专利名称：一种测定甘胆酸的试剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种测定甘胆酸的试剂及试剂的制备方法，特别是采用乳胶增强免疫 比浊法测定血清或血浆中的甘胆酸的试剂及相应的制备方法，可广泛应用在医学及生物化 学技术领域。
背景技术：
血清甘胆酸(Cholyglycine，CG)是胆酸与甘氨酸结合二次的结合型胆酸之一，在 肝细胞内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去 氧胆酸(CD-CA)。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羟基以肽键与甘 氨酸结合，CG由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物 消化。95%胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。在血清中主 要以蛋白结合形式存在。正常情况下，外周血中胆酸含量甚微，正常成人无论空腹或餐后， 其血清CG浓度稳定在低水平。当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量 增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量 增高。测定血清甘胆酸(CG)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。 另外孕妇在怀孕的中后期，由于婴儿的增大，会压迫肝脏，使肝脏排泄胆酸发生障碍而导致 甘胆酸偏高，另外由于妊娠期胎盘合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代谢负荷增大，可 诱发肝胆系统的变化，使孕妇易患妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)，对胎儿产生严重的影响，随 ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早产率、胎儿宫内窘迫率及剖宫产率增高，严重者可导 致婴儿的死亡，因此测定孕妇血清甘胆酸，对及早发现ICP和了解ICP的严重程度有着非常 重要的意义，甘胆酸的测定可作为筛查和随访ICP的指标。从而降低围产儿病死率。
目前检测CG常用的实验室方法有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法 (CLIA)、酶联免疫法(ELISA)，放射免疫学分析法(RIA)检测耗时长(19 22h)，而且有放 射性元素的污染，标记物稳定性差，废弃物难以处理而使其受到限制。化学发光免疫分析法 (CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种 激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测 定CG的浓度。目前市场上有管式和板式两种试剂盒，但此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺 直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定的缺点；而且这种直接标记法属于瞬间发光型， 很难保证测试结果的稳定性和重复性，而且需要特殊的检测仪器。不便于常规实验室开展。 而利用生物素-亲和素系统检测CG的电化学发光免疫试剂盒，需要配套昂贵的全自动电化 学发光检测仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。酶联 免疫法(ELISA)自动化程度不高，且受人为因素影响较大，重复性差，整个反应测定时间也 很长(至少需要40分钟)。发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种甘胆酸检测试齐IJ;所提供的试剂应具有操作简单、测定时间短、准确度高、重复性好的特点，并可适用于各种类型的全自动生化分析仪的甘胆酸测定；所提供的试剂制备方法应具有制作方便以及成本不高的特点。
本发明提供的技术方案是一种测定甘胆酸的试剂， 包括以下成分及含量a、甘胆酸试剂1:缓冲液 pH值5-10电解质表面活性剂防腐剂稳定剂反应促进剂其余是纯化水，试剂I的PH为7. 2-8. O ；b、甘胆酸试剂2 :带有抗人CG抗体的胶乳颗粒稳定剂防腐剂10-400mmoi/L 10-400rnmol/L 0.01-10g/L 2-3 mmol/L 4-5 mmol/L 0.01-50g/L0.0001-0.05rnl/ml 2-4mmol/L 2-4 rnmol/L6.0-8.5 50rnmo!/L缓冲液pf其余是纯化水，所述带有抗人CG抗体的胶乳颗粒，其中的羧基胶乳微球粒径为20-500nm ； C、液体型甘胆酸参考校准品防腐剂稳定剂缓冲液pH 1Ι 2-4mmo!/L 160-180mnioi L 10-400mmol/L'rp.曰_>迫里CG纯品
