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专利名称：一种定量分析曲酸双棕榈酸酯的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效液相色谱(HPLC)分析方法，具体涉及以HPLC定量分析曲酸双棕榈酸酯的方法。
背景技术：
曲酸双棕榈酸酯是一种曲酸脂肪酸衍生物，近来被认为是一种效果显著的、较为稳定的皮肤美白剂，关于曲酸脂肪酸衍生物的美白机理及其对皮肤作用过程的研究也得到相当的重视。尤其是对曲酸脂肪酸衍生物经皮渗透行为的研究，可在美白产品研制中为配方的合理性提供依据，而准确测定曲酸脂肪酸衍生物含量是这些研究工作的必要手段之一。特别是测定生物样本如皮肤浸出液中的微量曲酸脂肪酸衍生物，要求有高精度、高灵敏度的方法。然而，目前还尚未有过曲酸脂肪酸衍生物定量测定方法的相关报导。

发明内容
由于目前尚未有相应的测定方法可以与曲酸脂肪酸衍生物在药物代谢动力学等学科中的研究相适应，本发明的目的就在于提供一种简便、快速、灵敏、准确度高、精确度好且回收率高的定量分析方法。
本发明提供的是一种高效液相色谱定量分析曲酸双棕榈酸酯的方法，采用反相分配柱，柱温25-45℃，流动相四氢呋喃/甲醇＝45/55～15/85，流速0.8～1.5ml/分。
本发明采用的反相分配柱选择C18色谱柱，例如，采用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm或Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等，均能得到良好的色谱分离图谱，而从性能/价格比考虑，以YWG C18250×4.6mm 10μm为佳。
本发明的高效液相色谱定量分析方法中，采用柱温25-45℃均能达到与杂质的有效分离，最佳柱温为35℃。
本发明的高效液相色谱定量分析方法中，采用流动相四氢呋喃/甲醇＝45/55～15/85均能达到与杂质的有效分离，而以流动相四氢呋喃/甲醇＝25/75分离效果最佳。
本发明的高效液相色谱定量分析方法中，采用的流速为0.8～1.5ml/分，以1.0ml/分分离效果为最佳。


图1是四种不同流动相配比的曲酸双棕榈酸酯色谱图。
图2是曲酸双棕榈酸酯的紫外线吸收光谱图，图中KAD为曲酸双棕榈酸酯，THF为四氢呋喃。
图3是不同柱温下曲酸双棕榈酸酯色谱分离图。
图4是曲酸双棕榈酸酯液相色谱定量校正曲线。
图5是分析条件调整前的7#、8#色谱分离图。图中，KAD为曲酸双棕榈酸酯，C-a为产品中的一种基质成分，P-II为促渗透剂。
图6是分析条件调整后的7#、8#色谱分离图。图中，KAD为曲酸双棕榈酸酯，C-a为产品中的一种基质成分，P-II为促渗透剂。
具体实施例方式
①流动相的选择曲酸双棕榈酸酯为弱极性化合物，难溶于水，微溶于甲醇、乙腈，在丙酮、四氢呋喃中有较好的溶解性，故采用非水系反相分配层析原理，用四氢呋喃/甲醇为流动相作色谱分析。
②流速的选择取不同流动相流速作曲酸双棕榈酸酯色谱分析，从保留时间、分离效果、色谱峰形等几方面进行比较，选择适宜的流速。
③色谱柱的选择根据反相分配层析原理及待测成分的化学结构，确定以C18柱为首选分析柱。具体选用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm、Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等多种牌号或型号的C18色谱柱。
④检测波长的选择将曲酸双棕榈酸酯纯品用四氢呋喃溶解，在波长190nm～400nm范围内作吸光度扫描。从紫外吸收光谱图(图2)可见曲酸双棕榈酸酯在217、250nm处分别有峰值吸收，因为四氢呋喃在217nm附近也有较大吸收，故以主吸收波长250nm作为检测曲酸双棕榈酸酯的首选波长。
⑤柱温比较不同柱温条件下所得到的样品色谱图，选择合适柱温，使待测成分与试样中共存成分得到最佳分离。
以上所述的分析条件选择是以曲酸双棕榈酸酯纯品为对象而确立的，在方法的实际应用中，遇到的样品大部分都是多组分的，出现干扰的情况很多。对于这些干扰成分可以通过样品预处理的方法去除，如液-液萃取、固相萃取等；或者通过调整分析条件组合，如流动相配比、柱温等，使待测成分与干扰成分得到有效分离。
实施例1 HPLC分析条件的确定本实施例采用Waters高效液相色谱系统Alliance 2690泵，YWG C18 250×4.6mm 10μm柱，2487紫外/可见光检测器，Millennium 32软件系统；试剂甲醇和四氢呋喃均为HPLC专用，水为蒸馏—去离子水。
(1)流动相的选择用不同配比的四氢呋喃/甲醇为流动相作曲酸双棕榈酸酯色谱分析，得到一组谱图(图1)。可以看到，四氢呋喃/甲醇比例从45/55～15/85时，均能达到较好的分离，而色谱峰保留时间随甲醇比例增加逐渐后移，与杂质峰的分离度也逐次增大，以四氢呋喃/甲醇配比为25/75分离效果最好。如果四氢呋喃/甲醇比例大于45/55或小于15/85，只要能有效分离，也可使用。
