专利名称：一种检测黄曲霉毒素b1含量的非标记免疫分析方法
技术领域：
本发明属生物检测领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法。
背景技术：
黄曲霉毒素是一类结构类似的化合物，自然界中的黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的次级代谢产物。目前发现的黄曲霉毒素有二十余种，其中以黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和Ml最为常见。黄曲霉毒素能对人及动物的肝脏组织产生破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为I类致癌物，以黄曲霉毒素BI毒性最强，其毒性是砒霜的68倍。黄曲霉毒素可发生在热带或亚热带地区的农产品出产过程中，同时在储藏、运输等环节也可能引入黄曲霉毒素的污染。花生是最易发现有黄曲霉毒素的农产品，其他如玉米、无花果、果仁及谷物都有可能受黄曲霉毒素污染。由于我国小农户分散型的种植模式，农产品从农田到餐桌的各个环节都有可能受到黄曲霉毒素的污染。而黄曲霉毒素毒性大，�：ρ现兀虼耍澜绺鞴耘┎分谢魄苟舅氐暮恐贫搜细竦南蘖勘曜迹晌刂婆┎分柿堪踩墓丶方�。为了更有力地监测黄曲霉毒素含量，近年来分析检测黄曲霉毒素的技术逐渐增多，灵敏度也逐渐提高。主要有仪器分析方法和免疫分析方法。免疫学方法克服了仪器方法费用高、操作条件要求高、对环境污染大等缺点，具有快速、简便、特异性好、对操作人员和环境�：π〉扔诺�。基于免疫方法的试纸条层析技术和酶联免疫试剂盒已被广泛的应用于现场的定性和定量检测。试纸条层析技术可在15min内实现检测，但是只能进行定性分析，无法实现定量检测；酶联免疫试剂盒可进行定量检测，但是耗时需几个小时，操作步骤多。因此，研究建立一种简单、快速、灵敏、可定量检测黄曲霉毒素BI的方法对于快速、准确、在线监控农产品中黄曲霉毒素具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法。该方法可用于农产品中黄曲霉毒素BI检测，与常规荧光和酶标记免疫分析方法相比具有无需标记的特点。本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为:
一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:包括以下步骤:
(1)提供待测样品溶液，检测待测样品溶液在365nm激发波长激发下，加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll使黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭前后的440nm处(荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长)的荧光强度值，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生；
(2)基于预先获得的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线，由该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值，求得待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的含量。
该杂交瘤细胞株ICll已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC N0.C201013。按上述方案，所述的步骤(I)中黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭后的440nm处的荧光强度值是在待测样品溶液中加入适量抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11后的待测样品体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度至少达到使体系中黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，然后混匀，于37±5°C放置至少0.5h，再经365nm激发波长激发测试得到测得的。按上述方案，所述的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线是采用以下方法得到的:
①配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液，在365nm激发波长激发下获得各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值；
②向上述各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入等量的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的浓度至少达到使最大浓度黄曲霉毒素BI标准品溶液中的黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，而使黄曲霉毒素BI荧光在抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的作用下充分淬灭，然后在365nm激发波长激发下获取各加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值；
③经拟合得到荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线c (x,y)——X黄曲霉毒素BI浓度，y为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭前后440nm处荧光强度的差值。按上述方案，所述步骤①中一系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液是将黄曲霉毒素BI的甲醇储备液稀释配制得到的，浓度分别为10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75,0.5、0.3,0.1 ng/mL ;所述各溶液的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的溶液体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度为>20 u g/mL，优选为 20 u g/mL。按上述方案，所述步骤①中的稀释液可为磷酸盐缓冲液，按下述方法配制:0.Sg氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至lOOOmL。按上述方案，所述步骤②中为在各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll加入后混匀，并于37±5°C放置至少0.5h以使黄曲霉毒素BI荧光被充分淬灭，然后进行后续步骤。按上述方案，所述步骤③为分段拟合，分别得到小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1 Cx1, Y1)——X1黄曲霉毒素BI浓度，0.1-1 ng/ml, Y1为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体前后的440nm处荧光强度的差值，和大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2 U2, Y2)——X2黄曲霉毒素BI浓度，1-10 ng/ml, y2为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体前后的440nm处荧光强度的差值；