其余为纯化水；
所述液体型甘胆酸参考校准品包括5份形成系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的 CG 含量由低到高分别为1. 25mg/ml、2. 5mg/ml、5. 0mg/ml、10. 0mg/ml、20. Omg/ml ； 或者，
所述液体型甘胆酸参考校准品是单点高浓度的CG参考校准品。
所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
所述试剂I中缓冲液的浓度为20-200mmol/L，缓冲液的pH值为7. 0-8. O。
所述反应促进剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50 )。
所述反应促进剂浓度为O. 01_50g/L。
所述反应促进剂浓度优选O. 05_30g/L。
所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质，浓度为50-200mmol/L。
所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。
所述电解质优选阳离子中的氯化钠。
所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂；所述表面活性剂浓度为O. 5-lg/L。
所述非离子表面活性剂,是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。
所述甘胆酸试剂2中带有抗人CG抗体的胶乳颗粒的含量为O. 002-0. 01ml/ml。
一种测定甘胆酸试剂的制备方法，按照以下步骤进行
I)甘胆酸试剂1:
按配方量将各成分混合，然后调节pH值即成；
2)甘胆酸试剂2:
(I)取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成O. Olmg/ml的悬浮液；
(2)按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC (乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺) 和40mg的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)的比例，立即混匀后在室温将此混合物反应 15-30分钟，不断搅拌；
(3)用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬�。媒喝槲⑶蚝课狾. Olmg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
(4)将抗人甘胆酸抗体溶于缓冲溶液中，使抗人甘胆酸抗体的蛋白质浓度为 O. 25mg/ml ；
(5)取步骤(3)中的羧基胶乳微球悬浮液Iml立即加入步骤(4)中抗人甘胆酸抗体Iml ;使混合液中羧基胶乳微球、抗人甘胆酸抗体和缓冲溶液的含量分别为O. 005mg/ml、O.125mg/ml、25mmol/L ；
(6)将混合物在37°C反应3小时，不断搅拌；
(7)按Iml反应混合物2. 5μ I乙醇胺的比例加入乙醇胺，然后反应10_30分钟，不断搅拌；
(8)离心处理除去未结合的蛋白质和乙醇胺，再用缓冲液稀释，使混合液中带有抗人CG抗体的胶乳颗粒的浓度为O. 002-0. Olml/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即成；
3)液体型甘胆酸参考校准品
先按配方量将防腐剂、稳定剂、缓冲液及纯化水混合并分成5份混合液，然后按照 需要的CG参考校准品浓度，将相应量的1000mg/ml的CG纯品分别加入上述混合液中，获得 5份形成系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的CG含量由低到高分别为1.25mg/ml、2.5mg/ml、5. Omg/ml > 10. Omg/ml >20. Omg/ml ;或者，
按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定 量的1000mg/ml的CG纯品，获得单点高浓度的CG参考校准品。
所述抗人甘胆酸抗体是羊抗人甘胆酸抗体或兔抗人甘胆酸抗体或鼠抗人甘胆酸 抗体或鸡抗人甘胆酸抗体。
所述离心处理采用离心机，离心机转速为15000转/分。
本发明提供的CG测定试剂的工作原理是样品中的CG与试剂中的带有抗人CG抗 体的胶乳颗粒发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，在一定范围内反应液浊度与样品 中抗原的量呈线性关系，可使用生化分析仪或其它光学检测仪器在540-600nm波长处测定 反应液吸光度值，反应液吸光度值与所测CG浓度成正比。
