鼻咽癌的辅助检测，取得了良好的效果。此方案虽然表现出高于国际标准的诊断效果，但与鼻咽癌活检组织病理检查诊断的精确度还有很大差距，导致该试剂盒不能在临床确诊和抗癌治疗监测方面发挥出Rta分子靶标固有的、应该达到的高灵敏度和高特异性指标，用于抗体检测或作为疫苗使用时候，存在漏检或效价较低的问题，易发生交叉反应，干扰检测导致结果出现假阳性。同时中国专利ZL200610113403中仅选用了 BRLFl基因的部分阅读框作为抗原进行抗体检测，但灵敏度方面不尽人意。
发明内容
为了克服上述领域仍然存在的以上缺陷，本发明提供了真核表达的Rta蛋白的方法，及由该方法表达的Rta蛋白作为鼻咽癌免疫检测的抗原的应用。Rta蛋白的制备方法，其步骤如下(I)构建重组表达载体以BRLFl全长基因为外源基因；(2)转染将所述重组表达载体转入真核表达系统中获得阳性转细胞，(3)表达及纯化培养所述阳性转化细胞使其表达目的蛋白，分离纯化目的蛋白；其特征在于所述真核表达系统指CHO细胞。所述重组表达载体指pcDNA4. 1A-BRLF1，是以pcDNA4. IA为骨架载体，pcDNA4. IA及BRLFl全长基因cDNA都经EcoR/Xbal双酶切，连接pcDNA4. IA核BRLFl全长基因cDNA的双酶切目标产物，接连产物转化大肠杆菌感受态细胞，最后经筛选而得。所述转染指pcDNA4. IA-BRLFl 与脂质体 Lipof ectamine2000 混合后转染 CH0/DG44细胞。所述表达，指在含20%小牛血清、1%胰岛素和1%EGF的DMEM培养基中连续培养48小时。所述DMEM 培养基购自 HyClone，Code :SH3002201B。所述纯化指培养细胞经RIPA裂解缓冲液裂解后与Ni-NTA superflow beads进行孵育，20mM咪唑洗4遍，然后用400mM咪唑进行洗脱；再用HPLC结合分子筛技术对重组融合蛋白质进行纯化。一种检测鼻咽癌的Elisa酶标检测载体，其特征在于，所述酶标检测载体以上述制备方法获得的Rta蛋白作为包被抗原。所述Rta蛋白作为包被抗原的包被浓度为0. 05-0. 5ng/ml。上述制备方法获得的Rta蛋白在制备鼻咽癌检测试剂中的应用。本发明的方法制备的Rta蛋白用于鼻咽癌的检测其灵敏度和特异性分别为96%(288/300),96. 7%(290/300)，结果优于原核表达系统和毕赤酵母表达系统所制备抗原的结果，大大提高鼻咽癌临床早期诊断的灵敏度与特异性。究其主要原因采用原核表达体系表达真核蛋白，虽然在一级结构上与真核蛋白完全相同，但缺少蛋白翻译后进一步加工修饰，因此重组蛋白在二、三级结构上与真核表达的蛋白有较大的差异，仅能模拟母本蛋白中由相邻氨基酸残基组成的抗原决定簇，即线性表位，致抗原抗体结合能力弱；原核表达多采用大肠杆菌系统，在纯化产物中往往存在微量菌体蛋白，而人群中为数不少者感染过大肠杆菌，体内存在抗大肠杆菌抗体，因此易发生交叉反应，干扰检测导致结果出现假阳性。而本发明的方法制备的蛋白也优于毕赤酵母表达系统表达的蛋白，可能原因在于毕赤酵母表 达系统作为低等真核细胞，在表达哺乳动物或寄生哺乳动物生命体的蛋白时，仍然存在一些缺陷，如蛋白的糖基化修饰仍然不完全，产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，这些缺陷都有可能影响所表达用于鼻咽癌诊断时的特异性和灵敏度。本发明的Rta蛋白制备方法还克服了采用CHO真核表达蛋白中存在一些问题如CHO真核表达系统的产出效率过低，按常规方法无法获得Rta全长蛋白。本发明通过对培养介质成分的调整，增加了 CHO真核表达体系的产出效率，成功实现了 Rta全长蛋白的表达。本发明的Rta蛋白的制备方法中，构建了 BRLFl基因真核表达载体，含有BRLFl基因的全长基因，同时带有HIS标签，便于表达纯化。
图I.用EcoRI，XbaI对含有BRLFl基因基因序列的pEASY载体进行双酶切。图2.使用载体通用引物进行菌液PCR鉴定。图 3 用 EcoR I/Xbal 双酶切 pcDNA4. IA-BRLFl 图4. pcDNA4. IA-BRLFl转染真核细胞CHO表达产物纯化后SDS-PAGE检测结果。
具体实施例方式本发明采用的生物材料(微生物，CHO细胞，表达载体)均可商购获得，本单位也有保存，可保证自申请日起向公众发放用于验证试验。实施例II.引物的设计与合成根据已知BRLFl序列(GenBank号gi:94734074)设计的PCR引物序列为，Rta-fu11-lowprimer: ccTCTAGAaaataagctggtgtc (序列表中序列 2)Rta-full_upprimer: gcGAATTCatgaggcctaaaaaggatg (序列表中序列3),分别带有EcoRI, XbaI酶切位点，由上海生工合成。BRLFl序列对应所表达出蛋白的序列为GenBank gi:94734074。2.