专利名称：果糖定量检测试剂盒及其用途和精浆果糖定量检测方法
技术领域：
本发明涉及果糖定量检测试剂盒及其用途，以及涉及利用这种试剂盒体外检测人 体精浆标本中精浆果糖浓度的方法。
背景技术：
男性双侧射精管梗阻、先天性精囊缺如或发良不良，果糖测定为阴性。精囊炎、不 完全射精或射精过频时，果糖含量降低。果糖结合其它检测指标(如精浆中性α-葡糖苷 酶)，可对梗阻性无精子症患者梗阻部位进行定位。精浆果糖是精囊分泌功能的评价功能指 标。睾酮的水平影响精囊果糖的分泌，雄激素不足可造成果糖含量降低。精囊分泌功能降 低可导致精液量降低。精囊分泌的果糖是精子能量的主要来源，精液中果糖量减少时可导 致精子供能不足而影响活动力。目前在实验室对精浆进行定量测量的方法有吲哚显色法、 间苯二酚显色法、酶法等。吲哚法为世界卫生组织推荐的方法学，但操作过程中需使用到浓 盐酸，对操作者、环境产生�：Γ患浔蕉臃槊舳鹊停枋褂玫脚ㄑ嗡幔圆僮髡摺⒒肪巢� 生�：Γ以�90°C温育显色，临床使用不方便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种方法学特异、能实现手工操作和自动化批量 检测、清洁环保、且操作简单、易于临床推广应用的果糖定量检测试剂盒，同时，本发明还提 供其用途，以及一种利用该试剂盒的性能稳定、特异性强、能实现手工操作和自动化批量检 测、便于临床常规应用推广的人体精浆标本中果糖浓度的检测方法。为解决上述技术问题，本发明提供一种果糖定量检测试剂盒，其特征在于，包括去 蛋白液A、去蛋白液B、果糖校准液、试剂1、试剂2、试剂3;所述去蛋白液A为将待测标本中 蛋白质变性、沉淀的浓度为0. 001 lmol/L的无机酸溶液；所述去蛋白液B为中和去蛋白 液A的酸性的浓度为0. 001 lmol/L的无机碱溶液；所述果糖校准液为已知浓度的果糖 校准液；所述试剂1为含0. 001 0. lmol/L腺嘌呤核苷三磷酸钠盐、1 20克/L氯化钠 的缓冲液或该溶液制成的冻干粉；试剂2为含1 100KU/L已糖激酶、1 100KU/L葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶的缓冲液或该溶液制成的冻干粉；试剂3为含0. 001 0. lmol/L烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸的缓冲液或该溶液制成的冻干粉。所述去蛋白液A为硫酸溶液或盐酸溶液或碳酸溶液或硼酸溶液或硝酸溶液或其 中至少两种的混合溶液；所述去蛋白液B为氢氧根盐溶液或碳酸根盐溶液或碳酸氢根盐溶 液或铵根盐溶液或其中至少两种的混合溶液；所述果糖校准液为已知浓度为2 lOmmol/L 的果糖溶液。所述试剂1为冻干粉，所述试剂盒还包括试剂1溶解液，所述试剂1溶解液为 PH6 7、浓度为0. 01 lmol/L的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或碳酸盐缓冲或醋酸盐缓 冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。所述试剂1中腺嘌呤核苷三磷酸钠盐的浓度为0. 01mol/L ；所述试剂2中已糖激酶浓度为10KU/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶浓度为10KU/L ；所述试剂3中的，烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸的浓度为0. 01mol/Lo所述试剂盒中还包括微孔板条。所述果糖定量检测试剂盒，用于血清或血浆或体液或食品或固形物提取液内的果 糖浓度定量测定。同时，本发明所述的果糖定量检测试剂盒进行精浆果糖定量检测的方法，其特征 在于，包括如下步骤1)分别取去蛋白精浆和已知浓度的果糖校准液，分别加入试剂1，混勻，其中，试 剂1与去蛋白精浆标本的体积比为10 100 ；2)在上述液体内分别加入试剂2，混勻，其中，试剂2与去蛋白精浆标本的体积比 为0. 5 10 ；3)在10 40°C温度下反应5 120分钟后，在280 380nm波长下读取并记录 各自的第一次吸光度；4)在上述液体内再加入试剂3，混勻，其中，试剂3与去蛋白精浆标本的体积比为 0. 