本发明的有益效果是采用的乳胶增强免疫比浊法的甘胆酸检测试剂，通过将CG 抗体与羧基胶乳微球结合，放大了 CG抗原和抗体反应的表面积，不但准确性高(与化学发 光免疫分析法的相关性R2为O. 9965-0. 9998)、重复性好，而且检测快速(从测定开始到得出 结果最多只需要10分钟，甚至更短)，能够在常规生化仪上进行大批量样本测定，大大提高 了检测工作效率。该试剂的制备方法操作简便，原料易得(全部选用外购原料)，成本不高， 适合各类医学研究单位以及常规实验室应用。
图1显示本发明实施例1中通过本发明所述方法所得CG试剂的测定值与化学发 光免疫分析法所得的CG测得值的相互关系。经回归分析y=l. 0064x+0. 0508，R2=O. 9994， 显示出本发明实施例1与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
图2显示本发明实施例2中通过本发明所述方法所得CG试剂的测定值与化学发 光免疫分析法所得的CG测得值的相互关系。经回归分析y=l. 0064x+0. 0508, R2=O. 9994显 示出本发明实施例2与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
图3显示本发明实施例3中通过本发明所述方法所得CG试剂的测定值与化学发 光免疫分析法所得的CG测得值的相互关系。经回归分析y=l. 0533x-0. 0633, R2=O. 9965显 示出本发明实施例3与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
图4显示本发明实施例4中通过本发明所述方法所得CG试剂的测定值与化学发 光免疫分析法所得的CG测得值的相互关系。经回归分析y=l. OOOlx+O. 0485，R2=O. 9998， 显示出本发明实施例4与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
具体实施方式
本发明检测试剂及校准品所需主要原料
1、抗人甘胆酸抗体，有许多商品化的抗人甘胆酸抗体可供选择，如芬兰DaKo公 司、日本UNF公司；该抗体仅与人甘胆酸反应，与其它抗原无免疫交叉反应，可以是多克隆 抗体或单克隆抗体，这里没有特别限制，只要能与胶乳微球偶联即可。其抗人甘胆酸抗体可以是羊抗(即羊抗人甘胆酸抗体；以下同)、也可以是兔抗、鸡抗或鼠抗。只要采用已知的免 疫电泳法测定，该抗体只与人CG之间呈现单一的沉定线，抗人甘胆酸抗体的滴度大于或等 于1. Omg/ml ο
2、胶乳微球，有许多商品化的纳米微球可供选择，如德国Merck公司、日本UNF公 司、日本JSR公司和Thermo公司；其基本材质是聚苯乙烯或共聚苯乙烯，表面用羧基基团 (COOH)修饰，也可不用作任何修饰，这里要根据选择抗体和微球的结合方法不同而选择不 同的球。如选择化学交联法，则用表面经羧基、氨基、醛基等修饰的微球(交联剂优选乙基 二甲基胺丙基碳化二亚胺)。
本法优选羧基基团修饰的胶乳微球，羧基胶乳微球的粒径优选20nm-500nm,更进 一步，优选 80nm-300nm。
试剂2中抗人CG抗体胶乳颗�？梢圆捎梦锢砦椒ɑ蚧Ы涣ㄖ票福痉⒚饔� 选化学交联法。
3、甘胆酸购自芬兰DaKo公司，用于制备本试剂所需参考校准品，可以是天然甘 胆酸蛋白，也可以是基因重组甘胆酸蛋白。
CG参考校准品浓度，可以设定形成系列浓度的5个参考校准品，5个参考校准品中 CG 含量由低到高分别为1. 25mg/ml、2. 5mg/ml、5. Omg/ml、10. Omg/ml>20. Omg/ml ；
也可以制备成单点高浓度(如100. Omg/ml，或500. Omg/ml)的CG参考校准品，使用 时再用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；这里没有特别的限制，只要制得的CG 参考校准品能与样品比较，能够测定样品中CG的含量即可。
下面将结合实施例进一步说明本发明，但这些实施例不应认为是限制本发明的定 义。
实施例一
一)甘胆酸试剂I
磷酸氢二钠(缓冲液)40mmol/L磷酸二氢钾(缓冲液)IOmmolZL吐温-20(表面活性剂)1.O g/LNaCL (电解质)200 mmol/LPEG-6000(反应促进剂)15 g/L叠氮钠(防腐剂)3 mmol/L乙二胺网乙酸二钠(稳定剂)5 mmol/L
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1000ml，然后用盐酸或 氢氧化钠调PH至7. 2。
二)甘胆酸试剂2
1.取80nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6. O的MES缓冲液稀释成O. Olmg/ml的悬浮液；
