专利名称：评估和鉴定或发展条件活性治疗蛋白的方法
技术领域：
本发明提供发展或选择不良副作用降低的治疗蛋白的方法和所得的蛋白。
背景技术：
蛋白作为药剂或治疗剂具有治疗广泛多种人类疾病的作用，例如癌症、血友病、贫血以及糖尿�。⑶叶杂谛矶嗉膊《裕鞘俏ㄒ挥行У闹瘟品桨�。因此，需要鉴定活性或特性改变或改善的蛋白治疗剂。鉴定或产生此类蛋白是本发明的目的之一。发明概述本发明提供鉴定/选择条件活性蛋白的方法。在所述方法中，在期望该活性正常或增强的条件下测试蛋白的活性，并且在期望与正常活性相比活性降低的条件下测试蛋白的活性。可以将在期望该活性正常或增强的条件下的蛋白的活性，与在期望与正常活性相比活性降低的条件下的蛋白的活性进行比较。可以选择和/或鉴定，相比期望与正常活性相比活性降低的条件，在期望该活性正常或增强的条件下活性更大的蛋白。
在所述方法中，与正常活性相比，可以降低期望与正常活性相比活性降低的条件下的蛋白的活性。在所述方法中，除了使蛋白是条件活性的一种条件或多种条件之外，期望该活性正常或增强的条件和期望与正常活性相比活性降低的条件可以是相同的。在本发明的方法中，所测试的活性可以是与蛋白靶标的结合。可以将靶标固定于固相支持物。在本发明的方法中，可以利用免疫测定评估活性。免疫测定包括ELISA免疫测定、异相免疫测定以及均相免疫测定。在本发明的方法中，期望蛋白活性正常或增强的条件可以模拟疾病微环境，并且期望与正常活性相比活性降低的条件可以模拟健康组织环境。健康组织环境的实例是非肿瘤组织环境，如系统环境或健康组织。健康组织的实例是GI道、皮肤、脉管系统、血液以及细胞外基质。患病微环境的实例是肿瘤微环境。肿瘤或疾病微环境的PH可以比中性pH低或者比健康组织微环境的PH低。肿瘤或疾病微环境可以包括下述中的一种或多种:血管形成增加、缺氧、PH降低、组织间隙液压增加、标志肿瘤或其他疾病的代谢物或代谢改变。例如，与健康微环境相比，肿瘤或其他疾病微环境的乳酸盐浓度可以升高和/或丙酮酸盐浓度增加。本发明还提供这样的方法，在所述方法中，与期望与正常活性相比活性降低的条件相比，期望蛋白的活性正常或增强的条件可以包括低于中性的pH和升高的乳酸。在本发明的方法中，所测试的蛋白可以是治疗蛋白和/或具有在健康组织中表现出不期望的副作用的蛋白。在本发明的方法中，在期望与正常活性相比活性降低的条件下降低蛋白的活性，可以改善或防止不期望的副作用。在本发明所提供的方法中，可以在存在人血清的情况下，测试蛋白的活性。人血清可以以模拟生理条件的量存在，并且在期望该活性正常或增强的条件下存在的血清的量，可以与在期望与正常活性相比活性降低的条件下存在的血清的量相同。例如，按体积计，可以在存在下述百分比的人血清的情况下实施本发明所提供的方法:至少约或为3%_30%，含 3% 和 30%,或 5%-30%，含 5% 和 30%,或 5%_25%，含 5% 和 25%, 10%_30%，含 10% 和 30%,或15%-30%，含15%和30%，或15%-25%，含15%和25%中的任一浓度的人血清，包括25%或约25% (加减10%)的人血清。在本发明所提供的方法中，可以在期望该活性正常或增强的条件下和在期望与正常活性相比活性降低的条件下测试多种蛋白的活性。在这个具体方法中，可以在两种条件下测试每种蛋白，并且可以选择在期望该活性正常或增强的条件下比在期望与正常活性相比活性降低的条件下活性更大的任何蛋白。在一些实例中，活性高于预定量或比。例如，活性增强至少 5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍或更多。在本发明所提供的方法中，靶蛋白可以是受体或其结合配体的一部分。靶蛋白的实例是受体，所述受体是肿瘤抗原。例如，革巴蛋白Her受体家族的成员，或革巴蛋白是EGFR受体或其细胞外结构域。在本发明所提供的方法中，活性受到测试的蛋白(受试蛋白)可以是治疗肿瘤或其他疾病的治疗蛋白。在一些实例中，治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分，并且在本发明中提及抗体指抗体或其抗原结合片段。在本发明所提供的方法的其他实例中，蛋白可以是治疗蛋白的修饰变体。治疗蛋白的实例是靶受体的配体。在本发明所提供的方法的一些实例中，蛋白含有多聚化结构域，诸如，例如，含有Fe结构域或修饰的Fe结构域的多聚化结构域。在实例性方法中，治疗蛋白是抗体、酶、激素或细胞因子。例如，治疗蛋白是抗体。
在本发明所提供的方法中，在所述方法中受到测试的蛋白可以是选自表5(即本说明书中列举了示例性抗肿瘤抗体的表)所列那些抗肿瘤抗体的抗体。在一些实例中，抗肿瘤抗体在健康组织中表现出不期望的副作用。例如，所述抗体是在健康组织中表现出不期望的副作用的抗EGFR抗体或抗CTLA4抗体。在本发明所提供的方法的其他实例中，蛋白可以是治疗蛋白的修饰变体。修饰变体可以含有氨基酸取代、插入和/或缺失。在一些实例中，测试了变体的集合。在一些实例中，每种变体与野生型或非修饰蛋白和所有其他变体的不同之处在于一个氨基酸。在其他实例中，每种变体含有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个不同于非修饰的或野生型蛋白的氨基酸。在本发明所提供的方法中，在变体的集合中，在每一改变的位置处的氨基酸，被除了最初氨基酸之外的多达1-19种氨基酸取代。在其他实例中，组氨酸是取代氨基酸，或蛋白中的氨基酸被非碱性或不带电荷的氨基酸取代。可以单独测试每一变异蛋白。例如，可以以高通量模式或自动化方法测试每一变异蛋白。在本发明所提供的方法中，所选的蛋白可以是条件活性的，从而使得其与在非肿瘤环境中相比，在肿瘤或其他疾病微环境中的活性更强。可以将本发明所提供的方法重复多次，其中在每一次重复中，测试所选的一种或多种蛋白的其他变体，由此使治疗蛋白发展为表现出毒性降低或不良副作用降低。在本发明所提供的方法中，可以通过由含有编码变异蛋白的核酸分子的载体表达，产生所述变异蛋白。在本发明所提供的方法的一些实例中，所测试的蛋白是在CDR中含有一个或多个氨基酸取代的变异抗体。在具体实例中，沿着蛋白或其所选部分的长度，用多达19种其他氨基酸逐一取代每一氨基酸。在其他实例中，蛋白是抗体，并且所选部分是CDR。在一实例中，治疗蛋白是抗EGFR抗体，并且降低的不良副作用是与抗体的系统暴露相关的降低的皮肤毒性。在本发明所提供的方法的一些实例中，肿瘤或其他疾病微环境的PH约为或为5.8-6.8，并且含5.8和6.8。在其他实例中，所选的蛋白是在这样的肿瘤微环境中优先结合EGFR的抗EGFR抗体，即与正常生理pH7.3-7.4和低于12mM的正常乳酸盐浓度相比，所述所述微环境PH降低为5.8-6.8，并且乳酸盐浓度约为12-20mM。本发明提供用于鉴定条件活性蛋白的方法，其中所述方法通过以下方式实施:使涂覆了 EGFR或EGFR E⑶的固相支持物与pH约为7.3-7.4、含有ImM乳酸和约25%人血清的缓冲液接触；使第二副本支持物与PH约为6、含有12-20mM如16.6mM乳酸和约25%人血清的缓冲液接触；用相应的缓冲液(PH6.0或pH7.4)洗涤所述支持物；在具有乳酸和人血清的pH7.4的缓冲液中或在具有乳酸和人血清的pH6.0的缓冲液中将抗EGFR标记的如FLAG标记的标准品结合于相应的支持物；以及通过在相应的缓冲液中添加山羊抗Tag酶如辣根过氧化物酶(HRP)和酶底物，检测抗EGFR与EGFR的结合，以检测或定量抗EGFR与每一支持物的结合。本发明还提供利用本发明所提供的任何方法选择/鉴定或发展的治疗蛋白。本发明还提供与非修饰的抗体相比表现出降低的皮肤毒性的变异抗肿瘤抗体。本发明还提供与Erbitux相比表现出降低的皮肤毒性的抗EGFR抗体。 本发明提供用于鉴定/选择治疗肿瘤且在低pH下比在中性pH更具有活性的治疗蛋白。在所述方法中，在包 括低PH的条件下测试所述蛋白的活性，且在包括中性pH的条件下测试所述蛋白的活性。可以将在包括低PH的条件下的所述蛋白的活性，与在包括中性pH的条件下的所述蛋白的活性进行比较。可以选择和/或鉴定在低PH下比在高pH下更具有活性的蛋白。低pH可以是小于7.4的任何pH，例如介于或约介于5.8-6.8之间。中性pH也可以是介于或介于约7.2-7.6之间的任何pH，如7.4。在所述方法中，包括低pH的条件可以包括选自乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加以及缺氧的一种或多种条件。例如，包括低pH的条件可以包括选自以下的增加的乳酸盐浓度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少约或16mM、16.5mM或17mM的乳酸。在所述方法中，包括中性PH的条件可以包括选自以下的乳酸盐浓度:0.5-5mM或0.2mM至4mM的乳酸；或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸，或为或约为0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。本发明还提供用于鉴定鉴定/选择在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中更具有活性的治疗蛋白。