一种定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：一种定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法
技术领域：
：本发明属于免疫检测领域，属于一种利用主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)—抗原肽五聚体(Pentamer)技术检测乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法。
背景技术：
：我国是HBV感染的高流行区，慢性HBV感染与肝硬化、原发性肝癌的发生有密切关系，但迄今尚无彻底清除乙型肝炎病毒和治愈慢性乙型肝炎(chronicalhepatitisB,CHB)的药物和方法。造成慢性HBV持续感染的机制，国内外研究公认的最重要的因素是机体缺乏多克隆、强有力的抗HBV特异性CTL免疫应答反应。HBV感染者产生多克隆特异性的CTL应答是清除病毒，尤其是清除肝细胞内病毒最重要的机制。HBV感染后不同个体的免疫学应答模式不同，其临床转归也不同(ThioCL，ThomasDL，KarackiP，etal.ComprehensiveanalysisofclassiandclassIIHLAantigensandchronichepatitisBvirusinfection.JVirol,2003，77:2083-12087.),这是宿主的HLA等免疫遗传背景和HBV自身特性共同作用的结果。人类MHC首先发现在白细胞表面，故称其为人白细胞相关抗原(HLA),编码HLA的基因群称为HLA复合体。HLA是人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因。它能够独特地结合细胞内多肽并呈递至细胞表面，进而激活T淋巴细胞，由此形成T细胞对抗原肽和MHC分子的双重识别，其意义是使T细胞受体(TCR)只能识别自身MHC分子递呈的抗原，与特异性CTL密切相关的主要是HLA-A类基因，CTL通过识别HLA-1类分子递呈的HBV抗原表位识别靶细胞，HLA-I类基因的型别和HBV抗原的序列特点，共同决定某一宿主的抗原递呈细胞将诱导的HBV特异性CTL应答类型。不同HLA-1等位型的个体可以有不同的抗原表位，与抗原肽结合的频率亦不同。金士正等(金士正，吴国光，蓝欲晓，等.广东汉族人群人类白细胞抗原-A,B及DRB1基因多态性和单倍型分布.广东医学,2006,27:11.)在20012004年8月之间，对3275名广东汉族登记加入中国造血干细胞捐献者进行HLA分型，发现人群中最常见的HLA-A基因是HLA-All、A2、A24和A33,分布率分别为32.1%、31.9%、14.2%和11.4%。HLA—A2和A24在我国江苏地区基因频率达分别高达50.87%和30.56%(梁文飚，薛敏，潘芹芹，等.中华(江苏)骨髓库人群HLA-I类抗原的PCR-SSP分型.中国输血杂志，2005,3:199-201.)。HBV感染肝细胞后，病毒抗原被蛋白酶裂解成小分子寡肽，并与肝细胞内HLA-I类分子结合成复合物，表达到细胞表面，成为T细胞表位。CTL通过表面的CD8+分子与HLA-I类分子产生粘附，并由TCR识别上述的寡肽表位。已有研究显示特异性CD8+CTL对清除肝细胞内的乙型肝炎病毒发挥着主要的功能(mainiMK，BoniC，HeeCK,etal.Theroleofvirus-specificCD8+cellsin.liverdamageandviralcontrolduringpersistenthepatitisBvirusinfection.JEXPMed，2000，191:1269-1280.)，然而不同临床类型的乙型肝炎患者的特异性CTL细胞免疫应答状况也不相同。在急性自限性乙型肝炎患者体内存在多克隆、多特异性CTL，能识别多个抗原靶位，识别范围广，应答性强，而在慢性HBV感染患者中体内常呈现特异性CTL的缺乏，特异性CTL只能识别单一抗原耙位，应答范围窄而弱(WebsterGJM,ReignatS,BertolettiA,etal.IncubationphaseofacutehepatitisBinman:dynamicofcellularimmunemechanisms.Hepatology,2000,32:1117-1124.KakimiK,LaneTE,WielandS,etal.Blockingchemokineresponsivetogamma-2/interferon(IFN)-gammainducibleproteinandmonokineinducedbyIFN-gammaactivityinvivoreducesthepathogeneticbutnottheantiviralpotentialofhepatitisBvirus-specificcytotoxicTlymphocytes.JExpMed,2001;194:1755-1766.SchuurhuisDH,Ioan-FacsinayA,NagelkerkenB,etal.Antigen-antibodyimmunecomplexesimprovedendriticcellstoefficientlyprimespecificCD8+CTLresponseinvivo.JImmunol,2002;168:2240-2246.)。CTL一旦被激活，释放穿孔素、颗粒酶或者诱导Fas与相应配体结合，引起感染的肝细胞损伤或凋亡；也可在特异抗原刺激下产生IFN-y，促进肝细胞对MHC的表达，使肝细胞对CTL的免疫攻击敏感。