专利名称：一种抗cd20单克隆抗体结合活性的检测方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法。
背景技术：
近年来，单克隆抗体及其导向治疗非霍奇金氏淋巴瘤的临床试验研究取得了重大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗⑶20的单克隆抗体制剂。美国Genentech和IDEC公司开发的抗⑶20单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab,商品名Rituxan)于1997年获得FDA批准上市，是第一个用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体药物。Rituxan为IgGl (kappa)嵌合性单抗,含有鼠抗人⑶20单抗重链和轻链的可变区，人IgGl (Kappa)重链、轻链的恒定区及人IgGl的Fe部分，能与细胞表面CD20分子高亲和力结合，从而导致被结合的淋巴细胞的清除。由于其在非霍奇金淋巴瘤治疗中表现出较好的疗效和较低的毒副作用，已经成为美国销售额最大的抗肿瘤药物之一。研究发现，当抗CD20单克隆抗体与抗原的亲和力提高时，抗体的特异性增强，对肿瘤细胞的杀伤效果也会显著提高。因此在抗CD20单克隆抗体的研制过程中，如何建立评价亲和力强弱的结合活性检测方法用于筛选出高亲和力的抗⑶20单抗显得非常重要，这在抗CD20单克隆抗体的研究开发，质量控制乃至临床应用中都具有重要的意义。从目前文献报道看，检测抗CD20单克隆抗体结合活性的方法主要有两种1、酶联免疫吸附测定法(ELISA)，主要将高表达⑶20的细胞直接包被，经固定后，进行ELISA检测。这种方法缺点是操作过程复杂、费时、费力，而且CD20膜蛋白比较容易受到细胞固定液的破坏，导致抗原与抗体的结合力降低，不能真实反映抗原抗体的结合活性，只能简单地鉴别阴、阳性结果。2、流式细胞术检测方法一种是竞争结合检测法，采用荧光标记的抗CD20单抗与待测样品竞争性结合细胞表面的CD20，由标记抗体的荧光强度来判断待测样品与抗原的亲和力。这种方法缺点是①、荧光标记效率难以标准化，如果标记不完全，易导致未标记上的抗CD20单抗与待测样品一起与标记上荧光的抗CD20单抗竞争结合细胞表面抗原，不能真实反应抗原抗体结合效率；②、该方法是一种竞争结合实验，只能反映待测样品与参考品的竞争结合细胞表面CD20能力的强弱，而且该方法在稳定性，重复性，可靠性方面也缺乏系统性的研究，不能真实地对待测样品的结合活性进行评价。另一种是间接检测法，虽然也采用商品化突光标记的FITC ant1-Human IgG进行检测,但是方法尚未标准化,多用于研发阶段的单抗筛�。醇鹨�、阳性结果，缺乏对方法进行专属性，准确性，重复性等方面的相关评价，对实验结果的评价也存在不同，难以保证检测结果的准确性与可靠性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有文献报道的方法中存在的上述不足，提供了一种能够快速、简便、准确、高效地进行抗CD20单克隆抗体药物筛选和结合活性分析的检测方法，该方法能够满足方法验证过程中对专属性，精密度包括重复性，日间差，人员操作误差，线性和范围，准确性以及耐用性等方面的要求，对于抗CD20单克隆抗体的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。为实现上述目的，本发明的技术方案如下一种抗⑶20单克隆抗体结合活性的检测方法，包括下列步骤a细胞培养取对数生长期高表达CD20的细胞，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整至0. 5-2. OX IO6个/ml活细胞密度，加入细胞培养板中，阴性对照孔以加入完全培养基；b参考品及待测样品稀释取参考品及待测样品，根据标示浓度，用完全培养基先稀释至预稀释浓度，再进行系列梯度稀释，得到11个稀释度；C加样将稀释好的系列梯度浓度的参考品及待测样品以500 U I/孔依次加入已铺好细胞的细胞培养板中，阴性对照孔加入完全培养基。完成后将细胞培养板放置于37°C，5%二氧化碳培养箱中孵育0. 5-lh ；d收获细胞收获细胞至离心管内，用Iml预冷的洗液洗涤细胞I次，2000r/min离心5分钟，弃上清液，收集细胞，将细胞重悬于100 ill预冷的洗液中；e染色加入FITC标记的Mouse ant1-Human IgG, 10 ii I/孔,4°C避光冰浴孵育