在所述方法中，在存在于期望该活性的肿瘤微环境而不是非肿瘤环境中的条件下测试所述蛋白，并且在存在于非肿瘤微环境中的条件下测试所述蛋白的活性。可以将在存在于肿瘤微环境中的条件下的蛋白活性，与存在于非肿瘤微环境中的条件下的蛋白活性进行比较。可以选择和/或鉴定与在存在于非肿瘤微环境中的条件下相比，在存在于肿瘤微环境中的条件下活性更强的蛋白，从而鉴定在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中更具有活性的蛋白。非肿瘤微环境可以是系统微环境和/或健康组织，如胃肠(GI)道、皮肤、脉管系统、血液或细胞外基质。除了存在于肿瘤微环境中而不存在于非肿瘤微环境中的一种或多种条件之外，可以在相同的条件下测试在包括低pH的条件下和在包括中性pH的条件下的蛋白活性。存在于肿瘤微环境中的条件的实例包括诸如血管形成增加、缺氧、PH降低、乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加、组织间隙液压增加以及标志肿瘤的的代谢物或代谢改变的一种或多种特性。存在于肿瘤微环境中的条件可以包括比中性pH低的pH或比非肿瘤微环境的pH低的pH。例如，存在于肿瘤微环境中的条件可以是低于7.4的pH。在一些实例中，肿瘤的PH约为或为5.8-6.8，含5.8和6.8，并且存在于肿瘤微环境中的条件是pH介于或约介于5.8-6.8之间。存在于肿瘤微环境中的条件可以包括与存在于非肿瘤微环境中的条件相比升高的乳酸盐浓度和/或增加的丙酮酸盐浓度。存在于期望该活性的肿瘤微环境而不是非肿瘤环境中的、测试蛋白的条件可以包括比中性pH低的pH和与包括存在于非肿瘤微环境中的条件的、测试蛋白的条件相比升高的乳酸浓度。例如，比中性PH低的pH可以介于5.8-6.8之间，含5.8和6.8，或5.8-6.5之间，含5.8和6.5。存在于期望该活性的肿瘤微环境而不是非肿瘤环境中的、测试蛋白的条件可以包括选自以下的增加的乳酸盐浓度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少约或是16mM、16.5mM或17mM的乳酸。存在于非肿瘤微环境中的、测试蛋白的条件可以包括选自以下的乳酸盐浓度:0.5-5mM或0.的乳酸；或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸，或约0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。在所述方法的一些实例中，所述蛋白是治疗肿瘤的治疗蛋白。在一些实例中，治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分。在本文中提到本发明的抗体，包括抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述治疗蛋白是靶受体的配体和/或抗肿瘤抗体。用于本发明所提供的方法中的抗肿瘤抗体包括西妥昔单抗(Cetuximab (Erbitux ))、曲妥珠单抗(Trastuzumab (Herceptin ))、利妥昔单
抗(Rituximab (Ritlixan , MabThera ))、贝伐单抗(Bevacizumab (Avastin ))>
阿仑单抗(Alemtuzumab (Campath ))、帕尼单抗(Panitumumab (Vectibix ))、
雷珠单抗(Ranibizumab (LllCCntis )) ^ Ibritumomab λ 替伊莫单抗(Ibritumomab
tiuxetan) (Ze￥alin )).、托西莫单抗(Tositumomab)、碘1131托西莫单抗
(BEXXAR⑩)、卡妥索单抗(Catumaxomab (Removab ))、吉妥珠单抗、
吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg ))、阿贝西普
(Abatacept (CTLA4_Ig，Orencia;H )) ^ 贝拉西普(Belatacept (L104EA29YIg; LEA
29Y;LEA))λ 伊匹单抗(Ipilimumab(MDX-010，MDX-101))、曲美目单抗(Tremelimumab (ticilimumab，CP-675，206))、PRS-0 10、PRS-050、阿桕西普(Af Iiberc印t (VEGFTrap, AVE005))、伏洛昔单抗(Volociximab (M200))、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木单抗(Cixutumumab (IMC-A12))，马妥珠单抗(Matuzumab (EMD72000))、尼妥珠单抗(Nimotuzumab (h_R3))、扎鲁目单抗(Zalutumumab (HuMax-EGFR))、奈昔木单抗(Necitumumab) IMC-1lF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。在一些实例中，所述抗肿瘤
抗体是西妥昔单抗(E l b it U X.Η')...
本发明所提供的方法可以在体外或体内实施。在本发明所提供的方法中，可以测试多种蛋白，并且可以选择与中性pH相比在低PH条件下活性更强的蛋白。在本发明所提供的方法中，可以测试多种蛋白，并且可以选择在存在于肿瘤微环境中的条件下比非肿瘤微环境活性更强的蛋白。所述多种蛋白可以包括治疗蛋白的修饰变体，并且可以测试变体的集合。治疗蛋白可以包括多聚化结构域，且多聚化结构域可以包括Fe结构域或修饰的Fe结构域。治疗蛋白可以是抗体(包括抗肿瘤抗体)、酶、激素或细胞因子。在本发明所提供的方法中，抗肿瘤抗体可以选自西妥昔单抗(Erbitux )、曲妥珠单抗(Herceptin )、
利妥昔单抗(Rituxan , MabThera )、贝伐单抗(Avastin )、阿仑单抗(Campath )、
帕尼单抗CVectibk )、雷珠单抗(Lueentis )、Ibritumomab、替伊莫单抗
(Ibritumomab tiuxetan, Zevalin )、托西莫单抗、碘 Il3I 托西莫单抗(BEXXAR )、
卡妥索单抗(Removab )、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg )、阿贝
西普(CTLA4-1g, Orenda )、贝拉西普(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA)、伊匹单抗
(MDX-010, MDX-101)、曲美目单抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS_050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木单抗(IMC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h_R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗 MC-llF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
治疗蛋白或多种治疗蛋白的修饰变体，与所述治疗蛋白的非修饰形式相比，可以包括一个氨基酸残基或多个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。例如，每一变异蛋白，与所述治疗蛋白的非修饰形式相比，可以含有单个氨基酸取代。每一变异蛋白，与所述变异蛋白如治疗抗体的非修饰形式相比，可以含有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸取代。在一些实例中，所测试的蛋白是与抗体的非修饰形式相比在互补性决定区(OTR)中包含一个或多个氨基酸取代的变异抗体。在本发明所提供的方法中，可以测试治疗蛋白的变体，所述变体可以在每一改变的位置包括被多达1-19种除了在所述位置的最初氨基酸以外的其他氨基酸取代的氨基酸，并且每个氨基酸可以沿着所述治疗蛋白或其所选部分的长度被取代。本发明提供修饰蛋白是抗体并且其受到修饰的所选部分是CDR的方法。取代氨基酸可以选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr以及Val,前提条件是取代氨基酸不同于所述治疗蛋白相应位置处的氨基酸。取代氨基酸的实例是组氨酸。在一些实例中，蛋白中的组氨酸被非碱性或不带电荷氨基酸取代。在一些方法中，修饰包括用选自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的氨基酸进行的氨基酸取代，在一些实例中，用Hi s进行取代。
