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专利名称：中药溶出度测定的化学轮廓技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然植物或以天然植物原料为主的中药口服固体制剂的宏观与微观溶出度测定技术。
背景技术：
溶出度是指药物从口服固体制剂在规定溶剂中溶出的速度和程度，是口服固体制剂质量控制的一个重要指标。现有的溶出度测定技术普遍采用标准品或对照品作为对照，以外标法测定该成分在溶出介质中的含量，从而计算药物的溶出度。然而，大部分中药是由天然植物或以天然植物原料制备而得，具有其中所含化学成分复杂、未知、可变的特征。这些特征要求中药的溶出度测定技术应当即具有“宏观”的特点，能够评价中药“整体”溶出的速度与程度；又具有“微观”的特点，能够具体分析中药中各成分的微观溶出度。目前溶出度测定技术难以兼顾中药“微观”与“宏观”的特点，不满足中药溶出度测定的要求，正由于此原因，中国药典2010年版仍尚未纳入或规定任何中药口服固体制剂的溶出度检查。化学轮廓是指复杂体系中所含化学分子的种类和数量信息的总体轮廓，它一般通过指纹分析方法检测样品中全部或部分化学成分，然后对色谱数据进行降维处理，直观地获得样品中化学分子的种类和数量信息的轮廓，从而据此分析样品中化学成分的总体差异以及产生此差异的原因。化学轮廓技术同时具有“微观”与“宏观”的特点，已经用于以天然植物原材料或以天然植物原料为主的药品、保健品与食品的质量评价与鉴定。目前，能够快速、简便、经济、准确、可靠的测定与评价中药“微观”与“宏观”溶出度的技术方法尚未见报道。

发明内容
本发明针对中药所含化学成分复杂、未知、可变的特征，提供一种能够快速、简便、经济、准确、可靠的测定中药口服固体制剂的“微观”与“宏观”溶出度的化学轮廓技术。本发明的技术包括，一种基于自身对照法的对照样品配制方法，一种中药口服固体制剂的溶出度测试方法，一种分离与检测样品中的化学成分的高效液相色谱方法，一种将样品色谱分析的数据进行主成分分析降维处理生成化学轮廓的方法，一种通过解析样品化学轮廓来测定中药“宏观”与“微观”溶出度的方法。本发明的具体操作方法如下将待测试批次的中药口服固体制剂粉碎，精密称取相当于单剂量重量的样品，用定量的色谱分析流动相溶解、滤过，并定量稀释作为对照样品；取待测试批次的中药口服固体制剂，按现行中国药典收载的溶出度测试方法，如2010年版二部附录XC收载的第一法、第二法或第三法，测试溶出度，采集溶出样品；将对照样品与溶出样品一并依次在相同的色谱条件下进行高效液相色谱分离与检测；采集各样品的色谱数据进行主成分分析降维处理，生成化学轮廓；通过对照样品与溶出样品的化学轮廓的解析来评价与计算样品的“宏观”与“微观”溶出度，分析中药中各种化学成分的溶出速度与程度是否一致，找出中药中溶出相对较慢与相对较快的成分。本发明的样品处理与检测特点在于对照样品的制备采用自身对照法，取用粉碎后的待检测批次的中药样品粉末，使其中所有或大部分成分能够完全溶解于对照样品；对照样品的溶剂可以是样品色谱分析使用的流动相，如反相色谱使用的水、甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等溶剂的混合物，或正相色谱使用的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、水等溶剂的混合物；对照样品的配制浓度相当于不同比率的单剂量固体制剂(如25%、50%、75%、100%与125%)溶解于溶出度测试所用溶出介质容量中的浓度；样品高效液相色谱分析根据待测试中药中主要成分的性质，可以选用反相色谱柱进行色谱分离，如C18柱、CS柱、苯基柱等，也可以使用正相色谱柱进行色谱分离，如硅胶柱、氨基柱、氰基柱等，通过色谱柱与流动相的配合实现样品中大部分成分的高效稳定分离；高效液相色谱分析的检测器可以选用紫外检测器、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等，尽量满足样品中大部分成分的检测要求。