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专利名称：用于膜电位测定的光遗传学探针的制作方法
技术领域：
本发明的领域是涉及用于光学测定磷脂双层间电位的方法，构建体和组合物。
背景技术：
附膜的生物结构可承受膜内外电压差。这种电压，又被称为膜电位，具有多种生物功能，包括传送信息(例如，在神经元中)，在产生ATP中作为媒介物(例如，在细菌和线粒体中)，为鞭毛电机提供动力(例如，在细菌中)和控制营养素、毒素和信号分子的跨膜运输(在细菌和真核细胞中)。尽管膜电位具有重要的的生物学作用，膜电位的测定还是非常困难的。电生理学是通过在膜两侧放置电极来直接记录电位差。电生理学实验设定慢，每次仅能测定一个或少数几个细胞，不能进入深层组织(例如，体内)，不能作用于微小细胞(例如，细菌)、坚固细胞壁包围的细胞(例如，酵母)或活动的细胞(例如，精子)，不能应用于长期测定，并且在测定中常会损坏或杀死细胞。因此，需要开发膜电位的新型测定方法。

发明内容
本文描述的方法是使用细菌视紫红质作为光学传感器来检测磷脂层间的电压。我们已经发现该新系统可以光学测定细胞的膜电位或细胞腔隙的结合膜电位，如细胞内的细胞器、人造细胞或其他类脂膜结合结构。该方法包括在细胞或细胞器上表达细菌视紫红质，将细胞暴露于光源下和检测细菌视紫红质发射出的荧光，其中通过发射的荧光强度反应膜电位。该方法无需使用电极就可以测定膜电位。该方法可进一步监测一个或多个外部刺激引起的细胞膜电位变化。这不仅有利于科研，并且，例如，在筛选影响膜电压能力的候选试剂中也是很重要的，例如，在药物筛选中。本发明还提供表达细菌视紫红质和修饰的细菌视紫红质的细胞，和编码修饰的古细菌视紫红质的核酸构建体，其在真核细胞中测定膜电位及其变化是有用的。在一些具体实施方式
中，在此描述的光学传感器使其内源性离子泵活性下降，或相比于天然细菌视紫红质蛋白质，部分或全部活性得以抑制。这样光学感受器可测定电压，但通过构建的离子梯度不能参与改变电压。电压及其变化的检测能够可视化，并且使用光学系统及进行测定。本发明是基于，至少部分上是基于下述发现，该发现是细菌视紫红质蛋白如古细菌视紫红质或变形菌视紫红质以及其修饰的变型，具有降低的离子泵活性(与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比)，能够被用作光学传感器在细胞内检测跨膜电压。也就是说，细菌视紫红质和修饰的细菌视紫红质蛋白可用于测定细胞的膜电位以及膜电位的变化。该构建体和方法也可用于组织和器官的体内成像，例如在斑马鱼上，由于电极尺寸的限制其不能用于研究。这不仅有利于科研，而且在筛选新型候选试剂在影响细胞的膜电压能力也是很重要的。我们已经开发了变形菌视紫红质光学质子传感器(PROPS)，其主要作用于细菌细胞，以及基于古细菌视紫红质的荧光电压指示蛋白(VIPs)家族，其也作用于哺乳动物细胞，包括神经元和人类干细胞源性的心肌细胞。VIPs是以来自于古细菌视紫红质3 (Arch)及其同系物的电压指示器为基础。这些蛋白以亚毫秒时间分辨率和亚微米空间分辨率指示电动力学。利用VIPs，我们通过在哺乳动物细胞和组织使用电动力学的光学检测表明非接触、高通量和高含量的测定方法。本文描述的光学传感器不受电极使用的限制，使电生理学研究可以在例如亚细胞区室中(例如，线粒体)或在小细胞中(例如，细菌)中进行。在此描述的光学传感器可用于药物筛选中，装置研究，以及真核和原核细胞电压变化的体内、体外成像中。我们描述电压指示器蛋白和表达此蛋白的构建体。该构建体具有任意的细胞型的特异性启动子，当细胞分化时启动子开启，例如，分化为神经元细胞，如神经元，或分化为心肌细胞，例如心肌细胞，浦肯野细胞或窦状细胞。该构建体可进一步包括靶信号如线粒体靶信号，其针对在所需膜位置的电压指示器蛋白。我们提供细胞，以及瞬时和稳定表达这些蛋白的细胞系，包括人类干细胞，如诱导多能细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)，神经祖细胞，神经细胞，心脏祖细胞和心肌细胞。我们还描述了采用描述的电压指示器蛋白筛选药物的方法。本发明方法使用的细胞，不管是原核细胞还是真核细胞，都被典型的工程化表达细菌视紫红质或修饰的细菌视紫红质，而他们不能天然地表达用于本发明方法的细菌视紫红质蛋白。因此，在一个具体实施方式
中，发明提供一种测定表达细菌视紫红质蛋白编码的核酸细胞膜电位的方法，该方法包括步骤(a)，用至少一个波长的光通过体外、离体或体内激发至少一个包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞，和步骤(b)体外、离体或体内检测来自至少一个细胞的至少一个光学信号，其中和参考相比，由至少一个细胞发射的荧光强度水平指示细胞膜电位。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性降低。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是变形菌视紫红质蛋白家族中的成员。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是古细菌视紫红质蛋白家族的成员。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少一个波长在λ =594-645之间的波长，波长范围在λ =630-645nm之间的波长也是可以使用的。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细胞是原核细胞。原核细胞可以是革兰阳性或革兰阴性。原核细胞可以是病原性的或非病原性的。