在本发明所提供的方法中，可以在例如阵列，包括可寻址阵列中，测试每一变异蛋白，如集合中的变异蛋白。在本发明所提供的方法中，测试的活性可以是与治疗蛋白的靶蛋白的结合。结合可以利用免疫测定如ELISA来评估。免疫测定的实例是异相免疫测定，所述异相免疫测定可以包括，将靶蛋白固定于固相支持物；使治疗蛋白与靶蛋白接触，其中可检测地标记治疗蛋白；除去未结合的治疗蛋白；以及检测或测量标记的治疗蛋白与靶蛋白的结合。免疫测定可以是均相的，包括使治疗蛋白与靶蛋白接触，其中可检测地标记治疗蛋白；并检测或测量标记的治疗蛋白与靶蛋白的结合。本发明提供利用细胞表面表达系统评估结合活性的方法，所述细胞表面表达系统包含在表面表达治疗蛋白的一种或多种细胞。治疗蛋白可以在细胞表面表达，可使靶蛋白与细胞群接触；可以鉴定结合靶蛋白的一种或多种细胞，从而鉴定表现出结合活性的治疗蛋白。可以可检测地标记或可以检测靶蛋白。可以荧光标记或利用荧光标记的第二试剂检测靶蛋白。利用荧光激活细胞分选术(FACS)，可以检测或测量结合。可以在利用细胞表面表达系统的方法中测试结合活性，所述细胞表面表达系统包含表达治疗蛋白的细胞，并且可以选择结合靶蛋白的一种或多种细胞，和选择不结合靶蛋白的一种或多种细胞。可以分离所选的不结合靶蛋白的一种或多种细胞，并使其于细胞培养基中生长，以便产生在表面表达治疗蛋白的第二细胞群。在一些实例中，在条件下测试结合活性，从而使来自第二细胞群的细胞与靶蛋白接触，并且鉴定结合靶蛋白的一种或多种细胞。附图的简单描述
图1.单克隆抗体ErbituxOI的序列。图1描绘了 ErbiUixt的序列(seq ID NO: I和2)。图1A描绘了重链的序列。 图1B描绘了轻链的序列。可变链加有下划线，且修饰所选的残基以粗体、斜体显示。详细描述概要A.定义B.方法综述C.体外生理敏感方法1.含有靶蛋白的支持物2.在浓密的结合条件下接触结合生物分子a.变异蛋白产生b.抗体变体 示例性的抗体结合分子:抗EGFR抗体3.肿瘤特异性结合分子的检测和鉴定D.表达蛋白的方法1.载体2.细胞和表达系统a.原核表达
b.酵母c.昆虫d.哺乳动物细胞e.植物3.纯化E.实施例A.定义除非另有定义，否则本文所用的所有科技术语与本发明所属技术领域技术人员通常所理解的具有相同的涵义。除非另有指出，否则将本文的整个公开所提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其他公开的材料通过引用整体并入。在本文的术语由多个定义的情况下，以本部分中的定义为准。如果参考URL或其他测量标示符或地址，应当理解到，这类标示符可以变化，并且互联网上的具体信息可能来来往往，但是通过检索互联网，可以发现等同信息。对其进行参考，证明了这类信息的可利用性和公众传播。本文所用的条件活性蛋白在一种环境、特别是一种体内环境中，与第二环境相比，更具有活性。例如，条件活性蛋白可以在肿瘤环境中比在非肿瘤环境如皮肤、GI道的非肿瘤环境或其他非肿瘤环境中更具有活性。本发明所用的治疗蛋白是已经用于治疗患有疾病或疾病状况的个体、可以用于治疗或是用于治疗的候选者的蛋白。例如，用于疗法的候选者是已经用于疗法的治疗蛋白的变体(例如含有氨基酸修饰)。出于本发明的目的，治疗蛋白，包括已经用于治疗、可以用于治疗或是治疗的候选者的 蛋白在内，可以用于本发明所述方法实践中，作为测试蛋白来鉴定在一组条件下比在另一在条件下表现出更多活性的治疗蛋白，并因此是治疗活性的。本文所用的“测试蛋白”、“受试蛋白” “结合分子”、“结合蛋白”或其其他变型，指用于本发明所述方法中的分子或蛋白。本发明所述方法可以使用任何分子或蛋白来鉴定是条件活性的并且与存在于非患病微环境中的一种或多种条件相比在存在于患病微环境(如肿瘤微环境)中的一种或多种条件中表现出活性的蛋白。为了发展条件活性的治疗剂，受试蛋白的实例是治疗蛋白。示例性的受试蛋白列于表3中。本发明所用的抗体指免疫球蛋白或免疫球蛋白部分，无论其是天然的或部分或全部合成的，如重组产生的，包括其含有免疫球蛋白分子的足以形成抗原结合位点的可变区的至少一部分的任何部分。因此，抗体或其部分包括具有与免疫球蛋白抗原结合位点同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。例如，抗体指含有两条重链(其可以表示为H和H’ )和两条轻链(其可以表示为L和L’ )的抗体，其中每一条重链都可以是全长免疫球蛋白重链或其足以形成抗原结合位点的一部分(例如，重链包括但不限于Vh链、Vh-ChI链、以及Vh-Ch1-Ch2-Ch3链)，并且每条轻链都可以是全长轻链或其足以形成抗原结合位点的一部分(例如，轻链可以包括但不限于\链和链)。每一条重链(H和H’)都与每一条轻链(分别为L和L’)配对。通常，抗体最低限度包括所有或至少部分可变重(Vh)链和/或可变轻链。抗体还可以包括所有或部分恒定区。出于本发明的目的，术语抗体包括全长抗体和其部分，包括抗体片段，如但不限于Fab、Fab’、F(ab，)2、单链 Fv (scFv)、Fv、dsFv、双价抗体(diabody)、Fd 和 Fd，片段、Fab 片段、Fd片段以及scFv片段。其他已知的片段包括但不限于scFab片段(Hust et al.，BMCBiotechnology (2007), 7:14)。抗体包括任何免疫球蛋白类别的成员，包括IgG、IgM、IgA、IgD 以及 IgE0本发明所用的全长抗体是具有两条全长重链(如Vh-Ch1-Ch2_Ch3或Vh-Ch1-Ch2-Ch3-Ch4)和两条全长轻链('-CJ以及铰链区的抗体，如抗体分泌B细胞所产生的人类抗体和具有合成产生的相同结构域的抗体。对于抗体的“其部分”“其片段”，本文所用的抗体片段或抗体部分指全长抗体的任何部分，其小于全长，但是含有足以形成抗原结合位点的抗体可变区的至少一部分(如一个或多个CDR)并且因此保留了全长抗体的结合特异性和/或活性；抗体片段包括全长抗体的酶促处理所产生的抗体衍生物以及合成如重组产生的衍生物。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F (ab，) 2、单链Fv (scFv)、Fv、dsFv、双价抗体、Fd以及Fd’片段(参阅例如Methods in Molecular Biology, Vol207: Recombinant抗体for Cancer Therapy Methodsand Protocols (2003) ; Chapterl; p3_25, Kipriyanov)。片段可以包括诸如通过二硫键和 /或通过肽连接体而连接在一起的多条链。抗体片段通�：兄辽僭�50个氨基酸并通�：兄辽�200个氨基酸。因此，提到“抗体或其足以形成抗原结合位点的部分”表示，抗体或其部分含有足以保留含有所有6个⑶R的相应全长抗体的至少一部分结合特异性的Vh和\的至少I个或2个、通常3个、4个、5个 或所有6个⑶R。通常，足够的抗原结合位点至少需要重链的⑶R3(⑶RH3)。其通常还需要轻链的⑶R3(⑶RL3)。如本文所述，本领域技术人员知道并且能够基于卡巴特(kabat)或 Chothia 编号(参见例如 Kabat, E.A.et al.(1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Healthand Human Services, NIH Publication N0.91-3242,和 Chothia, C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)鉴定 CDR。本发明所用的互补决定区(CDR ;也称为高变区)是抗体内决定蛋白对特异性抗原的亲和性和特异性的区域。因此，CDR是结合抗原决定子的抗原可变区内的有限区域。抗体的CDR是已知的或可以基于卡巴特或Chothia编号来确定,这对于本领域技术人员而言是已知的。本发明所用的，“抗原结合位点”指一个或多个互补决定区(⑶R ;也称为高变区)所形成的界面。每一个抗原结合位点含有3个来自重链可变区的CDR和3个来自轻链可变区的CDR。抗体分子具有2个抗原结合位点，每个位点都含有重链可变区的部分和轻链可变区的部分。除了 CDR之外，抗原结合位点还可以含有可变区结构域的其他部分。本发明所用的Fv抗体片段由通过非共价相互作用而连接的一可变重链结构域(Vh)和一可变轻链结构域构成。本发明所用的dsFv指具有稳定Vh-V1j对的改造的分子间二硫键的Fv。本发明所用的Fd片段是含有抗体重链的可变结构域(Vh)和一个恒定区结构域(ChI)的抗体片段。本发明所用的“Fab片段”是含有用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所产生的部分全长抗体的抗体片段，或合成或重组产生的具有相同结果的片段。Fab片段含有轻链(含有'和Q部分)以及含有重链(Vh)的可变区和重链的一个恒定区结构域部分(ChI)的另一链；其可以重组产生。本发明所用的F(ab’)2片段是用胃蛋白酶于pH4.0-4.5消化免疫球蛋白而产生的抗体片段或合成如重组产生的具有相同结构的抗体。F(ab’)2片段含有两个Fab片段，但是其中每条重链部分都含有形成连接所述两个片段的二硫键的少数其他氨基酸，包括半胱