0.5-lh ；f洗涤用Iml预冷的洗液洗涤细胞2次，2000r/min离心5分钟，弃上清液，收集细胞，将细胞重悬于Iml预冷的洗液中；g流式细胞仪测定将细胞转入流式管，以阴性对照细胞设置阴性门和阳性门的分界线，记录各管细胞的平均突光强度(Mean Channel Fluorescence, MCF);以LogC-MCF进行曲线拟合，得出参考品和待测样品的EC5tl值，计算两者EC5tl值的比值得出待测样品相对参考品的结合活性。本发明采用的对数生长期高表达⑶20的细胞为人Burkitt' s淋巴瘤细胞Raji细胞。本发明采用的完全培养基是RPMI1640完全培养基，即在RPMI1640基础培养基的基础上添加10% FBS和1%双抗(链霉素与青霉素)。更进一步的，在实施步骤b中，所述参考品和待测样品合适的预稀释浓度是10-20 u g/ml。所述参考品和待测样品为抗人⑶20单克隆抗体。更进一步的，在实施步骤b中，所述参考品和待测样品的系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。更进一步的，在实施步骤d、f中，所述洗液是含1% FBS的PBS溶液。本发明细胞与待测单抗若不在24孔板内培养，改成在流式管或者EP管中进行抗原抗体孵育，缺点细胞容易沉降，堆积在管底，这样就会导致细胞表面抗原与待测抗体的结合不充分，而在24孔中，板底面积大，实验设计的细胞密度，正好铺满24孔板底面积的80%左右，而且细胞能够均匀分散，这样就有利于抗⑶20单抗到达细胞表面的⑶20表位，细胞表面的抗原与待测抗体可以充分结合。该方法专属性好，特异性强；精密度高，重复性，日间差以及人员操作误差RSD均小于10%，根据线性、精密度以及准确度的验证结果，可知测定范围为80% 120%。参考品和待测样品的曲线拟合常数R2均大于0.95。因此，采用本发明的方法能够快速，准确，高效的进行抗CD20单克隆抗体结合活性分析，这对于抗CD20单克隆抗体的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
图1 :流式荧光直方图叠加图，其中Plotl为阴性对照细胞，Plot 2为抗⑶20单抗与Raji细胞表面的CD20产生特异性结合的阳性细胞；图2 :参考品和同型对照Human IgGl的结合活性曲线拟合图；图3 :参考品和待测样品的结合活性曲线拟合图；图4 :抗CD20单克隆抗体结合活性方法验证(线性和范围)_线性拟合图；图5 -M⑶20单克隆抗体结合活性ELISA检测法4参数拟合图；图6 :参考品结合活性曲线拟合图-不同样品稀释浓度范围。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下列实施例涉及到的材料和试剂，实验条件和方法如下I材料和试剂材料参考品Rituxan (Biogen-1DEC公司产品，批号:B6027)，待测样品(抗人0)20单克隆抗体，嘉和生物药业有限公司制备)，Human IgGl Remicade (Johnson&Johnson公司产品)。试剂RPMI1640培养基粉末(购于GIBC0，Cat. No. 31800-022)，链霉素/青霉素双抗(购于 GIBC0, Cat. No. 15070-063)，FBS (购于 GIBC0, Cat. No. 10099-141)，FITC Mouseant1-Human IgG (购于 BD 公司，Cat. No. 555786)。细胞株Raji细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCHu 44)。2抗⑶20单克隆抗体结合活性检测过程I)细胞铺板取对数生长期的Raji细胞，用RPMI1640完全培养基制成单细胞悬液，计数，并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度至0. 5-2. 0 X IO6个/ml，以500 ii I/孔加A 24孔细胞培养板中，阴性对照孔以500 u I/孔加入完全培养基。2)参考品及待测样品稀释取参考品及待测样品，根据标不浓度，用RPMI1640完全培养基预稀释至10-20 y g/ml，再进行2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度。3)加样将稀释好的系列梯度浓度的参考品及待测样品以500 Ul/孔依次加入铺好细胞的24孔细胞培养板中，阴性对照孔以500 u I/孔加入完全培养基。完成后将细胞培养板放置于37°C, 5%二氧化碳培养箱中孵育0. 5-lh。4)收获细胞收获细胞至无菌的1. 5ml EP管，用Iml预冷的洗液洗涤细胞I次，2000r/min离心5分钟，弃上清液，收集细胞，将细胞重悬于100 U I预冷的洗液中。