2.按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加入20mg EDAC(乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺)和40mg的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
3.用50mmol/L、PH6. O的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的 NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，其中羧基胶乳微球的含量为 O. Olmg/ml ο
4.将羊抗人甘胆酸抗体溶于50mmol/L、PH8. 5的HEPES缓冲溶液中，使羊抗人甘胆酸抗体的蛋白质浓度为O. 25mg/ml ；
5.取步骤(3)中的羧基胶乳微球悬浮液lml，加入步骤(4)中的羊抗人甘胆酸抗体Iml ;此时该混合液中羧基胶乳微球、羊抗人甘胆酸抗体和缓冲溶液的含量分别为0.005mg/ml、0. 125mg/ml、25mmol/L ；
6.将混合物在37°C反应3小时，不断搅拌；
7.按Iml反应混合物加2. 5 μ I的比例加入乙醇胺，反应20分钟，不断搅拌；
8.用15000转/分离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺 ，用50mmol/L、PH7. 2的MOPS 缓冲液稀释，使混合液中带有羊抗人CG抗体的胶乳颗粒的浓度为O. Olml/ml ;然后加入牛血清白蛋白(稳定剂)3mmol/L、3mmol/L叠氮钠(防腐剂)溶解混勻后即得甘胆酸试剂2。
三)液体型CG参考校准品
缓冲液 MOPSlOOminol/L. C PH7.2)防腐剂广谱杀菌剂2mmol/L稳定剂乙一.胺四乙酸一.钠2mmol/L稳定剂牛血清白蛋白3mmol/L.稳定剂氯化钠166mmoi/L
其余是纯化水；
按照需要的CG参考校准品浓度将相应的CG纯品1000mg/ml加入上述缓冲液中， 制备得5个系列浓度的参考校准品，5个系列浓度的参考校准品中CG含量由低到高分别为1.25mg/ml、2. 5mg/ml、5. Omg/ml> 10. Omg/ml>20. Omg/ml。
样本检测(与化学发光免疫法分别对比检测30个样本)按照实验操作步骤，向 10 μ L样品中加入240 μ L的甘胆酸试剂1，在37°C孵育3分钟，加入60 μ L甘胆酸试剂2， 37°C孵育10秒后在波长600nm读取吸光度A1，反应至5分钟时读取吸光度A2,计算两次吸光度变化值Λ A=A2-A115通过与同样处理的校准液比较，计算出样品中的CG浓度。从表I和图1 (图1根据表I数据绘制)结果可看出，本发明方法尽管操作简单，所需时间仅在10分钟以内，但与化学发光免疫法检测对比，显示非常良好的相关性(相关性R2为O. 9994)。
表I
权利要求
1.一种测定甘胆酸的试剂，包括以下成分及含量a、甘胆酸试剂1:缓抑液 pH{|'i:5-10 10-400mmoi/L ! li 解.).).(10-400mmol/L表而活性剂0.01-1 Og/L防腐剂2-3 mmol/L稳定剂4-5 mmol/L反应促进剂0.01-50g/L其余是纯化水，试剂1的pH为7. 2-8. 0 ；b、甘胆酸试剂2:带有抗人CG抗体的胶乳颗粒 0.0001 -0.05ml/ml稳定剂2-4mmol/L防腐剂2-4 mmol/L级沖液pH {丨1 丨:6.0-8.5 50mmol/L其余是纯化水，所述带有抗人CG抗体的胶乳颗粒，其中的羧基胶乳微球粒径为20-500nm ；c、液体型甘胆酸参考校准品防腐剂2-4mmol/L稳记剂160-180mmol/L缓冲液pH fl'i 5-10 10-400mmol/LCG纯品适量其余为纯化水；所述液体型甘胆酸参考校准品包括5份形成系列浓度的参考校准品；5份参考校准品 中的 CG 含量由低到高分别为 1. 25mg/ml、2. 5mg/ml、5. 0mg/ml、10. 0mg/ml、20. Omg/ml ;或 者，所述液体型甘胆酸参考校准品是单点高浓度的CG参考校准品。
2.根据权利要求1所述的一种测定甘胆酸的试剂，其特征在于所述缓冲液是磷酸盐 缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙 基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓 冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)_2_羟基丙磺酸(M0PS0)缓 冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
3.根据权利要求2所述的一种测定甘胆酸的试剂，其特征在于所述反应促进剂是聚乙 二醇或硫酸葡聚糖。
4.根据权利要求3所述的一种测定甘胆酸的试剂，其特征在于所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质，浓度为50-200mmol/L。