1 10 ；5)在10 40°C温度下反应5 120分钟后，在280 380nm波长下读取并记录 各自的第二次吸光度；6)分别以各自的第二次吸光度减去第一次吸光度，为精浆标本中果糖参与反应的 吸光度ΔΑ^^和果糖校准液中果糖参与反应的吸光度ΔΑβ ι;7)将精浆标本与果糖校准液的吸光度相比较或计算，得出精浆果糖浓度Cfe^当所述步骤1)中只有一种浓度Cfe*的所述果糖校准液，则所述步骤7)中按照如 下公式计算精浆果糖浓度，C标本=ΔA标本+ ΔA校准XC校准X标本稀释倍数；当所述步骤1)中所述果糖校准液有多种不同浓度分别检测，则所述步骤7)中将 分别检测不同浓度的果糖校准液得到的△々《 |拟合成校准曲线，读取AAfe^的值在校准曲 线上对应的浓度值并乘以标本的稀释倍数，即为精浆果糖浓度Cfe* ；所述步骤幻和步骤幻中在37°C温度下反应15分钟，在340nm波长下读取吸光 度。所述步骤1)之前还包括精浆标本去蛋白步骤a)在待检精浆标本中加入去蛋白液A，混勻，用量为0. 0004mol/L 20mol/L无机 酸/ml精浆；b)再在步骤a)得到的上述液体内加入去蛋白液B，混勻，用量为0.0002mmol 8mmol无机碱/ml精浆；c)室温静置后取得上清液即为步骤1)所述的去蛋白精浆。所述步骤a)中待检精浆标本与去蛋白液A的体积比为5 2 1 10 ；所述待 检精浆标本与去蛋白液B的体积比为5 1 1 4。本发明为酶法检验，所述的试剂1、试剂2、试剂3为含已糖激酶、葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶、腺嘌呤核苷三磷酸钠盐(ATP钠盐)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的缓冲液，检验 原理是已糖激酶能分解果糖为果糖-6-磷酸，后者可变构为葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸和NAD+生成NADH，NADH在340nm处有最大吸收峰，通过监测340nm波长处NADH的吸光度值，可检测出标本中果糖的浓度。本发明酶法试剂配方环保，操 作简单，灵敏度高，特异性强，适合临床使用，突出的技术效果在于1、本试剂采用工具酶，使酶促反应形成NADH产物，NADH可通过分析仪直接检测， 清洁环保，克服以往果糖检测试剂需直接使用强酸的弱点。2、增加了精浆去蛋白步骤，除掉了会引起非特异性反应的蛋白类干扰物；采用二 点法，第一次孵育可除去精浆标本内其他能导致非特异性吸光度变化的影响因素，使检测 更加特异。3、待测精浆果糖与果糖校准液同步反应，避免因实验条件波动导致检测错误，增 强的检测的准确性。4、由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定、无需特殊检测仪器，便于临床常规 应用与推广。
具体实施例方式实施例1一、制备本实施例1的果糖定量检测试剂盒1.配制去蛋白液A 1)称取硼酸6. 183克，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至 1L，混勻后保存。(硼酸浓度为0. lmol/L。)2.配制去蛋白液B:称取氢氧化钠4克，置于烧杯内，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至 1L，混勻后保存。(氢氧化钠浓度为0. lmol/L。)3.配制试剂1 (1)称取12水磷酸氢二钠17. 728克，磷酸二氢钾6. 94克，加入适量纯化水搅拌溶 解后，在PH计监测下，用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整pH值至6 7，得到本实施例1的磷 酸盐缓冲液。(磷酸盐浓度为0. lmol/L。)(2)称取ATP钠盐6. 0519克，氯化钠9克，加入适量的步骤(1)配制的磷酸盐缓冲 液搅拌溶解后，用磷酸盐缓冲液定容至1L。(ATP钠盐浓度为0. 01mmol/L,氯化钠浓度为9
克/L。)(3)将步骤(2)配制的溶液分装至小瓶，放真空冷冻干燥机内真空冷冻干燥成冻 干粉。4.配制试剂1冻干粉的溶解液配制方法与步骤3(1)相同。5.配制试剂2 称取已糖激酶10KU、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶10KU，加入适量的步骤幻配制的磷酸 盐缓冲液搅拌溶解后，用磷酸盐缓冲液定容至1L。6.配制试剂3 称取烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 7. 434克，加入适量的步骤3(1)配制的磷酸盐 缓冲液搅拌溶解后，用磷酸盐缓冲液定容至1L。(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0. Olmol/ L0 )