(2)流速的选择取0.8ml/分钟、1.0ml/分钟、1.5ml/分钟等不同流动相流速作曲酸双棕榈酸酯色谱分析，均能达到有效分离，而从保留时间、分离效果、色谱峰形等几方面比较后认为流速1.0ml/分钟为最佳。
(3)色谱柱的选择选用YWG C18250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm、Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm等多种牌号或型号的C18色谱柱分别作曲酸双棕榈酸酯色谱分析，均能得到良好的色谱分离图谱，而从性能/价格比考虑，以YWG C18250×4.6mm 10μm色谱柱为佳。
(4)检测波长的选择将曲酸双棕榈酸酯纯品用四氢呋喃溶解，在波长190nm～400nm范围内作吸光度扫描。从紫外吸收光谱图(图2)可见曲酸双棕榈酸酯在217、250nm处分别有峰值吸收，因为流动相溶剂四氢呋喃在次吸收峰217nm附近也有较大吸收，故以主吸收波长250nm作为检测曲酸双棕榈酸酯的首选波长。
(5)柱温的选择分别在25℃、30℃、35℃、45℃柱温条件下作曲酸双棕榈酸酯色谱分析，所得到的样品色谱图(见图3)表明在25～45℃范围内均达到很好的分离，保留时间随柱温的升高而明显前移，且杂质峰的分离度也有明显变化。实际应用中，可在25～45℃范围内或低于或高于此范围选择合适柱温，使待测成分与试样中共存成分得到最佳分离。
实施例2 定量相关性实验用一组不同含量的曲酸双棕榈酸酯标准系列样品按上述分析条件分别作色谱分析，将得到的色谱峰面积与含量作线性回归分析，所得到的回归曲线具有良好的线性关系(图4)，相关系数r＝0.9995。
实施例3 回收率与重复性实验在两个不含曲酸双棕榈酸酯的护肤霜中加入曲酸双棕榈酸酯，使其含量参考值分别为10.0、100μg/g，充分混合后按本方法平行测定10次，结果见表1。
表1、方法回收率与重复性实验结果测定 标准平均平均标准 相对样品号 次数 加入量 回收量 回收率 偏差 标准偏差次 μg/g μg/g ％ SDRSD％110 10 9.8998.91.81.8210 100 99.699.61.31 1.3
实施例4 在“几种美白剂及其配方经皮渗透合理设计最佳配方”研究中，应用本方法测定各种促渗透剂对曲酸双棕榈酸酯透皮效果的影响(1)含曲酸双棕榈酸酯样品的制备在甲醇∶四氢呋喃(40∶60)的溶剂中可充分溶解＜0.1mg/ml的曲酸双棕榈酸酯。制备样品时根据试样中曲酸双棕榈酸酯的含量范围按所述溶解极限决定稀释度。
(2)美白霜试样分析美白霜试样7#与8#基本配方组分相似，配方8#添加了促渗透剂P-II，用类似本发明条件的高效液相色谱法进行分析测定，分析条件为YWG C18250×4.6mm10μm柱、流动相配比甲醇∶四氢呋喃75∶25、流速1.0ml/分钟、柱温30℃、检测波长250nm。试样7#、8#的HPLC色谱图见图5，图中可见8#配方中曲酸双棕榈酸酯与组分C-a(产品中的一种基质成分)、组分P-II不能完全分离，因此定量分析的准确性受到影响。利用本发明的测定方法，对流动相配比、柱温等条件作适当调整后再对配方7#、8#作色谱分析(将流动相配比与柱温分别调整为85∶15和40℃)，得到的色谱图见图6。将图5、图6进行比较可以看到分析条件调整后，试样中各组分得到完全分离，可以准确定量试样中的曲酸双棕榈酸酯及其它成分。
权利要求
1.高效液相色谱定量分析曲酸双棕榈酸酯的方法，其特征在于采用反相分配柱，柱温25-45℃，流动相四氢呋喃/甲醇＝45/55～15/85，流速0.8～1.5ml/分，检测波长为250nm。
2.如权利要求1所述的方法，其中反相分配柱为C18柱。
3.如权利要求2所述的方法，其中反相分配柱选自YWG C18 250×4.6mm 10μm、u Bondpack C18(10μm)3.9×300mm、Bio-Rad RP18 250×4.6mm 5μm和Bio-Rad RP18 150×4.6mm 5μm。
4.如权利要求3所述的方法，其中反相分配柱为YWG C18 250×4.6mm10μm。
5.如权利要求1所述的方法，其中柱温为35℃。
6.如权利要求1所述的方法，其中流动相四氢呋喃/甲醇＝25/75。
7.如权利要求1所述的方法，其中流速为1.0ml/分。
全文摘要
本发明提供一种以高效液相色谱法定量分析曲酸双棕榈酸酯的方法，该方法在柱温25－45℃、流动相四氢呋喃/甲醇＝45/55～15/85、流速0.8～1.5ml/分钟、检测波长250nm条件下利用反相分配层析原理对样品进行分析，具有简便、快速、灵敏、准确的优点。
文档编号G01N30/36GK1472530SQ0213632
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月31日 优先权日2002年7月31日
发明者蔡惠民, 周莉 申请人:上海家化联合股份有限公司