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专利名称：维生素b12化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及维生素B12 (VB12)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
维生素B12 (vitamin B12, VB12)又叫钴胺素，是一种含钴的维生素，是所有具有氰钴胺素生物活性的类咕啉的总称，自然界中的VB12都是微生物合成的，高等动植物不能制造VB12，VB12是需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的唯一的一种维生素。另外，维生素B12也是唯一含必须矿物质的维生素，因含钴而呈红色，又称红色维生素，是少数有色的维生素。VB12属B群维生素，贮存量很少，约疒3mg在肝脏。人体维生素B12需要量极少，只要饮食正常，就不会缺乏。主要从尿排出，部分从胆汁排出。其主要生理功能包括①提高叶酸利用率，缺乏VB12时，从甲基四氢叶酸上转移 甲基基团的活动减少，使叶酸变成不能利用的形式，导致叶酸缺乏症。②维护神经髓鞘的代谢与功能。缺乏VB12时，可引起神经障碍、脊髓变性，并可引起严重的精神症状。VB12缺乏可导致周围神经炎。小孩缺乏VB12的早期表现是情绪异常、表情呆滞、反应迟钝，最后导致贫血。③促进红细胞的发育和成熟。将甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A，参与三羧酸循环，其中琥珀酰辅酶A与血红素的合成有关。④参与脱氧核酸(DNA)的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白质的代谢，增加核酸与蛋白质的合成。维生素B12为机体维持正常代谢、DNA合成和红细胞再生所必需。维生素B12缺乏得不到及时纠正可导致巨幼细胞贫血及不可逆性中枢神经系统损伤。维生素B12或叶酸测定对查明维生素B12、叶酸缺乏有诊断价值，尤其对巨幼细胞贫血的鉴别诊断有意义诊断方法目前临床上维生素B12定量检测常用方法有(I)放射免疫分析技术(RIA):较早的临床定量检测方法，灵敏度高，特异性高，但因为有放射性污染，且操作繁琐，市场逐渐萎缩。(2)酶联免疫分析法(ELISA) =RIA之后出现的分析方法，因操作简单，无放射性污染，价格较低，现在有一定的市场占有率，但ELISA灵敏度不如RIA。化学发光免疫分析(CLIA)为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好，无污染等优点，目前已广泛应用到基础医学和临床医学的各个领域，成为取代RIA的首选技术。化学发光免疫分析起步于80年代初，快速发展应用于90年代，主要特点是高敏感性、可测定浓度范围宽、样本无需稀释即可检测、试剂有效期长、操作简单、检测自动化成度高、数据自动生成处理能力强、测定仪器兼容性好、无环境污染等，因而得到了迅速发展与应用。但目前使用化学发光方法检测VB 12的试剂盒还较少，临床应用较少。

发明内容
本发明要解决的问题是提供维生素B12 (VB12)的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括VB12抗体包被板、VB12抗原酶结合物、VB12校准品、VB12质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液、样本处理液A液和B液。所述的VB12抗体包被板为包被有VB12抗体的96孔或48孔白色微孔板，孔间平均变异(CV%)不高于10%。所述的抗原酶结合物所用的酶为辣根过氧化物酶，纯度要求RZ ^ 3.0，活性^ 250U/mL,购自 Sigma 公司。VB12抗体来源于Fitzgerald公司，在外观上应澄清透明，无沉淀,纯度应彡90%,采用倍比稀释测定效价应不低于IO5倍稀释，应确保VB12测定的灵敏度、特异性和稳定性。所述的VB12质控品包括低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其中低值质控品 的浓度范围是158. 68 238. 02pg/mL,高值质控品的浓度范围是1141. 37 1712. 05pg/
mLo所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，所述的发光液A液包含O. 7g/L鲁米诺，O. 165g/L对碘酚；B液是浓度为O. 675g/L的过氧化脲水溶液。样本处理液A液包含36g/L NaOH ;样本处理液B液包含10. 66g/L MES (2- (N-吗啉代)乙磺酸)，L 03g/L DTT (二硫苏糖醇)，lg/L Proclin300, ρΗ5· 5。所述的20 倍浓缩洗液包括 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300o上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤I) VB12抗体包被板的制备将VB12抗体用O. 05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL,加入到白色微孔板中，37°C包被2小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS缓冲液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37°C封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后37°C烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2l°C ；2)采用高碘酸钠氧化法制备VB12抗原-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入HRP稳定剂，贴标签，储存于疒8°C ；3) VB12 校准品将VB12用1%BSA校准品稀释液配制成浓度为0，100，200，500，1000, 2000pg/mL的校准品，贴标签，储存于疒8°C ；4)VB12质控品的配制正常人血清经56°C水浴30min灭活和HBsAg、anti_HCV和anti-HIV检测呈阴性(使用经SFDA批准的实验方法)后，并加入Proclin300作为防腐剂。低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为198. 35pg/mL和1426. 71pg/mL ；5 )配制发光液A液和B液A液是含有O. 7g/L鲁米诺和O. 165g/L对碘酚的ρΗ8· 6的5mmol/LTris *HC1缓冲液液是浓度为O. 