相应地，在求算待测样品中黄曲霉毒素BI浓度时根据待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度确定选用小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1 Cx1, yi)，还是大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2(x2, y2)，然后结合该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值计算待测样品中黄曲霉毒素BI浓度。按上述方案，所述待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的浓度应在该方法步骤(2)中的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线的有效检测范围内即0.1-10 ng/mL，如超出，可对待测样品溶液进行相应浓缩或稀释处理后再进行检测；所述待测样品溶液加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度彡20 V- g/mL,优选为20 ii g/mL。
本发明所述使体系中黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll最小浓度的含义为:在体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll为某一浓度时，随着该浓度的增加，体系中黄曲霉毒素BI的荧光淬灭率也不随之增加，该浓度即为使体系中黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll最小浓度。黄曲霉毒素BI荧光淬灭及基于其在黄曲霉毒素BI检测中的应用的工作原理:自然状态下的黄曲霉毒素BI在受紫外光(365nm)激发时能发出荧光，荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长为440nm，而当该黄曲霉毒素BI与其特异性的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll反应后再受到紫外光(365nm)激发时，黄曲霉毒素BI的荧光绝大部分被淬灭。本方法直接利用黄曲霉毒素的荧光能被其抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭的特性即可实现对黄曲霉毒素BI的快速、定量检测，不需要类似酶联免疫吸附法的多步反应步骤，也不需要添加额外的信号探针，如探针标记的抗体等。本发明的有益效果在于:
(I)直接定量检测黄曲霉毒素BI。利用黄曲霉毒素BI的荧光能被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭的特性，结合黄曲霉毒素BI溶液与其抗体反应前后的荧光强度值即可实现对黄曲霉毒素BI的定量检测。(2)操作简单快速，不需要类似酶联免疫吸附法的多步反应步骤。(3)无需标记、检测成本低、污染�：π�。该检测方法中只需在待测样品溶液(待测样品经常规的样品前处理和黄曲霉毒素BI免疫亲和柱净化处理而得)中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll即可进行检测，不需要另外添加荧光物质等有害化学试剂，也不需要探针标记的抗体或载体，对操作者和环境的�：臀廴拘。杀镜土�。
图1为系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液与其抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll反应前后荧光强度的比较，图中:每一浓度值对应的两列中:左列为各浓度黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光强度, 右列为加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll反应淬灭后的荧光强度；
图2为黄曲霉毒素BI浓度标准曲线C1 (X1, yi)，浓度范围为0.1 Ing/mL ；
图3为黄曲霉毒素BI浓度标准曲线c2 (x2, y2)，浓度范围为I 10ng/mL。
具体实施例方式 下述所用抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll是采用保藏编号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll根据专利申请号为CN201010245095.5的专利中报道的方法预先制得，具体制备方法如下:
用保藏编号为CCTCC N0.C201013的杂交瘤细胞株ICll注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水，4°C，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 u L,室温混合30min，4°C静置2h，然后4°C，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.lmol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 °C预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4°C静置2h，然后4°C，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.0lmol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70°C冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，将抗体置_20°C冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸，加水定容至IOOmL所得；所述的0.lmol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至IOOOmL所得。实施例1:花生中黄曲霉毒素BI的添加检测应用实验
I荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线c (X, y)的建立
(I)将浓度为500ng/mL的黄曲霉毒素BI甲醇储备液用稀释液磷酸盐缓冲液稀释，配制得到系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液(浓度分别为10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75、0.5、0.3、0.1和0 ng/mL),所述的磷酸盐缓冲液配方如下:0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至1000mL。取各系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液2mL在365nm激发波长下激发，获取各系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录波长440nm处的荧光强度值，见图1。(2)向上述10ng/mL的黄曲霉毒素BI标准品溶液中分别加入不同量的抗黄曲毒素通用单克隆抗体1C11，获得不同浓度抗黄曲霉毒通用单克隆抗体ICll的体系(体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的浓度分别为0.1，0.5 ,5,10, 20，30，40ng/mL)，采用如上条件进行荧光淬灭，将荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值与加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭前的荧光强度值相比，获得不同浓度的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的荧光淬灭率。具体结果:抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll浓度为0.1ng/mL时，黄曲霉毒素BI的荧光淬灭率31% ;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll浓度为