上述机制可以直接杀伤受感染的肝细胞，或释放抗病毒的细胞因子抑制病毒，尤其是在清除肝细胞内HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)中发挥关键作用(SeegerC,MasonW.HepatitisBvirusbiology.MicrobiolMolBiolRev，2000;64:51-68.)。因此，对HBV特异性CTL的数量及其功能研究，对探讨乙型肝炎的发病机制和新的治疗途径具有重要的意义。对于HBV感染后的转归预测以及如何进行临床干预和阻断慢性化一直是临床治疗备受关注的问题。现有的干扰素或者核苷类药物的抗病毒治疗都不能有效抑制HBVcccDNA和清除病毒。限制进行现有治疗方案的优化和联合免疫治疗的"瓶颈"问题是，缺乏对慢性乙型肝炎免疫病理机制的正确的认识和有价值的检测指标。鉴于特异性CTL在免疫发病机制和预测疗效和预后方面的特殊价值，目前认为HBV特异性CTL检测是解决临床这一瓶颈的重要手段和措施。由于外周血中抗原特异性CTL的数量极低，建立特异性强和灵敏度高的CTL检测方法是近年来的研究热点。长期以来抗原特异性CTL的检测是采用51Cr释放分析法和有限稀释法等，它们属于间接检测抗原特异性CTL功能的方法，尚需要7天以上的体外培养扩增过程，敏感性较低也很难得到与MHC—致的靶细胞。近年来出现的MHC-肽多聚体可以特异性结合抗原特异性的T细胞，能对特异性CD8+的T细胞进行直接计数。但是外周血单个核细胞中HBV特异性CTL的数量低于1%(Sun-LungTsaia,Tzong-HsienLeeb,Rong-NanChien，etal.AmethodtoincreasetetramerstainingefficiencyofCD8+TcellswithMHC-peptidecomplexes:therapeuticapplicationsinmonitoringcytotoxicTlymphocyteactivityduringhepatitisBandCtreatment.JImmunolMethods.2004Febl;285(l):71-87.),且CTL的活化以及生物学效应都严格受MHC-I类分子的限制，用低分辩方法作为筛选HLA基因分型的检测基�。允考偷腃TL来说极有可能影响其检测结果的准确性。MHC—肽五聚体是人工制备的MHC-1肽复合物，每个五聚体的5个MHC-多肽都能识别并与T细胞亚群中特异性CTL结合，与TCR的亲和力大大增加，同时标记5个荧光分子，由于其高亲和力，使此技术能够检测低亲和力的T细胞。通过流式细胞仪的荧光检测和分拣，不仅可以定量地测定T细胞亚群中特异性CTL的频数，还可以通过计算特异性CDS阳性细胞分泌IFN-Y的比例来了解其功能。该技术简便、可靠地检测特异性CTL的数量和杀伤功能的特性，使其成为研究特异性CTL的免疫功能的重要手段。可溶性-MHC五聚体，相对于以往的四聚体而言，其荧光信号更强，隨C分子与病毒抗原表位之间的结合更为紧密，采用FACS技术直接检测外周血或者肝组织内特异性CD8>T细胞数量，可以准确地反应体内特异性CD8，细胞的实际情况，而检测技术往往是准确提示患者体内特异性CTL的数量和功能状态的基础Hoffmann等认为MHC-PeptideTetramers(MHC-肽四聚体)对TCR的结合，可以导致T细胞立体空间变化，从而竞争抗-CD3特异性的结合(Hoffmann,T.K.,V.S.Donnenberg，U.Friebe-Hoffmann,etal.Competitionofpeptide-MHCclassItetramericcomplexeswithanti-CD3providesevidenceforspecificityofpeptidebindingtotheTCRcomplex.Cytometry.2000.41:321-328.);Galit等发现CD8抗体可以阻断MHC-PeptideTetramers(MHC-肽四聚体)与TCR的结合(GalitDenkberg，CyrilJ.Cohen,andYoramReiter.CriticalRoleforCD8inBindingofMHCTetramerstoTCR:CD8AntibodiesBlockSpecificBindingofHumanTumor-SpecificMHC-PeptideTetramerstoTCR1.TheJournaloflmmunology，2001，167:270~276.)，并比较了CD3单克隆抗体和CD8单克隆抗体的加入次序对特异性四聚体检测结果的影响。因此，目前检测特异性CTL的方法在特异性、敏感性和稳定性都还有待进一步提咼。
发明内容本发明的目的是提供一种能够提高检测的特异性、敏感性和稳定性的定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法。本发明是基于Hoffmann以及GalitDenkberg等学者的设计思想并加以进一步优化首先在标记试剂的颜色选择上采用PE标记的MHC-Pentamer和APC标记的CD8单克隆抗体，在多参数流式细胞检测中，前者为第二荧光通道，后者为第四荧光通道，第二、四通道之间基本没有荧光补偿；再通过调整设门策略等思想，即利用CD3设门来限制目的细胞只能是T淋巴细胞，排除了单核细胞、CD3'CD8+细胞、死细胞的干扰，用于设门的PercpCY5.5标记荧光是目前非特异荧光染色最少、与上述两种颜色之间荧光补偿最小、重叠荧光最少的标记荧光染料；本发明是利用PE标记的MHC-Pentamer，结合流式细胞术的三色标记多参数分析法对HBV特异性CTL进行定量检测，旨在减少或者避免CD3单抗及CD8单抗对人HBV特异性CTL检测的影响，目的是提高特异性CTL检测方法的特异性、敏感性和稳定性。