7.配制5mmol/L的果糖校准液称取果糖0. 9008g，加入适量纯化水搅拌溶解后，用纯化水定容至1L，混勻后保存。8.准备8孔/条的微孔板条共20条，购于深圳市金灿华实业有限公司，产品型号 106-002。从以上步骤可进一步量取、封装得到本实施例1的试剂盒
去蛋白液A1 瓶 ianl
去蛋白液B1 瓶 5ml
试剂1 (Rl)2瓶冻干粉(使用时6ml/瓶的溶解液复溶)
试剂1溶解液1瓶12. 5ml
试剂2(R2)1瓶0. 6ml
试剂3(R3)1瓶0. 3ml
果糖校准液1瓶4ml5mmol/L
微孔板条20条8孔/条二、用上述试剂盒进行精浆果糖定量检测(一 )标本准备1.受试者禁欲2-7天后，通过手淫法(或用特制的精液采集套以性交方式)留取 全部精液标本，记录受检者一次射精的精液总量为2. 3ml。新鲜精液标本完全液化后，3000g 离心10分钟，留取精浆，待检测(或将精浆置于-20°C储存也可。勿反复冻融标本。)2.检测前将待测精浆去蛋白在微型离心管(Eppendorf管)中，加入精浆50μ 1 和去蛋白液A 250μ 1，混勻，再加入去蛋白液B 100 μ 1，混勻，室温静置IOmin后，取上清液 作为待检精浆标本，这时精浆标本1 8稀释。其中去蛋白液A用量为0.5mmol无机酸/ml 精浆；去蛋白液B用量为0. 2mmol无机碱/ml精浆。( 二)试剂准备每瓶试剂1冻干粉加6ml试剂1溶解液溶解，蔽光保存。溶解后的试剂1 (Rl)，4°C 保存可使用1周，-20°C保存可用至试剂盒有效期限(勿反复冻融)。(三)校准品准备在3个试管中，将本实施例1试剂盒中的5mmol/L果糖校准液以纯化水连续对 倍稀释为2. 5mmol/L、l. 25mmol/L和0. 625mmol/L三个浓度，以纯化水作为Ommol/L校 准液，因此得到5个不同浓度的果糖校准液，以便以5mmol/L、2. 5mmol/L、1. 25mmol/L、 0. 625mmol/L和Ommol/L的5个校准品的检验数据拟合标谁曲线。稀释方法如下分别在 3个试管中加入纯化水150 μ 1，在第1管内加入5mmol/L果糖校准液150 μ 1，混勻后将第1 管内的液体150 μ 1转移至第2管，混勻后将第2管内的液体150 μ 1转移至第3管，这3个 试管中的果糖校准液浓度依次为2. 5mmol/L、l. 25mmol/L、0. 625mmol/L。(四)检测表一
权利要求
1.一种果糖定量检测试剂盒，其特征在于，包括去蛋白液A、去蛋白液B、果糖校准液、 试剂1、试剂2、试剂3 ；所述去蛋白液A为将待测标本中蛋白质变性、沉淀的浓度为0. 001 lmol/L的无机酸溶液；所述去蛋白液B为中和去蛋白液A的酸性的浓度为0. 001 lmol/ L的无机碱溶液；所述果糖校准液为已知浓度的果糖校准液；所述试剂1为含0. 001 0. lmol/L腺嘌呤核苷三磷酸钠盐、1 20克/L氯化钠的缓冲液或该溶液制成的冻干粉；试 剂2为含1 100KU/L已糖激酶、1 100KU/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的缓冲液或该溶液制 成的冻干粉；试剂3为含0. 001 0. lmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的缓冲液或该溶液制成 的冻干粉。
2.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述去蛋白液A为硫酸溶 液或盐酸溶液或碳酸溶液或硼酸溶液或硝酸溶液或其中至少两种的混合溶液；所述去蛋白 液B为氢氧根盐溶液或碳酸根盐溶液或碳酸氢根盐溶液或铵根盐溶液或其中至少两种的 混合溶液；所述果糖校准液为已知浓度为2 lOmmol/L的果糖溶液。
3.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1为冻干粉，所 述试剂盒还包括试剂1溶解液，所述试剂1溶解液为pH6 7、浓度为0. 01 lmol/L的磷 酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或碳酸盐缓冲或醋酸盐缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液 或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