5)染色加入FITC标记的Mouse ant1-Human IgG, 10 U I/孔，4°C避光冰浴孵育0.5-lh。6)洗涤用Iml预冷的洗液洗涤细胞2次，2000r/min离心5分钟，弃上清液，收集细胞，将细胞重悬于Iml预冷的洗液中。7)流式细胞仪测定将细胞转入流式管中，以阴性对照细胞设置阴性门和阳性门的分界线，记录各管细胞的平均荧光强度。8)结果分析以LogC-MCF进行曲线拟合，得出参考品和待测样品的EC5tl值，曲线
拟合常数R2，按照下列公式计算待测样品的结合活性
权利要求
1.ー种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法，包括下列步骤 a细胞培养取对数生长期高表达CD20的细胞，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整至0. 5-2. OX IO6个/ml活细胞密度，加入细胞培养板中，阴性对照孔以加入完全培养基； b參考品及待测样品稀释取參考品及待测样品，根据标示浓度，用完全培养基先稀释至预稀释浓度，再进行系列梯度稀释，得到11个稀释度； c加样将稀释好的系列梯度浓度的參考品及待测样品以500 Ul/孔依次加入已铺好细胞的细胞培养板中，阴性对照孔加入完全培养基；完成后将细胞培养板放置于37°C，5%ニ氧化碳培养箱中孵育0. 5-lh ； d收获细胞收获细胞至离心管内，用Iml预冷的洗液洗涤细胞I次，2000r/min离心5分钟，弃上清液，收集细胞，将细胞重悬于100 ill预冷的洗液中； e染色加入FITC标记的Mouse ant1-Human IgG, 10 u I/孔,4 °C避光冰浴孵育0.5-lh ； f洗涤用Iml预冷的洗液洗涤细胞2次，2000r/min离心5分钟，弃上清液，收集细胞，将细胞重悬于Iml预冷的洗液中； g流式细胞仪測定将细胞转入流式管，以阴性对照细胞设置阴性门和阳性门的分界线，记录各管细胞的平均荧光强度，以LogC-MCF进行曲线拟合，得出參考品和待测样品的EC50值，计算两者EC5tl值的比值得出待测样品相对參考品的结合活性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述针对对数生长期高表达CD20的细胞是人Burkitt' s淋巴瘤细胞Raji。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述完全培养基是含10%FBS和1%链霉素与青霉素的RPMI1640完全培养基。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于在步骤b中，所述參考品和待测样品为抗人⑶20单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于在步骤b中，所述预稀释浓度是10-20u g/ml。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于在步骤b中，所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述洗液为PBS溶液或生理盐水。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述洗液是含1%-2% FBS的PBS溶液。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述细胞培养板为24孔细胞培养板。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法。本发明公开了一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法，包括下列步骤a取对数生长期高表达CD20的细胞，进行细胞计数，调整至合适活细胞密度进行铺板；b将参考品及待测样品进行系列梯度稀释后，依次加入铺好细胞的培养板中培养一段时间；c收集细胞，加入FITC标记的二抗孵育一段时间；d用流式细胞仪检测，根据检测结果得出待测样品结合活性。本发明所述检测方法满足专属性、精密度、线性和范围、准确性以及耐用性等验证方面的要求，能够有效地应用于抗CD20单克隆抗体结合活性的检测。
文档编号G01N15/14GK103033621SQ201110302889
公开日2013年4月10日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者刘培培, 王少雄, 吕品, 陈香 申请人:嘉和生物药业有限公司
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