氨酸残基；其可以重组产生。Fab’片段是含有一半F(ab’ )2片段的片段(一条重链和一条轻链)。本发明所用的Fd’片段是含有F(ab’)2片段的一重链部分的抗体的片段。本发明所用的Fv’片段仅含有抗体分子的Vh和\结构域的片段。本发明所用的scFv片段指含有通过多肽连接体以任何顺序共价连接的可变轻链(Vl)和可变重链(Vh)的抗体片段。连接体具有的长度使得两个可变结构域桥接，而无实质干扰。示例性的连接体是(Gly-Ser)n残基，伴随一些Glu或Lys残基分散于其中，以增加溶解度。本发明所用的双价抗体是二聚scFv ;双价抗体通常具有比scFv短的肽连接体,并且它们优先二聚化。本发明所用的，hsFv指这样的抗体片段，在所述抗体片段中，通常存在于Fab片段中的恒定结构域已经被异二聚体卷曲螺旋结构域取代(参见例如Arndt et al.(2001) JMol Biol.7:312:221-228)。本文针对抗体所用的“可变结构域”是抗体重链或轻链的、含有在不同抗体间变化的氨基酸序列的特定Ig结构域。每一条轻链和每一条重链都具有一个可变区结构域('和Vh)。可变结构域提供了抗原特异性，并因此负责抗原设别。每一可变区结构域都含有是抗原结合位点结构域的一部分的CDR和构架区(FR)。如本发明所用，提到可变重(Vh)链或可变轻(')链(也称为Vh结构域或\结构域)指构成抗体的可变结构域的多肽链。本发明所用的构架区(FR)是抗体可变区结构域内位于β折叠内的区域；FR区在其氨基酸序列方面比较而言比高变区保守。本发明所用的恒定结构域是抗体重链或轻链中含有在抗体间相比较而言比可变区结构域更保守的氨基酸序列的结构域。每一条轻链都具有单个轻链恒定区(Q)结构域，且每一条重链都含有一个或多个重链恒定区(Ch)结构域’其包括^^、^^、^^以及Ch4。全长IgA、IgD以及IgG同种型含有CH1、Ch2、Ch3和铰链区，而IgE和IgM含有CH1、CH2、CH3和Ch4。ChI和Q结构域延长抗体的Fab臂，因此有助于与抗原的相互作用和抗体臂的旋转。抗体恒定区可以发挥效应子功能，诸如但不限于清除抗体例如通过与各种细胞、生物分子和组织的相互作用特异性结合的抗原、病原体和毒素。本发明所用的抗体形式指抗体的具体结构。本发明的抗体包括全长抗体和其部分，诸如，例如Fab片段或其他抗体片段。因此，Fab是抗体的具体形式。如本发明所用，提到抗体的“相应形式”表示，当比较两个抗体的特性或者活性时，利用相同形式的抗体比较特性。例如，如果提到与第一抗体的相应形式的活性相比，抗体的的活性较少，这表示，所述抗体的具体形式，如Fab，与第一抗体的Fab形式相比具有较少的活性。 本发明针对相应残基所用的相应的，例如“对应于……的氨基酸残基”，指在为相关序列的两条多肽(如等位基因变体、同一家族的基因、物种变体)之间或之中比较的残基。本领域技术人员能够容易地鉴定在多肽之间或之中对应的残基。例如，通过比对两条序列，本领域技术人员能够利用保守和相同氨基酸作为指导鉴定相应的残基。本领域技术人员能够手动比对序列或可以使用可用的许多比对程序中的任何程序(例如，BLAST)。因此，彼此对应的氨基酸残基或位置，是基于与指定的参照多肽的序列和/或结构比对，经测定彼此对应的残基。本发明所用的“连接”或“间隔”肽指连接两条多肽序列的短氨基酸序列(或编码这类氨基酸序列的核酸)。“肽连接体”指连接两条多肽序列的短氨基酸序列。多肽连接体的实例是，将肽截短结构域连接于抗体的连接体或连接合成抗体片段如scFv片段的两条抗体链的连接体。连接体是熟知的，并且任何已知的连接体都可以用于所提供的方法中。多肽连接体的实例是(Gly-Ser)n氨基酸序列，伴随一些Glu或Lys残基分散于其中，以增加溶解度。其他示例性的连接体在本文中有描述；这些和其他已知的连接体中的任何连接体都可以与所提供的组合物和方法一起使用。本文所用的“人血清”指正常血清，其可以通过汇集约等量的来自未患有任何可通过输血传播的疾病的人的凝结的全血的液体部分而获得。如本文所用，提到“可检测的”或“可检测标记的”指原子、分子或组分，其中可以直接或间接测量原子、分子或组分的存在。可检测标记可以用于在本发明所提供的方法中鉴定一种或多种蛋白。可检测标记可以用于本发明所提供的任何方法中。可检测标记包括例如化学发光部分、生物发光部分、荧光部分、放射性核素以及金属。检测标记的方法在本领域是熟知的。可以通过视觉检查、荧光光谱、反射测量以及流式细胞术来检测这类标记。间接检测指测量直接或间接结合可检测标记的原子、分子或组分的物理现象，如直接或间接结合可检测标记的原子、分子或组分的能量或粒子发射或吸收。在间接检测的非限制性实例中，可检测标记可以是生物素，其可以通过结合抗生物素而得到检测。因此，包括于可检测标记或可检测部分范围内的是，涉及原子、分子或组分的结合标记或结合部分，其中作为结合另一原子、分子或组分的标记或部分的结果，可以检测原子、分子或组分的存在。本文所用的 标记是可以直接或间接附着于或连接于分子或与之结合的可检测标记。检测方法可以是本领域已知的任何方法。本文所用的“筛选”指基于抗体或其部分的活性或特性的确定，从许多抗体如抗体集合或文库和/或其部分中鉴定或选择蛋白，例如人抗体或其部分。筛选可以以多种方式中的任何方式实施，并且通常涉及使集合的成员与靶蛋白或抗原接触，并评估特性或活性，例如利用评估抗体与靶蛋白直接结合(结合亲和性)的测定或利用评估靶蛋白活性调节的功能测定。从获得抗体或其部分与靶蛋白结合的绝对值和/或抗体或其部分对靶蛋白调节的绝对值的意义上讲，以及从获得标志结合或活性水平的指数、比、百分比、视觉或其他值的意义上讲，本文所用术语“评估”或“测试”意图包括定量和定性测定。评估可以是直接的或间接的。例如，结合可以通过用可检测标记直接标记抗体或其部分和/或通过利用自标记的第二抗体测定。此外，利用本领域技术人员已知的多种测定中的任何测定例如中和测定和本文所述的其他测定，并比较在存在与不存在抗体或其部分的情况下的膜伴随抗原(如住病毒的细胞)的活性，来测定功能活性。
本文所用的“高通量”指允许操作大量分子或化合物、通常从数十到数百到数千化合物的大规模方法或过程。例如，可以使纯化和筛选方法是高通量的。高通量方法可以手动进行。然而，高通量方法通常涉及自动化、机器人或软件。本文所用的“靶蛋白”或“蛋白的靶标”是能结合测试分子或蛋白或与之相互作用的蛋白、抗原或基质。本文所用的"疾病”指起因于包括但不限于感染、后天条件、基因条件等的原因或条件并且特征为可确认的症状的生物体的病理状态。疾病包括癌症和肿瘤。本文所用的“患病微环境”指在具体微环境中与正常组织相比，在疾病组织中发生改变或变化的具体条件。这些条件包括例如血管形成改变升高或变化，缺氧、pH改变、辅因子、组织间隙液压以及代谢物水平如乳酸盐或丙酮酸盐水平改变。本文所用的“非患病微环境”或“健康组织环境”条件指在正常生理条件下存在的条件。例如，在正常的生理条件下，非患病微环境如非患病组织的pH可以是中性的。本文所用的“模拟疾病或非患病微环境的条件”指对应于存在于体内环境中的一种或多种条件的体外或体内测定条件。例如，如果微环境的特征是低PH，则模拟微环境的条件包括具有低pH的缓冲液或测定条件。本文所用的存在于肿瘤微环境中的条件包括，与非肿瘤微环境(如健康或非患病细胞或组织)相比存在于其中的条件。存在于肿瘤微环境中的条件包括血管形成增加、缺氧、低pH、乳酸盐浓度 增加、丙酮酸盐浓度增加、组织间隙液压增加以及标志肿瘤的代谢物或代谢改变。例如，存在于肿瘤微环境中的条件是小于7.4的低pH，通常介于或约介于
5.6-6.8,如小于或约或 ρΗ5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7 或 6.8。在另一实例中，存在于肿瘤微环境中的条件是为或约为5mM至20mM的乳酸的高乳酸盐浓度，例如IOmM至20mM的乳酸，如15mM至18mM，并且特别是至少为或至少约为或为16mM、
16.5mM或17mM的乳酸。本文所用的存在于非肿瘤微环境中的条件包括不存在于肿瘤微环境中的一种或多种条件。出于本发明的目的，所述多种或一种条件是存在于肿瘤微环境和非肿瘤环境中，但在所述两种微环境中不同的相应特性或特征，如pH、乳酸盐浓度或丙酮酸盐浓度。存在于非肿瘤微环境中的条件是从约7.0至约7.8的pH，如至少为或约为或为pH7.1,7.2,7.3、7.4、7.5、7.6、7.7 或 7.8(参见例如 US Patent N0.7781405)，在一些实例中为 ρΗ7.4。存在于非肿瘤微环境中的条件是为0.5-5mM乳酸盐的乳酸盐浓度，诸如，例如0.的乳酸，如0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。本文所用的“蛋白的集合”或“抗体的集合”指含有至少10个不同的蛋白和/或其活性部分并且通�：兄辽�50、100、500、1000、IO4UO5或更多个成员的集合。集合通�：写谢钚陨秆〉牡鞍�。包括于集合中的是天然存在的蛋白(或其活性部分)和/或修饰蛋白，特别是抗体变体或其活性片段。修饰包括沿着蛋白长度的随机突变和/或在靶向或所选区域的修饰(即集中的突变)。修饰可以是组合的，并且可以包括通过取代具体基因座或所有基因座或其子集处的所有氨基酸的所有排列。集合可以包括全长或较短的蛋白。集合的大小和具体集合可以由用户确定。在本文中术语集合与术语“文库”交换使用，并表示相同事物。本文所用的“模板蛋白”或“不含有突变的蛋白”指具有用于诱变的氨基酸序列的蛋白。模板蛋白可以是野生型蛋白的序列，或其可以是被进行了其他突变的变异蛋白的序列。本文所用的“选择”或其语法变型，指基于蛋白的一种或多种活性挑选或选择蛋白。选择可以基于蛋白的绝对活性，或者选择可以基于，与在不同条件下的另一蛋白、在不同条件下的相同蛋白或在不同条件下的不同蛋白相比的蛋白相对活性的比较。