4.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1中腺嘌呤核苷 三磷酸钠盐的浓度为0. 01mol/L ；所述试剂2中已糖激酶浓度为10KU/L，葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶浓度为10KU/L ；所述试剂3中的，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0. 01mol/Lo
5.根据权利要求1所述的果糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括微 孔板条。
6.权利要求1-5任一项所述的果糖定量检测试剂盒，用于血清或血浆或体液或食品或 固形物提取液内的果糖浓度定量测定。
7.利用权利要求1-5任一项所述的果糖定量检测试剂盒进行精浆果糖定量检测的方 法，其特征在于，包括如下步骤1)分别取去蛋白精浆和已知浓度的果糖校准液，分别加入试剂1，混勻，其中，试剂1与 去蛋白精浆标本的体积比为10 100 ；2)在上述液体内分别加入试剂2，混勻，其中，试剂2与去蛋白精浆标本的体积比为 0. 5 10 ；3)在10 40°C温度下反应5 120分钟后，在观0 380nm波长下读取并记录各自 的第一次吸光度；4)在上述液体内再加入试剂3，混勻，其中，试剂3与去蛋白精浆标本的体积比为 0. 1 10 ；5)在10 40°C温度下反应5 120分钟后，在观0 380nm波长下读取并记录各自 的第二次吸光度；6)分别以各自的第二次吸光度减去第一次吸光度，为精浆标本中果糖参与反应的吸光 度AAfe^和果糖校准液中果糖参与反应的吸光度ΔΑβ ι;7)将精浆标本与果糖校准液的吸光度相比较或计算，得出精浆果糖浓度Cfe^
8.根据权利要求7所述的精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，当所述步骤1)中只有一种浓度Cfe*的所述果糖校准液，则所述步骤7)中按照如下公式计算精浆果糖浓度，Cfe当所述步骤1)中所述果糖校准液有多种不同浓度分别检测，则所述步骤7)中将分别 检测不同浓度的果糖校准液得到的△々《 |拟合成校准曲线，读取AAfe^的值在校准曲线上 对应的浓度值并乘以标本的稀释倍数，即为精浆果糖浓度Cfe* ；所述步骤3)和步骤5)中在37°C温度下反应15分钟，在340nm波长下读取吸光度。
9.根据权利要求7所述的精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，所述步骤1)之前还 包括精浆标本去蛋白步骤a)在待检精浆标本中加入去蛋白液A，混勻，用量为0.0004mol/L 20mol/L无机酸/ ml精浆；b)再在步骤a)得到的上述液体内加入去蛋白液B，混勻，用量为0.0002mmol 8mmol 无机碱/ml精浆；c)室温静置后取得上清液即为步骤1)所述的去蛋白精浆。
10.根据权利要求9所述的精浆果糖定量检测的方法，其特征在于，所述步骤a)中待检 精浆标本与去蛋白液A的体积比为5 2 1 10;所述待检精浆标本与去蛋白液B的体 积比为5 1 1 4。
全文摘要
果糖定量检测试剂盒，含去无机酸蛋白液A、无机碱去蛋白液B、果糖校准液、含0.001～0.1mol/L腺嘌呤核苷三磷酸钠盐的试剂1、含1～100KU/L已糖激酶、1～100KU/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂2、含0.001～0.1mol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的试剂3。检测精浆果糖去蛋白精浆和果糖校准液中分别加入试剂1、试剂2混匀；在10～40℃温度下反应5～120分钟后，280～400nm波长下分别读取吸光度；再分别加入试剂3混匀；同样反应并读取吸光度；计算前后吸光度之差，将精浆标本与果糖校准液的吸光度相比较或计算，可得精浆果糖浓度。该试剂盒和方法可用于血清、血浆、体液、食品、固形物提取液内的果糖定量测定，方法学特异、清洁环保、能实现手工操作和自动化批量检测、易于临床推广应用。
文档编号G01N21/31GK102061332SQ201010536768
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者庄学敏, 李巍, 杨红芳, 王希上, 王铮铮, 程锦军, 邓少君, 钟彩颜 申请人:深圳市博锐德生物科技有限公司
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