在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细胞是真核细胞。 在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，真核细胞是哺乳动物细胞。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，真核细胞是干细胞、多能细胞或祖细胞。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，真核细胞是诱导多能细胞。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，真核细胞是神经细胞。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，真核细胞是心肌细胞。这些细胞可以体外培养或离体培养，或者可以是器官或组织的部分。典型的细胞包括细菌，酵母，植物细胞，和来自脊椎动物或无脊椎动物的细胞。在一些具体实施方式
中，真核细胞是人类细胞。在一些具体实施方式
中，真核细胞是非人类细胞。在一些具体实施方式
中，细胞不天然地表达方法中使用的细菌视紫红质蛋白。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，该方法进一步包括将载体体夕卜，离体或体内转染给至少一个细胞的步骤，所述载体包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸。这些细胞可以被瞬时转染或稳定转染。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸与细胞型特异的启动子可操作地连接。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向序列。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，膜靶向序列是质膜靶向性序列。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，膜靶向序列是亚细胞区室靶向序列。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，亚细胞区室是选自于线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体和吞噬小体。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细菌视紫红质基因可操作地连接于编码附加荧光蛋白或生色团的核酸。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是能够指示细胞内离子浓度的蛋白。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少一个能够指示离子浓度的附加荧光蛋白是钙指示剂。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示剂。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，突光蛋白的亮度对膜电位和局部化学环境不敏感，因此，和细菌视紫红质的荧光相比可作为参考。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，该方法还包括如下步骤:采用至少第一和第二波长的光体外、离体或体内激发至少一个细胞；和体外、离体或体内检测至少第一和第二光学信号，该信号由至少第一和第二波长的激发引起，其不同于来自至少一个细胞的至少第一波长。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少第二波长是在λ =447-594之间的波长。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，该方法还包括如下步骤:计算细菌视紫红质的荧光发射与附加荧光蛋白的荧光发射的比率，以获取不依赖于表达水平差异的膜电位测定。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，该方法还包括将至少一个细胞体外，离体或体内暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激的步骤。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，刺激是候选试剂。在一些具体实施方式
中，给予至少一个候选试剂。在一些具体实施方式