本发明的数据处理与分析特点在于对照样品与溶出样品的化学轮廓由色谱数据的主成分分析生成，换句话说，化学轮廓由样品色谱数据经主成分分析降维处理所生成的主成分表示。主成分分析的方法通常都已被程序化了，适用于这一目的的常用计算机程序有 Umetrics 公司的 SIMCA-P+, Exeter Software 公司的 NTSYSpc、SPSS 公司的 SPSS、SAS 公司的SAS与Mathworks公司的Matlab等。样品色谱数据所表征的样品化学轮廓由二维主成分表示时，对照样品的相对溶出量(如25%、50%、75%、100%与125%)与其两个维度主成分数据高度相关，呈三维线性关系；对照样品的化学轮廓二维平面图上呈一条直线，若溶出样品的化学轮廓若落在二维平面图对照样品的直线或其延长线上，则表明溶出样品中所含的化学成分比例与对照样品一致，换句话说，即样品中各种化学成分的溶出速度与程度是一致的，此时将溶出样品的主成分数据代入对照样品的直线回归方程，可直接计算样品的宏观溶出度；若溶出样品的化学轮廓若偏离了二维平面图对照样品的直线，则表明样品中各种化学成分的溶出速度与程度不一致；偏离得越远，样品中各成分的溶出速度与程度差异越大。通过与二维化学轮廓平面图相对应的荷载图的解析，可以找出中药中溶出相对较慢与相对较快的成分。本发明的技术方法的准确度与精密度使用质控样品进行监控与确认，质控样品的配制方法与对照样品的制备方法相同，配制浓度可以自行设定，比如相当于75%的单剂量固体制剂完全溶解于定量溶出介质的浓度。同一个质控样品插入对照样品与溶出样品的高效液相色谱分析序列，最终得到的色谱数据一并纳入主成分分析降维处理，根据质控样品与对照样品的化学轮廓对比分析，若计算得到的质控样品浓度与其配制浓度的回收率在90%-110%内，所有质控样品计算浓度的相对标准偏差在10%以内，即可确证高效液相色谱分离检测方法是准确可靠的，也就是说，为该中药口服固体制剂所设定的溶出度测定方法是准确可靠的。本发明的适用对象包括可粉碎成粉末的中药口服固体制剂，如中药片剂、胶囊、散齐U、颗粒剂、水丸剂、滴丸剂等；粘性中药口服固体制剂需要将样品切碎，如中药蜜丸剂等。本方法用于中药口服固体制剂的溶出度测定，不必明确其中的有效成分是什么，不需要主要成分/有效成分的标准品或对照品，只需建立高效液相色谱方法，实现样品中大部分化学成分的稳定的分离与检测，即可按照本发明的技术序贯进行“宏观”与“微观”溶出度分析。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。


图I是银杏叶片溶出度测定对照样品(25%，50%, 75%, 100%, 125%)的色谱图； 图2是银杏叶片溶出度测定质控样品(QC1-QC5)的色谱 图3是银杏叶片溶出度测定第一片15 min, 45 min, 90 min溶出样品的色谱 图4是银杏叶片溶出度测定样品色谱数据的二维化学轮廓 图5是二维化学轮廓图对应的荷载图。
具体实施例方式实施例.基于化学轮廓的银杏叶片溶出度测定 I).对照样品与质控样品的配制 取待测批次的样品20片，精密称重，研细，混匀。精密称取相当于I. 25片的重量，加50%甲醇500mL超声处理使溶解，摇匀，以0.2 U m孔径的聚四氟乙烯滤膜过滤，收集续滤液，精密吸取续滤液8. 00 mL、6. 00 mL、4. 00 mL、2. 00 mL，分别置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照样品，对照样品的浓度分别相当于125%、100%、75%、50%与25%的单片银杏叶片完全溶解于500 mL溶出介质的浓度。另精密称取相当于0.75片的重量，加50%甲醇500mL超声处理使溶解，摇勻，以0. 2 y m孔径的聚四氟乙烯滤膜过滤，收集续滤液，作为质控样品，质控样品的浓度相当于75%的单片银杏叶片完全溶解于500 mL溶出介质的浓度。2).溶出度实验