本发明运用人类白细胞抗原(humanleucoyteantigen,HLA)-A0201型阳性或HLA-A2402型阳性者抗凝外周血，按次序分别加入藻红蛋白(PE)标记的乙型肝炎核心抗原(hepatitisBcoreantigen,HBcAg)18-27MHC-Pentamer或HBcAgll7-125MHC-Pentamer、叶绿素蛋白偶联物(PerCPCy5.5)标记的小鼠抗人表面抗原分化群3(clusterofdifferentiation,CD3)以及别藻蓝蛋白(APC)标记的小鼠抗人CD8，完成T细胞对抗原肽和MHC分子特异性的双重识别，裂解红细胞后运用多参数流式细胞分析技术，采用CD3设门策略，定量检测乙型肝炎患者外周血中HBcAgMHC-Pentamer和CD8双阳性细胞即乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)频数。我们选用在我国汉族人群中具有较高表达率的HLA-A2和HLA-A24基因亚型，使用高分辩序列特异引物聚合酶链反应技术对受检标本的HLA等位基因进行分析，再用特异性MHC抗原一肽五聚体的方法直接分析外周血中HBV特异性CTL的频数，以最大限度地降低因HLA分型中不完全匹配所造成的CTL检测率偏差的现状，动态分析HBV感染患者不同病程中HBV特异性CTL频数差异，揭示HBV患者体内对特异性CTL在病毒清除中的作用。本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，该方法是用HLA-A0201型或HLA-A2402型阳性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，分别与不同荧光素标记的主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体、小鼠抗人CD3单克隆抗体及小鼠抗人CD8单克隆抗体共孵育；孵育次序依次为先将荧光素标记的主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体与外周血共孵育适当时间，离心，弃去上清，洗涤后再加入荧光素标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体和小鼠抗人CD8单克隆共孵育适当时间，经裂解红细胞、离心洗涤、固定细胞后，在流式细胞仪上利用CD3设门技术，定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞。所述的方法，其中荧光素标记采用如下方式主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体采用藻红蛋白标记，小鼠抗人CD3单克隆抗体采用叶绿素蛋白偶联物标记，小鼠抗人CD8单克隆抗体采用别藻蓝蛋白标记。所述的方法，其中藻红蛋白为PE，叶绿素蛋白偶联物为PerCPCY5.5，藻蓝蛋白为APC。所述的方法，其中采用HLA-A0201型阳性的患者抗凝外周血时，主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体采用HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体；采用HLA-A2402型阳性的患者抗凝外周血时，主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体采用HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚体。所述的方法，其中HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体的氨基酸序列为PheLeuProSerAspPhePheProSerVal;HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚体的氨基酸序列为GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp。所述的方法，其中共孵育温度均为22-25'C，孵育时间为20min,避光反应。所述的方法，其中洗涤液采用pH为7.2含0.1。/。(w/v)的牛血清白蛋白的PBS。所述的方法，其中设门是采用以下方式进行的根据流式细胞仪的前向散射光和侧向散射光双参数点图，设R1"门"圈出样本中淋巴细胞群体，再设R2"门"圈出R1门中CD3阳性的群体，目的是将检测细胞的范围縮小到T淋巴细胞，而不是整个的外周血单个核细胞或所有的淋巴细胞，用CellQuest软件定量分析MHC-抗原肽五聚体-PE及CD8—APC双阳性细胞的百分率，即为乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的检测频数。所述的方法，其中要求在细胞固定后的3h-20h之间的时间范围内进行流式细胞仪检测，并获取30万个细胞，以保证检测结果的准确性。所述的方法，其中以T淋巴细胞设门，计算R2"门"内MHC-抗原肽五聚体和CD8双阳性的细胞数，HLA-A0201阳性HBV感染者检测HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体与CD8双阳性的细胞为其特异细胞毒性T淋巴细胞频数，HLA-A2402阳性HBV感染者检测HBcAgI17-125MHC-抗原肽五聚体与CD8双阳性的细胞为其特异性细胞毒性T淋巴细胞频数；特异细胞毒性T淋巴细胞率(％)=MHC抗原肽五聚体和CD8双阳性的细胞数除以CD8阳性细胞数X100Q/c)。(是看CD8中的比例。CD3只是设门，保证细胞的相对纯度)本发明的CTL检测方法，更换不同的MHC-Pentamer时，可以对不同感染性疾病的特异性CTL进行检测，如丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、艾滋病病毒感染等，具有方法学的通用性。