本文所用的“鉴定”和其语法变型，指识别或了解在期望的条件下具有限定的活性的蛋白。通常，在本发明的方法中，通过蛋白在模拟与非患病或正常生理环境相比的患病环境的条件下优先结合，鉴定所述蛋白。本文所用的为了检测或分离而标记的分子表示，诸如抗体或蛋白的分子与诸如荧光团的可检测标记结合或与标签或其他部分结合，用于例如纯化或分离(isolation)或分开(s印aration)。可检测地标记指为了检测或分离而标记的分子。本文所用的附加表位指对应于表位以促进已附加表位的蛋白或肽的随后生化和免疫学分析的一段短氨基酸残基序列。通过在合适的表达载体中将附加表位的序列添加于蛋白编码序列，可以实现表位附加。可以利用针对标签而产生的高特异性抗体，对已附加表位的蛋白进行亲和纯化。本发明针对反应混合物所用的均相，表示反应物位于液相中，作为混合物，包括作为溶液或悬浮液。本发明针对反应混合物所用的异相,表示反应物位于固相中或位于液相中，作为混合物，包括作为溶液或悬浮液。异相反应混合物的实例是ELISA测定。本文所用的“变异蛋白”、“修饰蛋白”或“突变蛋白”或其变型，指与野生型或模板蛋白相比在一级序列上具有一个或多个修饰的多肽(蛋白)。一个或多个突变可以是一个或多个氨基酸取代(替换)、插 入、缺失、以及其任意组合。修饰蛋白多肽包括具有1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰位置的那些蛋白多肽。修饰蛋白可以是全长蛋白，如全长抗体，或可以是其抗体片段。修饰蛋白与不含有突变的野生型或支架蛋白通常具有 60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列相同性。如本文所用的，提到“重要(critical)氨基酸残基”指当发生改变(例如通过氨基酸取代)时降低或消除蛋白活性的蛋白中的残基。通常，活性降低小于70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或小于不含有改变的或取代的氨基酸的修饰蛋白的活性。如本文所用的，提到“关键(key)残基”指这样的残基，其位于重要氨基酸位置附近或邻近重要氨基酸位置，并且当发生改变(例如通过氨基酸取代)时不产生表现出不期望的或预定的活性或状况，例如在不期望的条件(如PH7.4时，具有活性，但是在pH6.0时无活性)下，蛋白表达降低或无表达或活性降低或无活性。因此，关键残基是表达且表现出期望的活性的残基。本文所用的活性指与全长(完整)蛋白相关的多肽或其部分的功能活性或活性。功能活性包括但不限于生物活性、催化或酶促活性、抗原性(能结合多肽或与多肽竞争与抗多肽抗体的结合的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力以及特异性结合多肽的受体或配体的能力。本文所用的结合活性指分子例如多肽的特征，涉及其是否和如何结合一个或多个结合伴侣。结合活性包括结合结合伴侣的能力、其结合结合伴侣的亲和性(例如高亲和性)、其结合结合伴侣的亲和力、与结合伴侣的键的强度以及与结合伴侣结合的特异性。本文所用的“结合”、“结合的”或其语法变型，指分子参与与另一分子的任何有吸引力的相互作用，从而导致所述两个分子彼此紧密接近的稳定缔合。结合包括但不限于非共价键、共价键(例如可逆和不可逆的共价键)，并包括分子间的相互作用，所述分子包括但不限于蛋白、核酸、碳水化合物、脂质以及小分子，如化学化合物，包括药物在内。键的实例是抗体抗原相互作用和受体配体相互作用。当抗体“结合”特定抗原时，结合指抗体在抗体结合位点通过同源抗体抗原相互作用特异性识别抗原。结合也可以包括通过二硫键相互作用的多肽的多条链如抗体链的缔合。本文针对抗体或其抗原结合片段所用的“特异性结合”或“免疫特异性结合”在本文中交换使用，并指抗体或抗原结合片段与同源抗原通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用形成一个或多个非共价键的能力。通常，免疫特异性结合(或特异性结合)抗原的抗体是以亲和常数Ka约为或为IxiO7M-lOrixiO8M-1或更大(解离常数(Kd)为I X KT7M或I X KT8M或更小)结合抗原的抗体。亲和常数可以利用抗体反应的标准动力学方法来测定，例如免疫测定、表面等离子体共振(SPR) (Rich and Myszka(2000)Curr.0pin.Biotechnolll: 54; Englebienne (1998) Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见例如Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nded.，Raven Press, New York, pages332_336 (1989);有关示例性 SPR 和 ITC 方法的描述还参见U.S.Pat.N0.7，229，619)。实时监测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购获得(例如，BiaCore2OOO, Biacore AB, Upsala, Sweden 和 GE Healthcare LifeSciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。在提到本发明所提供的多肽或抗体时，本文所用的术语“选择性结合(bindselectively) ”或“选择性结合(selectively binds) ”,表示多肽或抗体与表位、抗原或基质结合，而基本上不结合另一表位、抗原或基质。通常，选择性结合所选表位的抗体或其片段，特异性结合表位，且亲和常数Ka为例如约为或为I X IO7W1A X IOl1或更大。本文所用的"亲和性"或"结合亲和性"指抗体分子或其部分结合靶蛋白或抗原上表位的强度。经常利用平衡缔合常数(Ka)或平衡解离常数(Kd)测量亲和性。低亲和性抗体抗原相互作用是弱的，并且分子倾向于快速解离，而高亲和性抗体抗原结合是强的，并且分子保持更长时间的结合。高抗体亲和性表示，抗体特异性结合靶蛋白，并且平衡缔合常数(Ka)大于或等于约IO6M'大于或等于约IO7M'大于或等于约IO8M4或大于或等于约IO9M-1UOiciM-1UO11M-1或IO12M'抗体的特征还以平衡解离常数(Kd)为10_4M、10_6M_10_7M或ιοΛμο,μ'κ^μ或10_12M或更低为特征。通常，具有纳摩尔或或亚纳摩尔解离常数的抗体被视为高亲和性抗体。利用常规技术，例如通过平衡透析，使用BIACore2000仪器、利用制造商所概述的通用程序，通过利用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定或利用本领域技术人员已知的另一方法，可以很容易地测定这类亲和性。例如利用Scatchard et al., AnnN.Y.Acad.ScL, 51:660 (1949)的方法，可以分析亲和性数据。本文所用的“可寻址的”表示，成员是可鉴定的或先天已知的，例如可通过以下来鉴定:通过它们的地址、在诸如微量滴定板孔的空 间阵列中的位置或在固相支持物上的位置，或通过可鉴定的或可检测标记，如通过颜色、荧光、电子信号(即基本上不改变目的分子的相互作用的RF、微波或其他频率)、条形码或其他符号、化学或其他此类标记。本文所用的可寻址阵列是这样的阵列，在所述阵列中，阵列的成员位于固相表面的可鉴定位置，或直接或间接连接于可鉴定标记或与之缔合，如附着于微球体或其他微粒支持物(在本文中也称为珠)，并悬浮于溶液中或散布于表面。本文所用的荧光激活细胞分选术(FACs)指基于荧光鉴定或分选细胞的方法。例如，在FACS中，将细胞染色，以表达一种或多种荧光标记。在这种方法中，使细胞穿过从标记激发荧光并检测荧光的仪器。在检测到细胞的给定光谱部分的荧光后，FACS仪器允许将所述细胞与未表达所述荧光光谱的细胞分开。如本文所用的，提到“细胞表面表达系统”或“细胞表面展示系统”指在细胞表面展示或表达蛋白或其部分。通常，产生表达与细胞表面蛋白融合的目的蛋白的细胞。例如，将蛋白表达为与跨膜结构域的融合蛋白。本文所用的“多聚化结构域”促进多肽分子与一个或多个其他多肽分子稳定相互作用的氨基酸序列，每个多肽分子都含有互补的多聚化结构域，从而与第一结构域形成稳定的多聚体，所述多聚化结构域可以是相同的或不同的多聚化结构域。通常，直接或间接将多肽连接于多聚化结构域。示例性多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区以及相容的蛋白-蛋白相互作用结构域。多聚化结构域，例如可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，诸如，例如IgG的Fe结构域或其部分，包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD和IgM以及其修饰的形式。本文所用的人类蛋白是存在于人类基因组中的核酸分子如DNA所编码的蛋白，包括其所有等位基因变体和保守变异。如果修饰是基于人类蛋白的野生型或突出序列，则蛋白的变体或修饰是人类蛋白。本文所用的天然存在的α氨基酸的残基，是自然界中发现的、在人类中通过带电荷的tRNA分子与其同源mRNA密码子的特异性识别并入蛋白中的20个α氨基酸残基。本文所用的非天然存在的氨基酸指非基因编码的氨基酸。本文所用的核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)和其混合物。核酸可以是单链的或双链的。当涉及诸如用可检测标记如荧光或放射性标记任选地标记的探针或引物时，考虑了单链分子。这类分子的所具有的长度通常使得它们的靶标是统计上独特的或具有低拷贝数(通常小于5，一般小于3)，用于探测或引发文库。通常，探针或引物含有至少14、16或30个与目的基因互补或相同的连续核苷酸序列。探针和引物的长度可以为10、20、30、50、100或更多个核酸。本文所用的肽指长度为2-40个氨基酸的多肽。本文所用的存在于本发明所提供的各种氨基酸序列中的氨基酸，根据它们已知的三字母或一字母(表I)缩写来确定。存在于各种核酸片段中的核苷酸，以本领域通常所用的标准单字母命名法来命名。本文所用的“氨基酸”是含有氨基和羧酸基的有机化合物。多肽含有2个或更多个氨基酸。出于本发明的目的，氨基酸包括20种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸类似物(即α碳具有侧链的氨基酸)。