获得BRLFl基因的cDNA并克隆到载体上使用12-o-tetradecanoyIphorbo 1-13-acetate, 12_o_ 十四烧酸佛波醋酸酯 _13(Cell Signaling Technology, Inc. , Danvers, MA, USA)诱导 B95-8 细胞(ATCCNumber :CRL-10624 )中的EBV进入裂解期，采用RT-PCR方法获得BRLFl基因的cDNA，并克隆到pEASY-blunt-simpIe (北京全式金生物技术有限公司)载体上，转染入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆培养后，提取质粒，使用通用引物进行双向测定。通用引物的序列为M13R:5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'(序列表中序列 4)/M13F:5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3'(序列表中序列5)，经过测序证明，所克隆序列与GenBank号gi :94734074所公布的完全一致。3.亚克隆到经相同酶切的真核表达载体pcDNA4. IA上用EcoRI，XbaI对含有BRLFl基因基因序列的pEASY载体进行双酶切(图I)。琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，同时用EcoRI，XbaI双酶切真核表达载体pcDNA4. IA (Invitrogen)，将目标片段与载体进行连接，16° C连接过夜，42° C热击转化E. coli T0P10，涂布LB+Amp+平板，37°C倒置培养16h。挑取单克隆培养后，摇菌，使用载体通用引物M13R/M13F进行菌液PCR (图2)，产物大小与预期相符合。同时用EcoRI/Xbal双酶切，琼脂糖凝胶鉴定酶切产物，鉴定结果如图3，大小与预期相符合，命名为pcDNA4. IA-BRLFl。pcDNA4. IA载体本身带有his和myc标签，因此在表达的蛋白C端将带有his标签序列，带有his标签的重组蛋白氨基酸序列如序列表中序列I所示。·4.重组表达质粒pcDNA4. IA-BRLFl转染CHO细胞pcDNA4. IA-BRLFl转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，在LB培养基中大量培养，用质粒纯化系统(QIAGEN)提取并纯化重组表达质粒pcDNA4. IA-BRLFl。pcDNA4. 1A-BRLF1 与脂质体 Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)混合后转染CH0/DG44 (Invitrogen)细胞，在含20%小牛血清、1%胰岛素和1%EGF的DMEM培养基(HyClone，SH3002201B)中连续培养48小时(实验组)。对照组上述DMEM培养基(HyClone，SH3002201B)中未加20%小牛血清，1%胰岛素，1%EGF连续培养48小时。5.表达产物的鉴定上述培养的细胞经RIPA缓冲液裂解后进行常规SDS-PAGE电泳分离。电泳分离后在转膜缓冲液中将上述被分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用小鼠抗His单克隆抗体进行孵育，充分洗膜后再用HRP标记的山羊抗小鼠IgG 二抗进行孵育。洗膜后加入发光底物(ImmoBilon Western, MILLIP0RE)并在暗室内用胶片(KODAK)进行曝光。抗体购自北京中山金桥公司。6 表达产物的纯化将培养细胞经RIPA裂解缓冲液裂解后与Ni-NTA superflow beads(Qiagen)进行孵育，20mM咪唑洗4遍，然后用400mM咪唑进行洗脱。再用HPLC结合分子筛技术对重组融合蛋白质进行纯化。具体为选用层析柱为Sephorose-IOO已装柱(Amersham Biosciences公司)。用2倍柱床体积已除菌PBS平衡层析柱，将经过亲和层析纯化获得的蛋白上样加入柱中，为A260nm波长观察柱内流出液体的蛋白含量。仅收集峰尖部分蛋白质。用SDS-PAGE鉴定其纯度。用分光光度计对蛋白浓度进行测定。SDS-PAGE鉴定结果如下图4所示，实验组仅有单一条带，说明蛋白纯化> 95% ;而对照组没有条带，说明对照组的表达产物中未得到目的蛋白。实施例2、用真核表达的Rta抗原建立人血清Rta-IgG检测方法以实施例I制备得到的Rta蛋白为抗原，建立起间接法检测人血清中Rta-IgG抗体的方法，其原理为在微孔条上预包被高纯度真核表达Rta蛋白，与血清或血浆样品中Rta抗体结合，再加入HRP标记的羊抗人IgG与之结合，然后加入TMB底物显色，再用终止液终止反应。通过酶标仪检测吸光度(A值)。Abs值大小与Rta-IgG抗体浓度成正比。步骤如下
I.包被酶标板制备用包被缓冲液(pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液)将纯化后的真核表达Rta抗原稀释至IJ 0. lng/ml (0. 05-0. 5ng/ml )，加入到酶标板中，每孔IOOul，37。C反应2小时，甩掉包被液，用洗涤液清洗2次，每次30秒。每孔加入200ul封闭液，37° C反应2小时，甩掉封闭液，拍干，于30° C干燥箱烘干3-5小时，用铝箔袋真空包装保存。2.其他液体配制酶联物，选择KPL公司生产的HRP标记的羊抗人IgG，用二抗稀释液稀释8000倍到工作浓度；样品稀释液含有BSA的磷酸缓冲液，pH7. 4 ;底物液分为A、B 二液，A为过氧化脲溶液，B为四甲基联苯胺(TMB)溶液；终止液为2N硫酸溶液；浓缩洗液为含10%吐温20的磷酸盐缓冲液。