本发明的CTL检测方法，除了用于检测外周血中特异性CTL外，也可对不同组织细胞中特异性CTL进行检测，具有检测标本的广泛性。本发明的CTL检测方法，还可观察细胞内细胞因子的表达，如IFN-a、IFN-Y、TNF-a、IL-4等，可以同时完成对特异性CTL的数量和功能研究。本发明的术语解释如下CTL:细胞毒性T淋巴细胞，其特征是表达特异性抗原五聚体的杀伤性T淋巴细胞，即通常所说的MHC-Pentamer/CD8双阳性细胞，HBV特异性CTL应答是清除病毒，尤其是清除感染肝细胞内病毒最重要的环节。HBcAgl8-27MHC-Pentamer或HBcAgll7-125MHC-Pentamer:主要组织相容性复合物-乙型肝炎核心抗原肽-五聚体，来源属于商品化的现有技术。孵育即细胞与抗体或标记试剂的反应过程，细胞需要在一定PH和离子强度的反应液中，并维持一定的温度和时间才能与相应的抗体等结合。洗涤用0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)含0.1%的牛清白蛋白(BSA)，500g离心5min,弃去上清，目的是去除细胞悬液中的细胞碎片或多余的标记抗体及游离的荧光素等。设门是流式细胞检测技术中的术语，即根据细胞的体积大小和颗粒的多少，或结合细胞颜色的标记技术，圈定出待检标本中目的细胞群的一种方法。本发明的有益效果.-1.利用流式细胞仪的分拣体系，运用流式细胞术的三色标记、多参数分析法对HBV特异性CTL进行定量检测，采用CD3(T淋巴细胞的表面标志)设门策略，以纯化目的细胞，从而来减少外周血中其它细胞群体的影响，降低了背景染色，使结果更可靠，有效地降低了Pentamer非特异性结合。2.按一定的次序先后加入三种标记试剂，从而避免了由于MHC-Pentamer和CD3抗体竞争结合TCR复合物的可能，同时避免了CD8抗体可以阻断MHC-Pentamer与TCR的结合的现象，该步骤是本技术的主要特色。3.在标记试剂的颜色选择上采用PE标记的MHC-Pentamer、PercpCy5.5标记的CD3单克隆抗体和APC标记的'CD8单克隆抗体，在多参数流式细胞检测中，前者为第二荧光通道，后者为第四荧光通道，第二、四通道之间基本没有荧光补偿，而用于设门的PercpCy5.5-CD3与上述两种颜色之间也是荧光补偿最�。氐庾钌俚谋昙怯�。4.直接应用抗凝外周血进行HBV特异性CTL检测，既不需要分离外周血单个核细胞也不需要体外培养等繁琐的操作，可以真实地反应各型乙型肝炎患者体内特异性CTL的动态变化以及患者体内对抗原表位特异性CTL频率的差异，它不仅能够静态地评价乙型肝炎患者的特异性细胞免疫功能，而且为开展特异性细胞免疫治疗和抗病毒药物治疗的疗效评估和动态观察提供了临床可行的检测方法，具有取材方便病人痛苦小而易于接受等优点。5.应用多参数流式细胞术，不仅可以对HBV特异性CTL的数量进行研究，还可以结合特异性CTL的功能分析，能够更深入地揭示特异性CTL与肝脏病理损伤以及HBV清除的机制。6.检测结果对临床的指导作用包括不同HBV感染状态或临床类型病人特异性细胞免疫功能的检测指标；抗病毒治疗或免疫治疗后的疗效评估及预后判断；抗病毒治疗或免疫治疗后的免疫评估指标及临床转归的检测指标。本发明可揭示特异性CTL应答与感染转归的关系，建立HBV感染后的转归评估，供临床医生参考。并可用于探索特异性CTL应答与药物疗效之间的关系，比较慢性乙型肝炎病人不同治疗方法对特异性CTL的影响，从而建立乙型病毒性肝炎的治疗疗效评估。7.本发明方法不仅避免了CD3单克隆抗体和CD8单克隆抗体竞争抑制MHC-五聚体与TCR的结合，还使检测背景清晰，确保了检测结果的特异性和敏感性。本发明在更换特异性MHC-肽五聚体后，可广泛用于临床多种病毒感染性疾病的特异性CTL检测，具有检测方法的通用性。图l:HBV特异性CTL设门策略图。图1A:前向散射光和侧向散射光双参数点图，其中Rl门中为淋巴细胞群体；图1B:为CD3设门图，其中R2门中为T淋巴细胞；图1C:为未经CD3设门，图中细胞来自于Rl门，其中右上象限即五聚体和CD8双阳性细胞中可能含有T淋巴细胞阴性的其它细胞；图1D:采用CD3设门策略，图中细胞来自于R1门和R2门，右上象限即五聚体和CD8双阳性细胞即为特异性CTL。图2:CD3设门对HBV特异性CTL检测结果的影响，患者为一例急性乙型肝炎。图2A:为未用PerCPCy5,CD3单抗标记的CTL检测结果；图2B:为用PerCPCy5.-CD3单抗标记后的CTL检测结果。图3:标记试剂的加样次序对HBV特异性CTL检测结果的影响，患者为同时表达HLA-A0201和HLA-A2402等位基因的杂合子的急性乙型肝炎。图3A、图3B:为同时加入MHC/Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PercpCy5.5及小鼠抗人CD8-APC标记后的结果；图3C、图3D:为先加入MHC/Pentamer-PE后同时加小鼠抗人CD3-PercpCy5.5及小鼠抗人CD8-APC的结果；其中图3A、图3C为HBcAg18-27CTL结果，图3B、图3D为HBcAg117-125CTL结果。