本文所用的“氨基酸残基”指在其肽连接处化学消化(水解)多肽后所形成的氨基酸。假定本文所述的氨基酸残基采取“L”同分异构型。“D”同分异构型的残基，其根据上述指定，可以被用来取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保留了期望的功能特性。NH2指存在于多肽的氨基末端的游离氨基。COOH指存在于多肽的羧基末端的游离羧基。与J.Biol.Chem.，243:3557-3559(1968)所述的标准多肽命名法一致，并且接受37C.F.R.§ § 1.821-1.822，氨基酸残基的缩写显示于表I中:表1-对应表
权利要求
1.鉴定/选择治疗肿瘤且在低PH下比在中性pH下更具有活性的治疗蛋白的方法，其中: 所述方法包括: a)测试所述蛋白在包括低pH的条件下的活性； b)测试所述蛋白在包括中性pH的条件下的活性； c)将a)中的所述活性与b)中的所述活性进行比较；以及 d)选择/鉴定与b)相比在a)中活性更强的蛋白，由此鉴定在低pH比在高pH更具有活性的蛋白。
2.权利要求1的方法，其中低pH小于7.4。
3.权利要求1或2的方法,其中低pH介于或约介于5.8-6.8。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中中性pH为或约为7.2-7.6。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中中性pH约为或为7.4。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中a)中的所述条件包括选自乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加以及缺氧的一种或多种条件。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中: a)中的所述条件包括选自以下的增加的乳酸盐浓度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少约或16mM、16.5mM或17mM的乳酸；和/或 b)中的所述条件包括选自以下的乳酸盐浓度:0.5-5mM或0.2mM-4mM的乳酸；或为或约为0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
8.鉴定/选择在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中更具有活性的治疗蛋白的方法，其中: 所述方法包括: a)在存在于期望该活性的肿瘤微环境中而非存在于非肿瘤环境中的条件下测试所述蛋白的活性， b)在存在于非肿瘤微环境的条件下，测试所述蛋白的活性， c)将a)中的所述活性与b)中的所述活性进行比较；以及 d)选择/鉴定与b)相比，在a)中活性更强的蛋白，从而鉴定在肿瘤微环境比非肿瘤微环境中更具有活性的蛋白。
9.权利要求8的方法，其中所述非肿瘤微环境是系统微环境。
10.权利要求8或9的方法，其中所述非肿瘤微环境是是健康组织。
11.权利要求8-10任一项的方法，其中所述健康组织是胃肠(GI)道、皮肤、脉管系统、血液或细胞外基质。
12.权利要求8-11任一项的方法，其中除了存在于肿瘤微环境中而非存在于非肿瘤微环境中的一种或多种条件之外，a)和b)中的每一个均在相同的条件下进行。
13.权利要求8-12任一项的方法,其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括选自以下的一种或多种特性:血管形成增加、缺氧、pH降低、乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加、组织间隙液压增加以及标志肿瘤的代谢物或代谢的改变。
14.权利要求8-13任一项的方法，其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括比中性pH低的PH或比非肿瘤微环境pH低的pH。
15.权利要求8-14任一项的方法,其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括低于7.4的pH。
16.权利要求8-15任一项的方法，其中所述肿瘤的pH约为或为5.8-6.8，含5.8和6.8，并且所述存在于肿瘤微环境中的条件包括介于或约介于5.8-6.8的pH。
17.权利要求8-16任一项的方法,其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括与存在于非肿瘤微环境中的条件相比升高的乳酸盐浓度和/或增加的丙酮酸盐浓度。
18.权利要求8-17任一项的方法，其中与b)中的条件相比，a)的所述条件包括比中性低的PH和升高的乳酸浓度。
19.权利要求18的方法，其中所述pH介于5.8-6.8，含5.8和6.8，或5.8-6.5，含5.8和 6.5。
20.权利要求8-19任一项的方法，其中a)中的所述条件包括选自以下的增加的乳酸盐浓度:10mM至20mM的乳酸或15mM-18mM的乳酸；或至少约或16mM、16.5mM或17mM的乳酸；和/或 b)中的所述条件包括选自以下的乳酸盐浓度:0.5-5mM或.0.2mM至4mM的乳酸；或为或约为0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
21.权利要求8-20任一项的方法，其中所述蛋白是治疗肿瘤的治疗蛋白。
22.权利要求1-21任一项的方法，其在体外进行。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分，且所述抗体指的是抗体或其抗原结合片段。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述治疗蛋白是靶受体的配体。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述治疗肿瘤的治疗蛋白是抗肿瘤抗体。
26.权利要求25的方法，其中所述抗肿瘤抗体选自西妥昔单抗(Erbitux )、曲妥珠单抗(Herceptin )、利妥昔单抗(Rituxan , MabThera )、贝伐单抗(Avastin )、阿仑单抗(Campath )、帕尼单抗(Vectibix⑩)、雷珠单抗(Lueentis, 、Ibritumomabλ替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan, Zevaiinli )、托西莫单抗、碘1131托西莫单抗(BEXXAR )、卡妥索单抗(Removab )、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg )、阿贝西普(CTLA4-1g, Orenda )、贝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA)、伊匹单抗(MDX-010, MDX-101)、曲美目单抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010,PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP(CAT-5001)、西妥木单抗(MC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h_R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗 MC-11F8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
27.权利要求25或26的方法，其中所述抗肿瘤抗体是西妥昔单抗(HrbitnxH)..