3.检测方法建立3. I.准备取出试剂盒，室温(18-25° C)平衡30分钟。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水做20倍稀释,将待检样本用样本稀释液按10 100稀释(可取IOul血清用IOOul样本稀释液稀释并混匀)。3. 2.加样每次试验均设标准品6孔，建议标准品每份重复2孔检测，以提高试验准确度。其他各孔加入IOOul已稀释好样品(为提高试验的准确度，建议待检样品双孔复检)。3. 3.温育用不干胶条封板后，在37° C温箱或水浴反应30分钟。3.4.洗板温育后，去掉不干胶条，吸去孔内液体，每孔加入300ul洗液，静置30秒，弃去液体，拍干板子。再重复以上步骤5次。3. 5.加入酶联物每孔加入酶联物IOOul。3. 6.温育用不干胶条封板后,在37° C温箱或水浴反应30分钟。3. 7 洗板重复步骤43. 8.显色每孔分别加入底物液A、B各50ul，37° C避光温育10分钟。3.9.终止每孔加入终止液50ul,终止反应。轻轻震动混勻。3. 10.读值将酶标仪设定在双波长450nm/630nm，测量各孔A值。应在终止反应后30分钟内读值。4.结果用以上方法检测病例确诊为鼻咽癌的病人血清样品300例，对照血清样品300例，包括肝炎类患者血清30例，肝癌患者血清20例，自身免疫性疾病患者血清20例，鼻咽部良性病变患者20例，健康体检人血清210份，检测结果以OD值0. 3为判断值，各组的Rta-IgG抗体检测结果如表I :表I.检测结果
权利要求
1.Rta蛋白的制备方法，包括步骤如下 (1)构建重组表达载体以BRLFl全长基因为外源基因； (2)转染将所述重组表达载体转入真核表达系统中获得阳性转细胞； (3)表达及纯化培养所述阳性转化细胞使其表达目的蛋白，分离纯化目的蛋白；其特征在于所述真核表达系统指CHO细胞。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述重组表达载体指pcDNA4. 1A-BRLF1，是以 pcDNA4. IA 为骨架载体，pcDNA4. IA 及 BRLFl 全长基因 cDNA 都经EcoR/Xbal双酶切，连接pcDNA4. IA核BRLFl全长基因cDNA的双酶切目标产物，接连产物转化大肠杆菌感受态细胞，最后经筛选而得。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述转染指pcDNA4.IA-BRLFl与脂质体Lipofectamine2000混合后转染CH0/DG44细胞。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述表达，指在含20%小牛血清、1%胰岛素和1%EGF的DMEM培养基中连续培养48小时。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述纯化指培养细胞经RIPA裂解缓冲液裂解后与Ni-NTA superflow beads进行孵育，20mM咪唑洗4遍，然后用400mM咪唑进行洗脱；再用HPLC结合分子筛技术对重组融合蛋白质进行纯化。
6.一种检测鼻咽癌的Elisa酶标检测载体，其特征在于，所述酶标检测载体以权利要求I 5任一所述制备方法获得的Rta蛋白作为包被抗原。
7.根据权利要求6所述的检测鼻咽癌的Elisa酶标检测载体，其特征在于所述Rta蛋白作为包被抗原的包被浓度为0. 05-0. 5ng/mlo
8.权利要求I 5任一所述制备方法获得的Rta蛋白在制备鼻咽癌检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明“Rta蛋白的制备方法及其在鼻咽癌检测试剂中的应用”，涉及医学诊断试剂。本发明的制备方法，步骤如下(1)构建重组表达载体以BRLF1全长基因为外源基因；(2)转染将所述重组表达载体转入真核表达系统中获得阳性转细胞，(3)表达及纯化培养所述阳性转化细胞使其表达目的蛋白，分离纯化目的蛋白；其特征在于所述真核表达系统指CHO细胞。本发明的方法制备的Rta蛋白用于鼻咽癌的检测其灵敏度和特异性分别为96%(288/300)，96.7%(290/300)，结果优于原核表达系统和毕赤酵母表达系统所制备抗原的结果，大大提高鼻咽癌临床早期诊断的灵敏度与特异性。
文档编号G01N33/68GK102703502SQ20121017158
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年2月27日
发明者吴凡, 李全, 焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