675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；6)配制20倍浓缩洗液20 倍浓缩洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20,1g/LProclin300 ；7)样本处理液的配制样本处理液A包含36g/L NaOH ;样本处理液B包含10. 66g/L MES (2- (N-吗啉代)乙磺酸)，I. 03g/L DTT (二硫苏糖醇)，lg/L Proclin300, ρΗ5· 5 ；8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ;9)对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。ProClin300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性， ProClin300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。维生素B12 (VB12)定量检测试剂盒(化学发光法)采用竞争法原理测定VB12，样本加到包被有猪内因子的白色不透明的条板微孔中，再加入鼠抗人抗体-辣根过氧化物酶(HRP)结合物，若样本中含有VB12，则形成固相VB12抗体-VB12-VB12抗体-HRP复合物，洗掉游离成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5 15分钟测定各加样本孔的发光值RLU。样本的RLU与样本VB12浓度呈负相关。样本中的VB12浓度依据由校准品VB12浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的VB12含量。本专利发明的维生素B12 (VB12)化学发光免疫定量测定试剂盒，采用当今最为灵敏的检测方法——化学发光免疫分析，具有一下优点(I)反应快速，可在65分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。(2)灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于50pg/mL。(3)特异性强，与钴啉醇酰胺的交叉特异性均小于1%。(4)精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20%。(5)稳定性良好，本产品在37°C可存放7天以上，在2 8°C可存放I年。(6)成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。


图I是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定VB12与放免试剂盒测定VB12的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的VB12值，横坐标为放免试剂盒测定VB12值，两种方法相关系数(r) =0. 9571，直线方程y=l. 049χ-22. 175。
具体实施例方式实施例I :制备VB12化学发光免疫定量检测试剂盒VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括VB12抗体包被板、VB12抗原酶结合物、VB12校准品、VB12质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液、样本处理液A液和B液。通过下述方法制备VB12化学发光免疫定量检测试剂盒I) VB12抗体包被板的制备
将VB12抗体用O. 05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL,加入到白色微孔板中，37°C包被2小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS缓冲液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37°C封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后37°C烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2l°C ；2)采用高碘酸钠氧化法制备VB12抗原-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入HRP稳定剂，贴标签，储存于疒8°C ；3) VB12 校准品将VB12用1%BSA校准品稀释液配制成浓度为0，100，200，500，1000, 2000pg/mL的校准品，贴标签，储存于疒8°C ;4)VB12质控品的配制正常人血清经56°C水浴30min灭活和HBsAg、anti_HCV和anti-HIV检测呈阴性(使用经SFDA批准的实验方法)后，并加入Proclin300作为防腐剂。 低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为198. 35pg/mL和1426. 71pg/mL ；5 )配制发光液A液和B液A液是有O. 7g/L鲁米诺和O. 165g/L对碘酚的ρΗ8· 6的5mmol/LTris · HCl缓冲液液是浓度为O. 675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；6)配制20倍浓缩洗液20 倍浓缩洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20,1g/LProclin300 ；7)样本处理液的配制样本处理液A包含36g/L NaOH ;样本处理液B包含10. 66g/L MES (2- (N-吗啉代)乙磺酸)，I. 03g/L DTT (二硫苏糖醇)，lg/L Proclin300, ρΗ5· 5 ；8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ;9)对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度和稳定性进行测定。说明测定指标物理检查液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。准确性试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用Log (X) -Logit (Y)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验，111〈2. 447);以企业标准品为对照品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在O. 90 1· 10范围内。企业校准品是将VB12纯品用校准品稀释液配成系列浓度，浓度分别为0，100，200，500，1000，2000pg/mL，根据 VB12 药典参考标准(Lot. 00H288)为其定值，储存于 _20°C。剂量-反应曲线的线性用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，剂量_反应曲线在(T2000pg/mL浓度范围内相关系数r不低于O. 9900。分析灵敏度试剂盒分析灵敏度不高于50pg/mL。精密度批内不精密度(CV%)应不高于15% ;批间不精密度(CV%)应不高于20%。质控品测定值平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为158. 68 238. 02pg/mL和 1141.37 1712. 05pg/mL。特异性交叉反应符合下表要求；