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例l:本发明的检测过程1.HLA-A2、HLA-A24基因亚型标记目的是对乙型肝炎患者进行HLA-A2、HLA-A24基因亚型初筛，检测按说明书要求进行方法是在对照管中分别加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人免疫球蛋白Gl(IgGl)-和藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人IgGl各10iU，试剂均为美国BD公司产品；在检测管中分别加入小鼠抗人HLA-A2-FITC(试剂为美国BDPharmingen公司产品)10y1和小鼠抗人HLA-A24-PE10u1(试剂为日本MBL公司产品)混匀后22—25'C避光孵育20-30min，以3ml0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)含0.1%的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),500g离心5min，弃去上清，再以每分钟1000转速振荡30秒以重悬细胞；每管各加入lml红细胞裂解液(美国BD公司产品)，充分混匀后22—25'C避光反应10-12min，以裂解红细胞并保护及维持白细胞膜的稳定，500g离心5min，弃去上清，再用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗涤2次，去除上清。2.FACS分析HLAA2、HLA-A24基因亚型标记好的标本立即在流式细胞仪(FluorescenceActivatedCellSorting,FACS)上检测，用CeIIQuest软件分析淋巴细胞表达HLA-A2和HLA-A24分子的百分数，凡HLA-A2表达率》50%或者HLA-A24》80%者则认为是阳性，选取阳性标本进一步作HLA-A0201和HLA-A2402等位基因的高分辨分析，初选阴性的HBV感染者作为实施对象的对照组。3.HLA-A0201和HLA-A2402等位基因序列特异引物聚合酶链反应高分辩方法分析(1)模板DNA抽提试剂购自美国QUIGEN公司小提商品化成套试剂盒，货号为Cat.No.12143，操作严格按试剂盒说明书进行，具体为取经过HLA流式细胞术初筛确认的枸橼酸钠抗凝全血200u1和20^1蛋白酶K混匀于1.5ml离心管中，再加入AL液200(al，混匀后56'C反应10min,加入200jal无水乙醇，再次混匀后将其移入过滤柱子中，6000g离心lmin，弃去收集管；加入AW1液500(il，6000g离心lmin，弃去收集管，加入AW2液500ial，20000g离心3min进行过柱；将柱子放入1.5ml离心管中，加入20(V1三蒸水，室温静置lmin，6000g离心lmin，收集过柱内容，此即为抽提的模板DNA溶液。(2)DNA的浓度测定及纯度判定取DNA溶液用三蒸水做适量稀释，以三蒸水液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。按下面公式计算浓度DNA浓度Og/ial)-A260X50X稀释倍数/1000。DNA纯度的判定A260/A280比值在1.7-2.0之间为DNA纯度良好，如纯度小于1.7或大于2.0则视为蛋白质或RNA污染，应重新提取DNA。(3)聚合酶链式反应(PCR)扩增序列特异引物聚合酶链反应高分辩方法试剂均为美国Invitrogeng公司提供的商品化成套试剂盒(LocusSSPUniTray，Highresolutionkits,货号为LOT:008Batch:27463),操作严格按厂家以下说明书进行其反应总体积为23ul，包括正向及反向引物各2(2.5pmol/ul)，热启动Taq酶0.5"1(5U/U1)，Taq酶缓冲液(10X)2ul，dNTPs0.5y1(lOmM)'PCR专用zK6ul，模板DNAIO"1，将上述反应体系加入96孔中进行PCR反应，每孔5nl，放入PCR仪中，96'Cl分钟1个循环，96'C25秒、70。C50秒、72'C45秒5个循环，96'C25秒、65。C50秒、72°C45秒21个循环，96'C25秒、55'C60秒、72°C120秒4个循环，循环结束后PCR反应产物在4'C冰箱中保存。(4)PCR产物琼脂糖凝胶电泳PCR反应结束后将产物进行凝胶电泳，以确定HLA等位基因，首先制备琼脂糖凝胶称取lg琼脂糖，置于三角瓶中，力Q入50mL0.5XTBE缓冲液，隔水加热全部融化后，取出摇匀，将冷却至65'C左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶制备槽中，使凝胶液缓慢展开，直到在整个制备槽中形成均匀的胶层，室温下静置30min,待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，取PCR产物10ul分别加入胶板的样品小槽内，准备进行电泳，样品进胶前电流控制在20mA,样品进胶后电压控制在60—80V，电流为40—50mA。当指示前沿移动至距离胶板1一2cm处，终止电泳，将电泳后的胶板在溴乙锭染色液中染色后，在波长为254nm的紫外灯下，观察琼脂糖凝胶中的DNA条带，DNA存在处显示出红色的荧光条带者，与标准条带的电泳图谱进行比对，确认为HLA-A0201型或HLA-A2402型阳性结果的病人作为本发明检测的实施对象。