中，同时或顺序给予至少两个候选试剂的组合。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，刺激是细胞培养基组分的变化。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，刺激是电流。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，该方法还包括在至少第一时间点和至少第二时间点体外，离体或体内测定，至少一个光学信号的步骤。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少第一时间点是在将至少一个细胞暴露于刺激之前，至少第二时间点是将至少一个细胞暴露于刺激之后。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，本方法还包括测定来自于暴露在至少第一波长和至少第二波长的光学信号间的荧光比例的步骤。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，该方法包含使用多个细胞。例如在高通量测定模式中。例如，在此具体实施方式
中，表达细菌视紫红质蛋白的多个细胞可以暴露于多个候选试剂中，例如候选药物，和筛选候选试剂影响细胞膜电位的能力。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，真核细胞是人类细胞。在一些具体实施方式
中，真核细胞是非人类细胞。在另外的具体实施方式
中，发明提供了分离和纯化的核酸，其编码古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员，与来自于古细菌视紫红质蛋白家族的天然成员相比，离子泵活性降低。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，与衍生源古细菌视紫红质蛋白家族天然成员相比，离子泵活性下降的古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员包括邻近希夫喊基的突变的质子受:体。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于编码膜-靶向序列的核酸。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，膜-靶向序列的核酸是亚细胞膜-靶向序列。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，亚细胞膜是线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于细胞型特异的启动子。
在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于编码附加荧光蛋白或生色团的至少一个核酸。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，分离纯化的核酸可操作地连接于编码附加荧光蛋白的核酸，该蛋白可经受荧光共振能量转移成为细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，分离纯化的核酸还包括载体。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，该载体是病毒载体，如慢病毒载体或腺伴随病毒载体(AAV)。在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种包括上述分离和纯化的核酸的试剂盒。核酸可以通过在缓冲液中或以干燥的形式例如适宜容器中冷冻干燥形式提供。在一些具体实施方式
中，试剂盒还包括实施本发明中方法或测定的缓冲液和溶液。根据说明书中提供的描述，本领域技术人员可为该试剂盒挑选和选择合适的试剂。该试剂盒可以包括一个或多个转染试剂，一个或多个缓冲液，一个或多个细胞培养基，一个或多个容器，例如细胞培养皿或阵列，从而进行本发明中的方法或测定。该试剂盒中也可以包括进行测定操作的说明的说明书。在另一个具体实施方式
中，本发明提供包括编码细菌视紫红质蛋白的核酸的分离细胞。该细胞典型地工程化表达细菌视紫红质蛋白。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细菌视紫红质蛋白是修饰细菌视紫红质蛋白，与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性下降。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，修饰细菌视紫红质蛋白包括邻近希夫碱基的突变的质子受体。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细菌视紫红质是变形菌视紫红质家族的成员。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细菌视紫红质是古细菌视紫红质家族的成员。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细胞是真核细胞。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细胞是原核细胞。在一些具体实施方式