28.权利要求1-27任一项的方法，其中: 在a)和b)中的每一个中测试多种蛋白； 在a)和b)中测试每一种蛋白；以及 选择与b)相比在a)中活性更强的任何蛋白。
29.权利要求28的方法，其中所述多种蛋白包含治疗蛋白的修饰变体或者是治疗蛋白的修饰变体，并且在a)和b)中的每一个中测试变体的集合。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中所述治疗蛋白包含多聚化结构域。
31.权利要求30的方法，其中所述多聚化结构域包含Fe结构域或修饰的Fe结构域。
32.权利要求1-31任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗体、酶、激素或细胞因子。
33.权利要求32的方法，其中所述治疗蛋白是抗体。
34.权利要求1-33任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗肿瘤抗体。
35.权利要求34的方法，其中所述抗肿瘤抗体选自西妥昔单抗(Erbitux )、曲妥珠单抗(Herceptin )、利妥昔单抗(Rituxan , MabThera⑩)、贝伐单抗(Avastin )、阿仑单抗(Campath )、帕尼单抗(Vectibix )、雷珠单抗(Lucentis )、帕尼单抗、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan, Zevalhl )、托西莫单抗、碘 1131 托西莫单抗(BEXXAR )、卡妥索单抗<Removab )、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotorg_；h阿贝西普(CTLA4-1g, Orencia )、贝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA),伊匹单抗(MDX-010, MDX-101)、曲美目单抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS_050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木单抗(IMC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h_R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗 MC-llF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
36.权利要求29-35任一项的方法，其中所述修饰变体与治疗蛋白的非修饰形式相比含有一个或多个氨基酸残基的氨基酸取代、插入和/或缺失。
37.权利要求1-36任一项的方法，其中测试的所述蛋白是与抗体的非修饰形式相比在互补性决定区(CDR)中包含一个或多个氨基酸取代的变异抗体。
38.权利要求29-37任一项的方法，其中每一变异蛋白与治疗蛋白的非修饰形式相比含有单个氨基酸取代。
39.权利要求29-37任一项的方法，其中每一变异蛋白与治疗抗体的非修饰形式相比含有2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸取代。
40.权利要求29-39任一项的方法，其中: 在所述集合中，在每一改变的位置处的氨基酸，被不同于所述位置处的最初氨基酸的多达1-19种氨基酸取代；且 沿着所述治疗蛋白或其所选部分的长度，取代每一氨基酸。
41.权利要求29-40任一项的方法,其中所述取代氨基酸选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr 以及 Val,前提条件是所述取代氨基酸不同于所述治疗蛋白中相应位置处的氨基酸。
42.权利要求29-41任一项的方法，其中组氨酸是取代氨基酸或所述蛋白中的组氨酸被非碱性或非带电荷氨基酸取代。
43.权利要求29-42任一项的方法，其中所述修饰包括用选自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的氨基酸进行氨基酸取代。
44.权利要求29-43任一项的方法，其中所述修饰包括用His进行氨基酸取代。
45.权利要求29-44任一项的方法，其中所述蛋白是抗体，且修饰的所选部分是CDR。
46.权利要求29-45任一项的方法，其中单独测试所述集合中的每一变异蛋白。
47.权利要求29-46任一项的方法，其中在阵列中测试每一变异蛋白。
48.权利要求29-46任一项的方法，其中所测试的每一变异蛋白是可寻址的。
49.权利要求1-48任一项的方法，其中所测试的活性是与所述治疗蛋白的靶蛋白的结合。
50.权利要求49的方法，其中所述结合通过免疫测定评估。
51.权利要求49或50的方法，其中所述免疫测定包括ELISA。
52.权利要求50或51的方法，其中所述免疫测定是异相的，包括: 将所述靶蛋白固定于固相支持物； 使所述治疗蛋白与所述靶蛋白接触，其中所述治疗蛋白被可检测地标记； 除去未结合的治疗蛋白；以及 检测或测量所述标记的治疗蛋白与所述靶蛋白的结合。
53.权利要求50或51的方法，其中所述免疫测定是均相的，包括: 使所述治疗蛋白与革巴蛋白接触，其中所述治疗蛋白被可检测地标记；和 检测或测量所述标记的治疗蛋白与所述靶蛋白的结合。
54.权利要求1-53任一项的方法,其中利用包含在表面表达治疗蛋白的一种或多种细胞的细胞表面表达系统评估结合活性。
55.权利要求54的方法，其中: 在所述细胞的表面表达治疗蛋白； 使靶蛋白与所述细胞的群接触；以及 鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，由此鉴定表现出结合活性的治疗蛋白。
56.权利要求55的方法，其中所述靶蛋白被可检测地标记或可被检测。
57.权利要求56的方法，其中以荧光标记所述靶蛋白或利用荧光标记的第二试剂检测所述靶蛋白。
58.权利要求49-57任一项的方法，其中通过荧光激活细胞分选术(FACS)检测或测量所述结合。
59.权利要求1-58任一项的方法，其中 首先在条件b)下利用包含表达治疗蛋白的细胞的细胞表面表达系统测试结合活性，由此选择结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，并且选择不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞； 分离所选的不结合所述靶蛋白的所述一种或多种细胞并使其于细胞培养基中生长，以产生在表面表达所述治疗蛋白的第二细胞群； 在a)条件下测试结合活性，由此使来自所述第二细胞群的细胞与所述靶蛋白接触；以及 鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，从而鉴定在a)条件而非b)条件下表现出结合活性的治疗蛋白
60.权利要求1-58任一项的方法，其中 首先在a)条件下利用包含表达治疗蛋白的细胞群的细胞表面表达系统测试结合活性，由此选择结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，并选择不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞； 分离所选的结合所述靶蛋白的所述一种或多种细胞，并使其生长于细胞培养基中，以产生第二细胞群； 在b)条件下测试结合或，由此使来自所述第二细胞群的细胞与所述靶蛋白接触；以及 鉴定不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，并鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞， 选择不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，由此鉴定表现出结合活性的治疗蛋白。
61.权利要求1-60任一项的方法，其中将所述治疗蛋白给予个体伴随一种或多种不良副作用。
62.权利要求61的方法，其中与a)相比在b)中降低所述蛋白的活性改善或防止所述不良副作用。
63.权利要求1-62任一项的方法，其中在存在人血清的情况下，在a)和b)中测试所述治疗蛋白的活性。
64.权利要求1-63任一项的方法，其中 在存在人血清的情况下在a)和b)中测试所述治疗蛋白的活性，所述人血清的量是存在于生理环境中的量；和 在a)中的所述血清浓度等于在b)中的所述血清浓度。
65.权利要求1-64任一项的方法,其中，按体积计,在存在选自至少介于或约介于以下浓度的人血清的情况下，进行a)和b):3%-30%,含3%和30% ;5%_30%，含5%和30% ;5%_25%，含 5% 和 25% ； 10%-30%，含 10% 和 30% ；15%-30%,含 15% 和 30% ；以及 15%_25%，含 15% 和 25%。
66.权利要求65的方法，其中所述人血清的浓度按体积计为或约为25%(加减10%)或15%-35%。
67.权利要求1-66任一项的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是结合配体的受体或其部分。
68.权利要求67的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是受体，所述受体是肿瘤抗原。
69.权利要求68的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是Her受体家族的成员。
70.权利要求69的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是EGFR受体或其细胞外结构域。
71.权利要求1-70任一项的方法，其中a)中的所述活性以预定量或比例高于b)中的所述活性。
72.权利要求71的方法，其中所述活性高出的比例为或至少为1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、.1.7、1.8、1.9,2.0、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50 或更闻。
73.权利要求1-72任一项的方法，其中在a)中的所述活性比在b)中的所述活性高至少 5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍或更多。
74.权利要求1-73任一项的方法，其中给予所述抗肿瘤抗体伴随一种或多种不良副作用。
75.权利要求74的方法，其中所述抗体是抗EGFR抗体或抗CTLA4抗体。
76.权利要求1-75任一项的方法，其以高通量模式进行。