取待测试批次的银杏叶片6片，采用中国药典2010年版二部附录XC第二法(浆法)装置进行溶出度实验，溶出介质为0. I mol/L的盐酸水溶液500 mL，介质温度为37 ±0.5 ° C，浆转速为100转/分钟，于实验开始后15 min,45 min与90 min采集样品3 mL，于30 s内以0. 2 Pm孔径的聚四氟乙烯滤膜过滤，收集续滤液，即为溶出样品。3).高效液相色谱分离与检测
样品的高效液相色谱分析在安捷伦1200色谱系统上进行，配备紫外检测器。色谱柱为HALO C18壳层柱(2.7 u m, 4. 6 mmX 150 mm)，柱温为35 ° C，梯度洗脱条件为(A) 5mM乙酸铵/0. 2% 甲酸水溶液，(B)乙腈(0-18 min 15-45% B，18-22 min 45-95% B，22-23 min95-15% B, 23-30 min 15% B)，流速为0.6 mL/min，检测波长为254 nm。样品分析序列中，首先将质控样品连续进样3次以平衡色谱系统，随后依次进样分析对照样品与溶出样品，其中每隔5-6个样品插入进样I次质控样品，以检测分析序列中色谱系统的漂移情况。图I为25%、50%、75%、100%与125%的对照样品的色谱图；图2为75%的质控样品的色谱图；图3为A片15、45、90分钟溶出样品的色谱图。4).色谱数据的处理分析生成化学轮廓
调出所有对照样品、质控样品与溶出样品的色谱图，对齐保留时间后积分，积分参数为，斜率灵敏度为1，峰宽为0. 05，最小峰面积20，最小峰高2. 5 ;将各样品的积分结果导出，得到数据集，数据集中包括样品编号，色谱峰编号和对应的峰面积。样品的编号表示方法如下，对照样品以配制浓度表示，分别为25%、50%、75%、100%与125% ;质控样品以QC表示，分析序列中的5个质控样品分别为QC1-QC5 ；6片片剂的在15 min,45 min与90 min的溶出样品分别以A1-A3、B1-B3、C1-C3、D1-D3、E1-E3、F1-F3表示。所有样品中的色谱峰按保留时间编号共82个，分别表示为PEAK1-PEAK82。将数据集分别导入SIMPCA-P+12. O软件，进行主成分分析，生成化学轮廓，图4为银杏叶片溶出度测定的二维化学轮廓图。5).以化学轮廓解析银杏叶片的溶出度
由图4可见，对照样品的二维化学轮廓值(纵坐标t [I]与t [2])与其配制浓度(25%、50%、75%、100%与125%)呈多元线性关系，线性方程为，溶出度(%) =0. 159*t[l]+0. 361*t[2]+0. 025，相关系数r=l. 0000 ；同样将质控样品的化学轮廓值代入线性方程，计算准确度，5个质控样品的准确度以回收率表示为100. 2±1. 5%，表明化学轮廓计算样品的“宏观”溶出度是准确可靠的。由图4可见，在二维化学轮廓平面图上，所有溶出样品的数据点均未落在对照样品所呈的直线上。这种现象表明，溶出样品中的化学成分比例与对照样品并不一致，话句话说，即该银杏叶片中的各种化学成分的溶出速度与程度并不一致。可以发现，15 min与45 min的溶出样品偏离对照样品所呈的直线较远，表明此时各种化学成分的溶出速度与程度差异较大，可能是部分化学成分溶出速度较慢导致了此现象；而90 min的溶出样品相对靠近对照样品所呈的直线，并接近100%对照样品的数据点，表明此时各种化学成分较为接近完全溶出。图5为二维化学轮廓所对应的荷载图，横坐标p [I]表示82个色谱峰的峰面积值对化学轮廓t[l]的贡献大小,纵坐标p[2]表示82个色谱峰峰面积对化学轮廓t [2]的贡献大小。通过图4的解析，可以发现，对照样品与溶出样品的化学轮廓差异主要体现在t[2]，因此对t[2]贡献较大的色谱峰即为导致银杏叶片中的各种化学成分的溶出速度与程度并不一致的主要原因。通过图4与图5的对比分析，可以发现，PEAK50与PEAK56的p[2]值均大于+0.5，对t [2]正向的贡献相对最大;PEAK6的p[2]值小于-0. 