权利要求
1.VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括VB12抗体包被板、VB12酶结合物、VB12校准品、VB12质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液、样本处理液A液和B液。
2.根据权利要求I所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的VB12抗体包被板为包被有VB12抗体的96孔或48孔白色微孔板，白色微孔板的孔间平均变异不高于10%。
3.根据权利要求I所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的抗原酶结合物所用的酶为辣根过氧化物酶HRP，纯度要求RZ > 3. 0，活性> 250U/mL。
4.根据权利要求I所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的VB12抗体纯度> 90%,效价不低于IO5倍稀释。
5.根据权利要求I所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的VB12质控品包括低值质控品和高值质控品，其中低值质控品的浓度范围是158. 68 238. 02pg/mL，高值质控品的浓度范围是114L 37 1712. 05pg/mL。
6.根据权利要求I所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A液中包含O. 7g/L鲁米诺，O. 165g/L对碘酚；B液是浓度为O. 675g/L过氧化脲水溶液；样本处理液A液包含36g/L NaOH ;样本处理液B液包含10. 66g/L MES, I. 03g/L DTT, lg/LProclin300, pH5. 5。
7.根据权利要求I所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的20倍浓缩洗液包括 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl,5mL/L Tween-20，lg/LProclin300。
8.一种制备所述权利要求I的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤 OVB12抗体包被板的制备 将VB12抗体用O. 05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL，加入到白色微孔板中，37°C包被2小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS缓冲液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37°C封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后37°C烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于疒8°C ； 2)采用高碘酸钠氧化法制备VB12抗原-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入HRP稳定齐U，贴标签，储存于疒8°C ； 3)VB12校准品 将VB12用1%BSA校准品稀释液配制成浓度分别为0，100，200，500，1000, 2000pg/mL的校准品，贴标签，储存于疒8°C ; 4)VB12质控品的配制正常人血清经56°C水浴30min灭活和HBsAg、anti-HCV和anti-HIV检测呈阴性后，并加入Proclin300作为防腐剂。低值质控品和高值质控品，其浓度的平均值分别为198. 35pg/mL和1426. 71pg/mL ； 5)配制发光液A液和B液 A液是含有O. 7g/L鲁米诺和O. 165g/L对碘酚的pH8. 6的5mmol/LTriS · HCl缓冲液；B液是浓度为O. 675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制； 6)配制20倍浓缩洗液 . 20 倍浓缩洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300 ；7)样本处理液的配制 样本处理液A包含36g/L NaOH ;样本处理液B包含10. 66g/L MES, I. 03g/L DTT，lg/LProclin300, pH5. 5 ； 8)组装 将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ; 9)对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
9.根据权利要求8所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的包被板的固相载体为96孔或48孔的白色微孔板。
全文摘要
本发明公开了一种VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括VB12抗体包被板、VB12酶结合物、VB12校准品、VB12质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液、样本处理液A液和B液。另外本发明还公开了一种VB12化学发光免疫定量检测试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好，成本低等优点。
文档编号G01N33/82GK102798726SQ20121026170
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者刘萍, 宋启超, 董婷婷, 李克锦, 范利花 申请人:博奥赛斯(天津)生物科技有限公司