77.权利要求1-76任一项的方法，其中所述方法是自动化的。
78.权利要求1-77任一项的方法，其中所选的蛋白是条件活性的，从而其在肿瘤微环境中与在非肿瘤环境中相比具有更强的活性。
79.权利要求1-78任一项的方法，将其重复多次，其中在每一重复中，产生所选的一种或多种蛋白的其他变体并对其进行测试，由此使所述治疗蛋白发展为在肿瘤环境中比在非肿瘤环境中表现出增强的活性，从而表现出降低的毒性或降低的不良副作用。
80.权利要求61-79任一项的方法，其中所选治疗蛋白是抗EGFR抗体，且所述降低的不良副作用包括降低的与抗体的系统暴露有关的皮肤毒性。
81.权利要求1-80任一项的方法，其中所述所选的蛋白是抗EGFR抗体变体，与在b)正常生理pH7.3-7.4和低于12mM的正常乳酸盐浓度的条件下相比，其在5.8-6.8的降低的pH和乳酸盐浓度约为12-20mM的肿瘤微环境内的条件下，优先结合EGFR。
82.权利要求1-81任一项的方法，其中: 在步骤a)-d)之前，所述方法包括 e)使第一固相支持物和第二副本固相支持物与EGFR或EGFR细胞外结构域(ECD)在PH为或约为pH7.4的缓冲液中接触； f)用PH为或约为pH7.4的缓冲液洗涤所述第一支和第二支持物； g)将包含25%或约25%人血清的缓冲液添加于所述第一和第二固相支持物；其中: i)添加于所述第一固相支持物的所述缓冲液的条件包括pH为或约为6.0的12-20mM的乳酸；和 )添加于所述第二固相支持物的所述缓冲液的条件包括ImM或约的ImM的乳酸，pH为或约为7.4 ； h)从所述固相支持物除去在步骤c)中添加的所述缓冲液；和 在进行步骤e)-h)后，进行步骤a)-d)，其中: 步骤a)包括: 将可检测标记的修饰的抗EGFR抗体添加于pH6.0的、包含12_20mM乳酸、25%人血清的结合缓冲液中的第一支持物； 用PH为或约为6.0的包含12-20mM乳酸的缓冲液洗涤所述第一支持物；以及将检测结合的修饰的抗EGFR的试剂添加于所述第一固相支持物，并检测所述修饰蛋白与所述EGFR或EGFR E⑶在所述第一固相支持物上的结合；和步骤b)包括: 将可检测标记的修饰的抗EGFR抗体添加于pH7.4的包含ImM乳酸、25%人血清的结合缓冲液中的第二支持物； 用PH为或约为7.4的包含ImM或约ImM的乳酸的缓冲液洗涤所述第二支持物；以及将检测结合的修饰的抗EGFR的试剂添加于所述第二固相支持物，并检测所述修饰蛋白与所述EGFR或EGFR E⑶在所述第二固相支持物上的结合。
83.权利要求82的方法，其中所述抗EGFR抗体含有FLAG标签，以便用抗FLAG-TAG酶试剂进行检测。
84.权利要求82或83的方法，其中检测结合包括分光光度法测量。
85.鉴定/选择在第一组条件下比在第二组条件下更具有活性的治疗蛋白的方法，其中:所述第一组条件包括与非肿瘤微环境相比存在于肿瘤微环境中的选自以下条件中的一种或多种条件:低pH、乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加以及缺氧；和 第二组条件包括存在于所述非肿瘤微环境中的相应条件；和 所述方法包括: a)在所述第一组和第二组条件下，测试多种蛋白的活性；其中: 所述多种蛋白包含治疗蛋白的修饰变体或所述多种蛋白是治疗蛋白的修饰变体；和 在所述第一和第二组条件中的每一组条件下测试变体的第一集合； b)选择/鉴定以下蛋白: 与所述非修饰的治疗蛋白相比，在所述第一组条件下活性降低的蛋白；和 与所述非修饰的治疗蛋白相比，在所述第二组条件下活性降低的蛋白； c)分析在步骤在b)中选择/鉴定的蛋白，以鉴定受到修饰的氨基酸位置，由此所述氨基酸被鉴定为重要氨基酸位置； d)产生包含取代氨基酸对邻近重要氨基酸位置或其附近的氨基酸残基的取代的变异蛋白的第二集合，其中所述文库的每一成员与所述治疗蛋白相比包含单氨基酸取代； e)在所述第一组条件下和在所述第二组条件下测试所述修饰蛋白第二集合成员的活性；和选择/鉴定所述第二集合中表现出高于或约等于所述第二组条件下的活性的成员； f)分析在e)中选择/鉴定的蛋白，以鉴定被取代的氨基酸位置，其中所鉴定的位置被称为关键残基位置； g)产生变异蛋白的第三集合；其中每一成员都包含取代氨基酸对一个或多个关键残基位置的取代； h)在所述第一组条件下和在所述第二组条件下，测试组合文库成员的活性，并选择/鉴定所述第二文库中在所述第一组条件下比在所述第二组条件下具有更强活性的成员，由此鉴定在所述第一组条件下比在所述第二组条件下更具有活性的治疗蛋白。
86.权利要求85的方法，其中步骤h)包括: 1)在所述第一组条件下测试所述第三集合成员的活性，并选择/鉴定所具有的活性高于预定活性蛋白；和 2)在所述第二组条件下测试在步骤I)中选择/鉴定的蛋白的活性，并选择/鉴定所具有的活性低于预定活性的蛋白。
87.权利要求85的方法，其中步骤h)包括: 1)在所述第二组条件下测试所述第三集合文库成员的活性，并选择/鉴定所具有的活性低于预定活性的蛋白；和 2)在所述第一组条件下测试在步骤I)中选择/鉴定的蛋白的活性，并选择/鉴定所具有的活性高于预定活性的蛋白。
88.权利要求85-87任一项的方法，其中将步骤g)重复多次，其中在每一重复中，测试选择/鉴定的蛋白。
89.权利要求88的方法，其中将步骤g)重复1、2、3或4次。
90.权利要求85-89任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分，并且所述抗体指抗体或其抗原结合片段。
91.权利要求85-90任一项的方法，其中所述治疗蛋白是靶受体的配体。
92.权利要求85-91任一项的方法，其中所述治疗蛋白是治疗肿瘤的蛋白。
93.权利要求92的方法，其中所述治疗肿瘤的蛋白是抗肿瘤抗体。
94.权利要求93的方法，其中所述抗肿瘤抗体选自西妥昔单抗(Erbitux )、曲妥珠单抗(Herceptin_、利妥昔单抗(Rituxan , MabThera )、贝伐单抗(Avastin )、阿仑单抗(Campath )、帕尼单抗(Vectibix )、雷珠单抗(Lueentis_、帕尼单抗、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan, Zevalin )、托西莫单抗、碘1131托西莫单抗(BEXXAR )、卡妥索单抗(Removab )、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg )、阿贝西普(CTLA4-1g, Orencia ),贝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y；LEA)、伊匹单抗(MDX-010, MDX-1OI)、曲美目单抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP(CAT-5001)、西妥木单抗(MC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h_R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗 MC-11F8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
95.权利要求93或94的方法，其中所述抗肿瘤抗体是西妥昔单抗(ErbltUX )。
96.权利要求85-95任一项的方法，其中所测试的活性是与靶蛋白的结合。
97.权利要求96的方法，其中通过免疫测定测试结合活性。
98.权利要求97的方法，其中所述免疫测定包括ELISA。
99.权利要求85-98任一项的方法，其中在基于细胞的测定中测试结合活性。
100.权利要求85-99任一项的方法，其中在细胞表面表达系统中测试结合活性。
101.权利要求85-100任一项的方法，其中: 将所述第二文库的成员表达于细胞表面； 使靶蛋白与所述细胞的群接触；以及 鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，由此鉴定表现出结合活性的蛋白。
102.权利要求99-101任一项的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
103.权利要求99-102任一项的方法，其中所述基于细胞的测定是荧光激活细胞分选术(FACS)。
104.权利要求96-103任一项的方法，其中所述靶蛋白被可检测地标记或是可以检测的。
105.权利要求96-104任一项的方法,其中所述祀蛋白被突光标记或通过突光标记的第二试剂检测所述靶蛋白。
106.权利要求96-105任一项的方法，其中通过荧光激活细胞分选术(FACS)检测或测量结合。
107.权利要求96-106任一项的方法，其中所述靶蛋白是Her受体家族的成员。
108.权利要求96-107任一项的方法，其中所述靶蛋白是EGFR受体或其细胞外结构域。
109.权利要求85-108任一项的方法，其中: 所述第一组条件包括低于7.4的低pH ;和 重要氨基酸选自包含由带电荷残基组成的氨基酸取代的蛋白变体。
110.权利要求109的方法,其中所述带电荷残基选自Arg、Asp、Glu、His以及Lys。
111.权利要求85-110任一项的方法，其中所述第二和第三集合中的氨基酸取代是用His进行的氨基酸取代。
112.权利要求85-111任一项的方法，其中所述第一组条件包括pH约为或为5.8-6.8、含 5.8 和 6.8。
113.权利要求85-112任一项的方法，其中与所述第二组条件相比，所述第一组条件包括比中性pH低的pH和升高的乳酸浓度。
114.权利要求85-113任一项的方法，其中: 所述第一组条件包括约12-20mM的乳酸，pH为6.0或约为6.0 ;和 所述第二组条件包括ImM或约ImM的乳酸，pH7.4为或约为7.4。
全文摘要
本发明提供发展或选择不良副作用降低的治疗蛋白的方法和所得的蛋白。例如，本发明提供鉴定在一体内环境中比在另一体内环境中表现出更好的活性的条件活性治疗蛋白的体外测定法。所述方法包括以下步骤a)在期望该活性正常或增强的条件下测试蛋白的活性；b)在期望与正常活性相比活性降低的条件下测试所述蛋白的活性；以及c)将在a)中的活性与b)进行比较，并选择/鉴定与b)相比活性更强的蛋白。选择/鉴定的蛋白即为条件活性蛋白。
文档编号G01N33/68GK103201293SQ201180053564
公开日2013年7月10日 申请日期2011年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者L·科达达帕尼, L·H·布克班德, G·I·弗罗斯特, P·L·谢里登, H·M·谢泼德, G·卫, L·黄 申请人:哈洛齐梅公司
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