5.根据权利要求4所述的一种测定甘胆酸的试剂，其特征在于所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂,是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。
6.根据权利要求5所述的一种测定甘胆酸的试剂，其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。
7.根据权利要求6所述的一种测定甘胆酸的试剂，其特征在于甘胆酸试剂2中带有抗人CG抗体的胶乳颗粒的含量为O. 002-0. 01ml/ml。
8.权利要求6所述的一种测定甘胆酸试剂的制备方法，按照以下步骤进行1)甘胆酸试剂1:按配方量将各成分混合，然后调节PH值即成；2)甘胆酸试剂2:(1)取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成O.01mg/ml的悬浮液；(2)按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加20mgEDAC(乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺)和40mg 的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)的比例，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；(3)用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬�。媒喝槲⑶蚝课狾. 01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；(4)将抗人甘胆酸抗体溶于缓冲溶液中，使抗人甘胆酸抗体的蛋白质浓度为O.25mg/ml ；(5)取步骤(3)中的羧基胶乳微球悬浮液Iml立即加入步骤(4)中抗人甘胆酸抗体 Iml ;使混合液中羧基胶乳微球、抗人甘胆酸抗体和缓冲溶液的含量分别为O. 005mg/ml、 O. 125mg/ml、25mmol/L ；(6)将混合物在37°C反应3小时，不断搅拌；(7)按Iml反应混合物2.5μ I乙醇胺的比例加入乙醇胺，然后反应10-30分钟，不断搅拌；(8)离心处理除去未结合的蛋白质和乙醇胺，再用缓冲液稀释，使混合液中带有抗人CG 抗体的胶乳颗粒的浓度为O. 002-0. 01ml/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即成；3)液体型甘胆酸参考校准品先按配方量将防腐剂、稳定剂、缓冲液及纯化水混合并分成5份混合液，然后按照需要的CG参考校准品浓度，将相应量的1000mg/ml的CG纯品分别加入上述混合液中，获得5 份形成系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的CG含量由低到高分别为1.25mg/ml、2.5mg/ml、5. 0mg/ml > 10. 0mg/ml >20. Omg/ml ;或者，按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的 1000mg/ml的CG纯品，获得单点高浓度的CG参考校准品。
9.根据权利要求8所述的一种测定甘胆酸试剂的制备方法，其特征在于所述抗人甘胆酸抗体是羊抗人甘胆酸抗体或兔抗人甘胆酸抗体或鼠抗人甘胆酸抗体或鸡抗人甘胆酸抗体。
10.根据权利要求9所述的一种测定甘胆酸试剂的制备方法，其特征在于所述离心处理采用离心机，离心机转速为15000转/分。
全文摘要
本发明涉及一种测定甘胆酸的试剂及制备方法。目的是提供的试剂应具有准确度高的特点；提供的试剂制备方法具有制作方便的特点。技术方案是一种测定甘胆酸的试剂，包括以下成分a、甘胆酸试剂1；b、甘胆酸试剂2；c、液体型甘胆酸参考校准品。一种测定甘胆酸试剂的制备方法，按照以下步骤进行1)甘胆酸试剂1按配方量混合；2)甘胆酸试剂2(1)取悬浮液；(2)混合物反应；(3)得羧基胶乳微球悬浮液；(4)调整浓度；(5)取(3)中的悬浮液加入(4)中；(6)反应；(7)加入乙醇胺；(8)离心处理；3)液体型甘胆酸参考校准品按配方量混合得混合液，按CG含量排列或在混合液中加入CG纯品，得CG参考校准品。
文档编号G01N33/531GK102998445SQ20121053645
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者陈开华, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:元升生物科技(上海)有限公司
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