4.HBV特异性CTL标记在确定患者HLA等位基因为A0201型或HLA-A2402型以后，按以下次序对样本进行CTL的特异性标记取HLA等位基因为A0201型患者的新鲜肝素抗凝外周血300ul，加入PE标记的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)18-27MHC-PentamerlO(il，其氨基酸序列为PheLeuProSerAspPhePheProSerVal，如为HLA-A2402型阳性患者的抗凝外周血则加入PE标记的HBcAg117-125MHC-Pentamer10(il(试剂均为英国Proimmune公司产品)，其氨基酸序列为GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp，混合在流式检测专用试管中，22-25'C避光孵育20min，500g离心5min，弃去上清，用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗涤1次，再加入PerCPCy5.5标记的CD3单克隆抗体(美国BD公司产品)20pl和APC标记的小鼠抗人CD8单克隆抗体(美国BeckmanCoulter公司产品)20jal，对血液中的T细胞进行特异性标记；混匀后22-25'C避光孵育20min,最后加入3ml红细胞裂解液(美国BD公司产品)，充分混匀后室温避光10-12min，(目的是裂解红细胞并保护及维持白细胞膜的稳定)500g离心5min，弃去上清，用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗涤2次，目的是彻底去除上清中裂解的红细胞碎片及游离的荧光标记试剂，在上述标记试管中加入1%多聚甲醛500ul,目的是固定标记好的白细胞，防止白细胞裂解，4'C保存直至FACS检测。5.HBV特异性CTL定量分析用流式细胞仪检测时，根据前向散射光和侧向散射光双参数点图，按照细胞大小和颗粒多少，先设Rl"门"来圈定出淋巴细胞，再设R2"门"圈出R1"门"中的CD3阳性群体(目的是将检测细胞的范围縮小到T淋巴细胞，而非整个的PBMC或所有的淋巴细胞)，用CellQuest软件统计分析CD8—APC和MHC-Pentamer—PE双阳性细胞的百分率，即为HBV特异性CTL的检测频数，特异细胞毒性T淋巴细胞率(％)-MHC-Pentamer和CD8双阳性的细胞数除以CD8阳性细胞数X100Y。。固定后的细胞会有一个皱缩的过程，因此，要求在固定后的3h-20h之间的时间范围内上流式细胞仪检测，由于外周血中特异性CTL的数量极少，应获取30万个细胞以保证结果的准确性。(CD8阳性细胞总数包括图的右上象限与右下象限的总和)以下比较实施例采用的检测方法与步骤除了在比较项目上作相应的改变，其余均同实施例1。比较实施例1.FACS检测时设门与检测图形及结果的关系禾IJ用流式细胞仪前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)双参数点图，根据细胞的体积大小和颗粒的多少，设Rl"门"先圈出标本中的淋巴细胞群体，目的是排除单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片等，再设R2"门"圈出R1"门"中的CD3阳性细胞即为T淋巴细胞，目的是排除B淋巴细胞、NK细胞等，通过CellQuest软件统计Rl门和R2门中MHC-Pentamer-PE和CD8—APC双阳性细胞的百分率，作为HBV特异性CTL阳性细胞，以此来限定特异性CTL只是来自于T淋巴细胞，而并非是其它群体细胞与MHC-Pentamer或单克隆抗体的非特异性结合，见图1A-图1B;在本实施例中，比较了用或不用CD3设门对特异性CTL检测结果的差异，经使用优化的设门策略后，去除了T淋巴细胞以外可能与Pentamer结合的其它细胞，明显提高检测频数的特异性，见图1C-图1D。比较实施例2.不加CD3单抗对结果的影响目前国内外学者通常使用同时标记MHC-Pentamer和小鼠抗人CD8两种试剂来检测特异性CTL，并没有注意到非CD3阳性细胞与MHC-Pentamer的结合对检测结果的影响；本实施例中首先比较了加或不加CD3荧光抗体对CTL频数的差异，结合设门策略，明显增加了CTL结合的特异性，见图2A-图2B，由图2A左上象限可见，不经CD3染色时，无法采用CD3设门策略，其Pentamer非特异性染色细胞多，检测背景较深，经CD3设门后的图2B左上象限情况则明显改善其非特异性染色细胞较少，背景清晰，图形美观。比较实施例3.标记试剂的加入次序对结果的影响由于特异性CTL在外周血中的含量非常低，相对于其它特异性CTL检测方法而言，MHC-Pentamer是比较敏感的检测方法，为避免CD3单克隆抗体或CD8单克隆抗体阻断MHC-肽五聚体与TCR的结合，进一步观察加样次序是否对实验结果的特异性和敏感性有影响，在本实施例中我们对同一份标本分别按以下不同的加样次序对试验方法进行优化，其中孵育温度均为22-25'C，每个步骤的孵育时间为20min,病例数为6例慢性乙型肝炎患者的血清样本。(1)先加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5后同时加入MHC/Pentamer-PE和小鼠抗人CD8-APC;(2)先加入小鼠抗人CD8-APC后同时加入MHC/Pentamer-PE和小鼠抗人CD3-PercpCy5.5;(3)先加入MHC/Pentamer-PE后同时加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5和小鼠抗人CD8-APC:(4)先加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5和小鼠抗人CD8-APC后加入MHC/Pentamer-PE;(5)同时加入MHC/Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5和小鼠抗人CD8-APC。加样次序对特异性CTL结果的影响归纳为通过对荧光素标记的HBcAg18-27MHC-Pentamer、CD3单抗和CD8单抗按照不同的加样次序进行组合，其特异性CTL检测频数见附表1，采用SPSS11.0统计软件对表中CTL频数分析发现加样次序对CTL检测结果有明显影响，其中先加APC-CD8组CTL频数0.050±0.0405依次低于先加CD3-PerCPCy5.5组0.082±0.062和先加MHC-Pentamer组0.345±0.092;分别将该2组与先加入MHC-Pentamer组相比差异具有统计学意义(分别为,=-7.567,尸=禱/，W.