2，对t [2]反相的贡献相对最大；而对照样品的t [2]值均大于溶出样品的t [2]值，表明样品中PEAK50与PEAK56所表征的化学成分溶出过慢或不能完全溶出，而PEAK6所表征的化学成分可能溶出相对其它成分更快，此即为导致银杏叶片中的各种化学成分的溶出速度与程度并不一致的主要原因。以上附图与实施例充分地表明了，中药溶出度测定的化学轮廓技术既可以观察并测定中药口服固体制剂的宏观溶出度值，更可以检查中药口服固体制剂的微观溶出情况，发现中药中各种化学成分的溶出速度与程度是否一致，找出中药中溶出相对较慢与相对较快的成分。本技术用于中药口服固体制剂的溶出度测定，区别于传统的溶出度测定技术，不需要明确其中的有效成分是什么，不依赖于主要成分/有效成分的标准品或对照品，技术所采用的自身对照化学轮廓分析方法完全符合中药中化学成分复杂、未知、可变的特点。本发明的技术可以解决中药口服固体制剂长期以来缺乏符合中药特点的溶出度检查方法的问题，可以广泛地用于中药口服固体制剂的溶出度的测定与检查。
权利要求
1.一种中药溶出度测定的化学轮廓技术，包括以自身对照法配制对照样品，测试样品溶出度并采集溶出样品，以高效液相色谱法分离检测对照样品与溶出样品，色谱数据经主成分分析降维处理生成化学轮廓，通过解析化学轮廓测定样品的宏观溶出度与微观溶出度。
2.如权利要求I所述的中药溶出度测定的化学轮廓技术，其特征在于，对照样品的制备采用自身对照法，取用粉碎后的待检测批次的中药样品，使其中所有或大部分成分能够完全溶解于对照样品。
3.如权利要求I所述的中药溶出度测定的化学轮廓技术，其特征在于，对照样品的溶剂是样品色谱分析使用的流动相，如反相色谱使用的水、甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等溶剂的混合物，或正相色谱使用的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、水等溶剂的混合物。
4.如权利要求I所述的中药溶出度测定的化学轮廓技术，其特征在于，对照样品的配制浓度相当于不同比率的单剂量固体制剂完全溶解于溶出度测试所用溶出介质容量中的浓度。
5.如权利要求I所述的中药溶出度测定的化学轮廓技术，其特征在于，样品分析采用高效液相色谱法，高效液相色谱分析的目的为尽可能地实现样品中大部分成分的稳定的分离与检测，此目的可以根据待测试中药固体制剂中主要成分的性质，通过色谱柱与流动相的配合并选择适宜的检测器来实现。
6.如权利要求I所述的中药溶出度测定的化学轮廓技术，其特征在于，以样品高效液相色谱分析的色谱数据的主成分分析生成对照样品与溶出样品的化学轮廓。
7.如权利要求I所述的中药溶出度测定的化学轮廓技术，其特征在于，对照样品的化学轮廓数值与对照样品的配制浓度呈线性关系，通过此直线回归方程可以计算溶出样品的浓度，从而测定样品的宏观溶出度。
8.如权利要求I所述的中药溶出度测定的化学轮廓技术，其特征在于，对照样品的二维化学轮廓在二维平面图上呈一条直线，通过溶出样品的化学轮廓在在二维平面图上与对照样品所呈直线之间的相对位置关系分析，配合二维化学轮廓相对应的荷载图的解析，评价样品微观溶出度，找出中药中溶出相对较慢与相对较快的成分。
全文摘要
中药溶出度测定的化学轮廓技术，涉及天然植物或以天然植物原料为主的中药口服固体制剂的宏观与微观溶出度测定技术。本发明包括以自身对照法配制对照样品，测试样品溶出度并采集溶出样品，以高效液相色谱法分离检测所有样品，色谱数据经主成分分析降维处理生成化学轮廓，通过解析化学轮廓评价样品的宏观与微观溶出度。本发明的技术区别于传统的溶出度测定技术，不需要明确其中的有效成分，不依赖于有效成分的标准品或对照品，既可以测定样品的宏观溶出度，也可以评价样品中成分的微观溶出度，符合中药中化学成分复杂、未知、可变的特点，可以应用于中药口服固体制剂的溶出度测定与检查。
文档编号G01N30/02GK102749392SQ20111042344
公开日2012年10月24日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者兰轲, 王安齐, 王战国 申请人:四川大学