中，原核细胞是革兰阳性细胞。在一些具体实施方式
中，原核细胞是病原性细胞。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，修饰的细菌视紫红质基因可操作地连接于启动子。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，启动子是细胞型特异性启动子。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，编码修饰细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向核酸。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，编码修饰细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是能够进行荧光共振能量转移，成为细菌视紫红质的蛋白，其能量转移速率取决于膜电位。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，至少一个附加荧光蛋白是亮度对膜电位和局部化学环境不敏感的荧光蛋白。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细胞还包括编码能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白的核酸。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，细胞是干细胞，多能细胞，或诱导多能细胞，或其分化的或其未分化的子代细胞。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，分化细胞是神经元。在发明的任一具体实施方式
或方面的一些方面中，分化细胞是心肌细胞。在一个具体实施方式
中，本发明提供试剂盒，其包括上述描述的在适宜培养基或容器中的一个或多个细胞。该试剂盒可包括在适宜培养基中的冷冻细胞。该试剂盒包括其他试剂，如一个或多个缓冲液，一个或多个细胞培养基，和一个或多个容器。该试剂盒还可包括在此描述的方法中使用细胞的方法说明书。在另一个具体实施方式
中，本发明提供用于膜电位光学测定的工程细胞的生产方法，包括用编码细菌视紫红质蛋白的核酸转染细胞的步骤。转染可以是瞬时或稳定转染。在一些具体实施方式
中，细胞是原核细胞。该原核细胞是革兰阳性或革兰阴性。在一些方面中，原核细胞是致病菌。细胞还可以是干细胞，多能细胞，分化细胞或无限增殖化细胞或细胞株。细胞可以是器官或组织的分离细胞或一部分，如斑马鱼或非人类胚胎或人类胚胎。在此具体实施方式
的一方面，和该具体实施方式
的任一方面中，细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白。在此具体实施方式
的一方面，和该具体实施方式
的任一方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于分化的细胞型特异性启动子。在此具体实施方式
的一方面，和该具体实施方式
的任一方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于至少一个编码荧光蛋白或生色团的附加基因。在此具体实施方式
的一方面中，至少一个编码荧光蛋白的附加基因是绿色荧光蛋白或其同系物。在此具体实施方式
的一方面，和该具体实施方式
的任一方面中，编码细菌视紫红质蛋白的核酸可选择地连接于能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。本说明书提供了示例性核酸和核酸构建体，它们的核酸序列在附带的序列表中提供。具有代表性的是，通过突变该蛋白邻近希夫碱基的质子受体进行修饰，使修饰的视紫红质至少离子泵活性下降。然而，本发明意欲不受这些实施例的限制，因为类似光学测定用于许多现存细菌视紫红质蛋白是可能。任何该类蛋白可用于本发明的方法，且任何该类蛋白也可以修饰使其离子泵活性下降。


图1显示在绿色变形菌视紫红质的D97N突变体中的电压灵敏度机理。左侧:绿色变形菌视紫红质(a)跨越磷脂双层膜(b)。右侧:视黄醛(C)的生色团放大图，其通过希夫碱基(d)与蛋白骨架共价结合。在野生型结构中的门冬氨酸97被突变为天冬酰胺(e)，进而降低希夫碱基的pKa，从野生型的>12降低为9.8值，以消除质子泵的光循环。跨膜电压降的变化改变局部电化学电位从而使质子(f)位于希夫碱基上，从而改变酸碱平衡。视黄醛的吸收光谱和荧光取决于希夫碱基的质子化状态:质子化形式是有荧光，去质子化形式则没有荧光的。通过测定荧光确定跨膜电压。图2A-2D显示GPR D97N是跨膜蛋白，其显示强耐光和环境灵敏的荧光。表达GPR D97N的大肠杆菌细胞在633nm波长下受激发且通过在660 - 760nm之间的GPR D97N发射的灭光成像。蛋白位于细胞外围的蛋白可以作为跨 旲蛋白。图2Α显不ρΗ7和pHlI时GPR D97N在整个大肠杆菌的可见吸收光谱；图2B显示pH7和pHll时溶于辛基葡萄糖苷的纯化GPR D97N蛋白的荧光发射光谱；图2C显示在相同光照条件下GPR D97N和有机染料Alexa647(分子探针)的光漂白作用曲线。