肌尸-O，),上述结果提示CD3单抗和CD8单抗都可以抑制MHC-Pentamer与TCR的结合，其中以CD8单抗对MHC-Pentamer的竞争抑制作用更明显，从而使特异性CTL频数明显下降；同时加入MHC-Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5及小鼠抗人CD8—APC组其CTL频数0.203±0.045低于先加入MHC-Pentamer-PE后同时加入小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5及小鼠抗人CD8-APC组0.305±0.084,同样具有统计学差异(t=2.892，P=0.034)，再次证实CD3单抗和CD8单抗对MHC-Pentamer的抑制作用；因此，我们采用先加入PE标记的MHC-Pentamer与检测样品共孵育20min后，再加入小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5和小鼠抗人CD8-APC孵育20min的标记方法，作为临床检测HBV特异性CTL的使用方案。部分结果见图3。表1:加样次序对HBV特异性CTL的影响(6例慢性乙型肝炎的血清样本)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>比较实施例4.不同MHC-肽Pentamer复合物对实验要求的差异本发明显示，不同HLA等位基因患者的外周血，对HBV特异性CTL检测条件相似，它们同样受到标记试剂的加样次序以及CD3设门的影响，图3显示的是同时表达HLA-A0201和HLA-A2402杂合子的一例急性乙型肝炎患者外周血，其标记试剂的加样次序和设门策略对HBV特异性CTL检测结果影响的实例。比较实施例5.不同的HLA基因亚型及HBV感染与否样本的比较实验除HLA基因型阴性的样本分别采用PE标记的HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体及PE标记的HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚体检测外，其他样本操作方法同实施例1,结果见表2。由表2可见(1)在HLA基因亚型的比较实验中，我们设立了三组检测对照即HLA-A0201或HLA-A2402阳性的健康人(无HBV感染)、HLA-A2或HLA-A24阴性的健康人和HLA-A2或HLA-A24阴性的乙型肝炎患者(包括急性或者慢性)，上述三组对照样本都检测不到这2个表位的CTL。经SPSS11.0统计软件将上述样本结果与HLA分型对应的急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎患者的结果比较分析，P值均大于0.05;说明不同MHC的HBV特异性CTL没有交叉，表明我们所建立的MHC-抗原肽五聚体的检测方法具有很好的特异性。(2)HLA-A0201或HLA-A2402阳性的急性乙型肝炎患者，相对应的特异性CTL均为高表达，说明急性乙型肝炎患者体内较高的特异性CTL,有利于病毒的及时清除。(3)HLA-A0201或HLA-A2402阳性的慢性乙型肝炎患者体内特异性CTL频数明显低于急性乙型肝炎，差异具有统计学意义(两者分别为t=3.279,P=0.008和t=-3.405，P-0.027(前者表示A0201，后者为A2402),这种特异性CTL的低下，可能是造成病毒持续感染的重要原因之表2.不同类型样本HBV特异性CTL检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表中第l，2，3，4各组之间相比P值均大于0.05;第7，8，9，IO各组之间相比P值均大于0.05，均未见统计学差异。其它没有统计意义数值是1组和2组比1=-2.569,P=0.062，1组和3组比t=-1.24，P=0.283，1组和4组比t=-0.749，P=0.495，2组和3组比t=0.877，P=0.43;7组和8组比t=-2.419，P=0.075，7组和9组比t=-1.668,P-0.171,7组和10组比t;1.270，P=0.245，8组和9组比t=1.367，P=0.243。序列表〈110〉南京医科大学第一附属医院〈120〉一种定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法<160>2<210〉1〈211〉10〈212〉PRT<213>HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体<400>PheLeuProSerAspPhePheProSerVal1510<210>1<211>9〈212〉PRT<213>HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚体<400>GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp1权利要求1.