0.5 ng/mL时，淬灭率为37% ;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll浓度为5ng/mL时，淬灭率为49% ;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll浓度为10ng/mL时，淬灭率为78% ;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll浓度为20ng/mL时，淬灭率均为91%，且体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体含量继续增加时至抗体浓度为30或40ng/mL时，淬灭率仍为91%，说明体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll浓度为20ng/mL时，即可使黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭。故结合成本，选用下述体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度为20ng/mL。(3)向步骤(I)的各黄曲霉毒素BI标准品溶液中分别加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICl I，使各体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的终浓度均为20 u g/mL，混匀，放置lh，取各体系溶液2mL，在365nm激发波长下激发，获取各系体系的荧光发射光谱，取最大波长440nm处的荧光强度值，见图1。(4)对黄曲霉毒素BI标准品浓度为0.1-lng/mL的范围和l_10ng/mL的范围分别进行拟合即分段拟合得到小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1 (X1, yi)，曲线方程为:yi=106Xl+8859，其中黄曲霉毒素BI浓度，0.1-lng/mL, Y1为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll前后的440nm处荧光强度的差值，见图2，和得到大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2(x2,y2),曲线方程为:y2=71535x2+106,其中:x2黄曲霉毒素BI浓度，l_10ng/mL,y2为突光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll前后的440nm处荧光强度的差值，见图3。II花生中黄曲霉毒素BI的添加检测:
称取已磨好的花生空白样品5克，加入100 u L黄曲霉毒素BI的甲醇储备液，黄曲霉毒素BI的添加浓度为10 ng/g花生空白样品，放置半小时，待甲醇挥发完后加入15mL体积浓度为80%的甲醇水(含质量分数为4%的氯化钠)，在50 60°C水浴下超声10分钟，定量滤纸过滤，取滤液4mL加入2mL石油醚，涡旋I分钟，静置分层，取下层甲醇水3mL，加入9 mL水，混匀，将该稀释的样品提取液用孔径为0.45 y m的混合滤膜过滤，取IOmL滤液流过黄曲霉毒素BI免疫亲和柱，用ImL甲醇洗脱亲和柱，收集甲醇洗脱液，在60°C下用氮气吹干，再用2mL上述稀释液将黄曲霉毒素悬起，即为样品溶液，扫描样品溶液在365nm激发波长激发下的荧光发射光谱，再向样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll至抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll终浓度为20 ii g/mL,混勻,放置I小时后,在365nm激发波长激发下获得其荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值。检测结果:根据加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后体系荧光被抗体淬灭强度值，将待测样品溶液荧光被抗体淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll前后的440nm处荧光强度的差值代入大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2 (x2,y2)(如图3)中，得到样品溶液中的黄曲霉毒素BI浓度，再结合样品处理过程中的稀释情况，根据样品处理过程中浓度的变化关系计算出实际花生样品中的黄曲霉毒素BI的添加浓度为9.4 ng/g。实施例2:花生样品中黄曲霉毒素BI含量的检测应用实验
I荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线c (X, y)的建立如上述实施例1所述。II花生中黄曲霉毒素BI含量的检测:
称取已磨好的待测花生样品1#’ 2#或3# 5克，加入15mL体积浓度为80%的甲醇水(含质量分数为4%的氯化钠)，在50 60°C水浴下超声10分钟，定量滤纸过滤，取滤液4m L加A 2mL石油醚，涡旋I分钟，静置分层，取下层甲醇水3mL，加入9mL水，混匀，将该稀释的样品提取液用孔径为0.45 y m的混合滤膜过滤，取IOmL滤液流过黄曲霉毒素BI的免疫亲合柱，用ImL甲醇洗脱亲和柱，收集甲醇洗脱液，在60°C下用氮气吹干，再用2mL上述稀释液将黄曲霉毒素悬起，即为样品溶液，扫描样品溶液在365nm激发波长激发下的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值，再向样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，至抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll终浓度为20 V- g/mL,混勻,放置I小时后,在365nm激发波长激发下获得其荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值。检测结果:根据加入黄曲霉毒素通用单克隆抗体后体系荧光被抗体淬灭的值，确定将各样品溶液的荧光被抗体淬灭的值即加入抗体前后的440nm荧光强度的差值代入小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1(Xl，yi)或大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2 (x2, y2)，得到样品溶液中的黄曲霉毒素BI浓度，再结合样品处理过程中的稀释情况，根据样品处理过程中浓度的变化关系计算出花生样品中的黄曲霉毒素BI的浓度，得到花生样品I的待测溶液中黄曲霉毒素BI浓度为检出限0.1ng/mL以下，即样品1#中黄曲霉毒素BI含量为未检出；花生样品2的待测溶液中黄曲霉毒素BI浓度为0.6ng/mL，SP样品2#中黄曲霉毒素BI含量为2.16 u g/kg ;花生样品3的待测溶液中黄曲霉毒素BI浓度为3.2ng/m L，即样品3#中黄曲霉毒素BI含量为11.52 y g/kg。同时采用国家标准方法GB/T 18979-2003检测上述花生样品1#，2#或3#，其检测结果依次为:花生样品1#中黄曲霉毒素BI未检出，花生样品2#中黄曲霉毒素BI含量为2.g/kg，花生样品3#中黄曲霉毒素BI含量为12.2 y g/kg。结合上述检测可已看出:上述两种检测方法的检测结果相对相差均在10%以内。
权利要求
1.一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)提供待测样品溶液，检测待测样品溶液在365nm激发波长激发下，加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll使黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭前后的440nm处的荧光强度值，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生； (2)基于预先获得的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线，由该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值，求得待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的含量。