一种定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，其特征在于，用HLA-A0201型或HLA-A2402型阳性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，分别与不同荧光素标记的主要组织相容性复合物—抗原肽五聚体、小鼠抗人CD3单克隆抗体及小鼠抗人CD8单克隆抗体共孵育；孵育次序依次为先将荧光素标记的主要组织相容性复合物—抗原肽五聚体与外周血共孵育适当时间，离心，弃去上清，洗涤后再加入荧光素标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体和小鼠抗人CD8单克隆共孵育适当时间，经裂解红细胞、离心洗涤、固定细胞后，在流式细胞仪上利用CD3设门技术，定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞。2、根据权利要求1所述的方法，其中荧光素标记采用如下方式主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体采用藻红蛋白标记，小鼠抗人CD3单克隆抗体采用叶绿素蛋白偶联物标记，小鼠抗人CD8单克隆抗体采用别藻蓝蛋白标记。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于藻红蛋白为PE，叶绿素蛋白偶联物为PerCPCY5.5,藻蓝蛋白为APC。4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用HLA-A0201型阳性的患者抗凝外周血时，主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体采用HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体；采用HLA-A2402型阳性的患者抗凝外周血时，主要组织相容性复合物一抗原肽五聚体采用HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚体。5、根据权利要求4所述的方法，其中HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体的氨基酸序列为PheLeuProSerAspPhePheProSerVal;HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚体的氨基酸序列为GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp。6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于共孵育温度均为22-25'C，孵育时间为20min，避光反应。7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于洗涤液采用pH为7.2含0."/。(w/v)的牛血清白蛋白的PBS。8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于设门是采用以下方式进行的根据流式细胞仪的前向散射光和侧向散射光双参数点图，设R1"门"圈出样本中淋巴细胞群体，再设R2"门"圈出RI门中CD3阳性的群体，目的是将检测细胞的范围縮小到T淋巴细胞，而不是整个的外周血单个核细胞或所有的淋巴细胞，用CellQuest软件定量分析MHC-抗原肽五聚体-PE及CD8一APC双阳性细胞的百分率，即为乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的检测频数。9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于要求在细胞固定后的3h-20h之间的时间范围内进行流式细胞仪检测，并获取30万个细胞，以保证检测结果的准确性。10、根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于以T淋巴细胞设门，计算R2"门"内MHC-抗原肽五聚体和CD8双阳性的细胞数，HLA-A0201阳性HBV感染者检测HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚体与CD8双阳性的细胞为其特异细胞毒性T淋巴细胞频数，HLA-A2402阳性HBV感染者检测HBcAgl17-125MHC-抗原肽五聚体与CD8双阳性的细胞为其特异性细胞毒性T淋巴细胞频数；特异细胞毒性T淋巴细胞率(％)=MHC抗原肽五聚体和CD8双阳性的细胞数除以CD8阳性细胞数X100°/。。全文摘要本发明属于免疫检测领域，公开了一种定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法。该方法用HLA-A0201型或HLA-A2402型阳性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，按一定顺序分别与不同荧光素标记的主要组织相容性复合物—抗原肽五聚体、小鼠抗人CD3单克隆抗体及小鼠抗人CD8单克隆抗体共孵育适当时间，经裂解红细胞、离心洗涤、固定细胞后，在流式细胞仪上利用CD3设门技术，定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞。本发明能提高检测特异性CTL的特异性、敏感性和稳定性。文档编号G01N33/576GK101424692SQ20081024372公开日2009年5月6日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者万玉峰,源刘,山卢,周东辉,孔练花,军李,邢益平,韩亚萍,黄祖瑚申请人:南京医科大学第一附属医院

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一种定量检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法