2.根据权利要求1中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:所述的步骤(I)中黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭后的440nm处的荧光强度值是在待测样品溶液中加入适量抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的待测样品体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度至少达到使体系中黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，然后混匀，于37±5°C放置至少0.5h，再经365nm激发波长激发测试得到测得的。
3.根据权利要求1中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:步骤(2)所述的荧光 被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线是采用以下方法得到的: ①配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液，在365nm激发波长激发下获得各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值； ②向上述各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入等量的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的浓度至少达到使最大浓度黄曲霉毒素BI标准品溶液中的黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，而使黄曲霉毒素BI荧光在抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的作用下充分淬灭，然后在365nm激发波长激发下获取各加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值； ③经拟合得到荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线c (x,y)——X黄曲霉毒素BI浓度，y为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭前后440nm处荧光强度的差值。
4.根据权利要求3中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:所述步骤①中一系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液是将黄曲霉毒素BI的甲醇储备液稀释配制得到的，浓度分别为10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75,0.5,0.3,0.1 ng/mL ;所述各溶液的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的溶液体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度为> 20 u g/mL。
5.根据权利要求4中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:所述步骤①中的稀释液为磷酸盐缓冲液，按下述方法配制:0.Sg氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至lOOOmL。
6.根据权利要求3中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:所述步骤②中为在各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll加入后混匀，并于37±5°C放置至少0.5h以使黄曲霉毒素BI荧光被充分淬灭，然后进行后续步骤。
7.根据权利要求3中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:所述步骤③为分段拟合，分别得到小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1 Cx1, Y1)——X1黄曲霉毒素BI浓度，0.1-1ng/ml, Y1为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体前后的440nm处荧光强度的差值，和大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2 (x2,y2)——X2黄曲霉毒素BI浓度，1-10 ng/ml, y2为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体前后的440nm处荧光强度的差值； 相应地，在求 算待测样品中黄曲霉毒素BI浓度时根据待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度确定选用小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1 Cx1, yi)，还是大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2(x2, y2)，然后结合该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值计算待测样品中黄曲霉毒素BI浓度。
8.根据权利要求3中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:所述待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的浓度应在该方法步骤(2)中的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体IClI淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线的有效检测范围内即.0.1-10 ng/mL，如超出，可对待测样品溶液进行相应浓缩或稀释处理后再进行检测；所述待测样品溶液加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度彡20 ilg/mL。
全文摘要
本发明涉及一种检测黄曲霉毒素B1含量的非标记免疫分析方法。它包括以下步骤检测待测样品溶液在365nm激发波长激发下，加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11使黄曲霉毒素B1荧光充分淬灭前后的440nm处的荧光强度值，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11产生；基于预先获得的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，由该待测样品溶液的荧光被抗体淬灭强度求得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量。该方法可用于直接定量检测黄曲霉毒素B1；操作简单快速；无需标记、检测成本低、污染�：π�。
文档编号G01N33/577GK103217528SQ20121050166
公开日2013年7月24日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者李培武, 李鑫, 张奇, 丁小霞, 张文, 张兆威, 李冉 申请人:中国农业科学院油料作物研究所
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