图2D显示通过可见吸收监测的野生型和GPRD97N突变体中希夫碱的pH滴定。D97N突变体的pKa是9.8，野生型蛋白的pKa是>12。图3显示GPR D97N发挥体内和体外pH功能的荧光强度。在两种情况下，由于希夫碱基的去质子化在高PH时荧光减弱。测定大肠杆菌细胞的PKa值，其通过附加羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)使质子可以渗透细胞膜。这样的处理是有必要的，因为质子从细胞质一侧连接于希夫碱基，·在没有CCCP时，细胞在细胞外pH浮动的情况下可维持稳定的细胞质pH。由于细胞内的局部环境影响，细胞内和纯化蛋白内的pKa不同。图4A和图4B显示在表达GPRD97N的大肠杆菌中的荧光闪烁。图4A显示ρΗ7.5时3个大肠杆菌的摄影软片。每次暴露100ms。单个细胞的亮度随时间变化。图4B显示PH7.5时单个细胞的闪烁图像。每个痕迹是50秒(s)的记录强度。实验开始后的时间在右侧显示。在I小时的实验中细胞持续闪烁。相同细胞显示为快速闪烁(O和7分钟)，缓慢闪烁(28分钟)和‘铃声’行为(18分钟)。图5显示含有古细菌视紫红质3 (Arch3，在一些情况下也称Ar-3)的制粒的图，如在合成生物学网站中所描述的(合成神经生物学的网址为org/protocol s/protocoldetail/36/10)(world wide web at synthetic neuro biology.0rg/protocols/protocoldetai1/36/10)。图6A-6E显不Arch是突光电压指不器。图6A显不Arch作为电压传感器的模型。pH和膜电位均可改变希夫碱基的质子化。所示晶体结构为细菌视紫质。Arch的结构尚不明确。图6B显示纯化的Arch在中性的、高pH时的吸收光谱(实线)和荧光发射光谱(发射谱见虚线)。图6C上图显示表达Arch的HEK细胞，通过Arch荧光是可见的。图6C下图显示电压依赖性荧光的像素权重矩阵区。标尺10 μ m。图6D显示Arch发挥膜电位功能的荧光。荧光值在_150mV时分开。图6E显示膜电位在_70mV和+30mV之间Arch的阶梯状动态响应。上升和下降边缘的突增是电子补偿电路的人为产物。数据是20个循环的平均。插入图显示在低于0.5ms分辨率的显像系统中的瞬态特性。图7A-7D显示Arch3WT动作电位的光学记录。表达Arch-GFP的培养的大鼠海马神经元通过GFP荧光成像。Arch荧光显示为蓝绿色，电压依赖性荧光区显示为红色。图7A显示在一连串动作电位的单个实验记录中，通过直流电压记录(下图，虚线)和加权Arch3突光(上图，实线)测定的整个细胞膜电位。插入图是在单个细胞中269个脉冲响应的平均峰值，用电压(虚线)和荧光(实线)表示。图7B显示单个细胞的多个脉冲序列记录。将注入电流200pA (黑色虚线表示)应用于表达Arch WT的神经元。通过多重电流注入的荧光容易地检测动作电位(灰线表示)。图7C显示动作电位的亚细胞定位。我们以一个表达Arch的神经突起的影像并制作指示像素的权重矩阵，如图中显示的图像，其荧光随着红色记录电位共同变化，覆盖在紫色的时间平均的Arch荧光。我们检测电活性细胞中的亚细胞区。该图顶部显示由每个指示区域对应荧光(F)测定的动作电位时间过程(均值除以n=100脉冲)。图中还显示动作电位的电子记录(V,图底部)。图7D显示一个神经元中动作电位的异质动态学，通过n=33脉冲的均值计算得来。像素图中的箭头标注的区域(见图片)滞后于其他细胞约 Ims (黑色箭头)。标尺5μηι。图8A-8D表明Arch D95N显示具有电压依赖性荧光而不是光电流。图8Α显示在Arch3WT和Arch3D95N突变体中的光电流，在固定为V=O的HEK细胞中表达。用波长λ =640nm，1800ff/cm2的光脉冲照射细胞。图8B显示Arch D95N荧光在_150mV和+150mV之间增加3倍，从-120mV到+120mV接近于线性灵敏度。插图显示电压灵敏度图片。标尺5 μ m。图8C显示瞬态特性，其包含快于500 μ s的组分(响应的20%)和恒定41ms的组分。图8D显示Arch D95N提供膜电位的准确估计，清楚的分辨电压梯度为10mV，从带有噪声荧光对整个时间量程<12s准确度为260 μ V/(Hz)1/2进行电压估计。图9A-9C显示用ArchD95N的动作电位的光学记录。图9A显示电子记录的表达Arch WT的神经元膜电位,其经过电流注入脉冲和激光照射(I=1800W/cm2, λ =640nm)。当细胞接近阈值时，照明产生了足够的光电流以抑制动作电位。灰色的条带指激光照射。在表达Arch D95N的神经元上图9B与图9A相同，显示照明对脉冲或静息电位无影响。我们提供了表达Arch D95N的神经元，显示Arch D95N荧光(试验中用蓝绿色显示)和电压依赖荧光区域(实验中用红色显示)。图9C显示一连串动作电位序列的单个实验记录中，通过电子记录和权重的ArchD95N荧光(顶部，荧光线)确定整个细胞膜电位(底部，电压线)。图10显示现有的基因编码的荧光电压指示器，根据其灵敏度和速度分类-两个决定指示器性能的关键参数。VSFPs，FLARE和SPARC代表基于GFP同系物与膜蛋白的融合的指示器。我们已经开发的的示例性蛋白是变形菌视紫红质光学质子传感器(PROPS) ,Arch3WT,和Arch3D95N，在右上侧显示。PROPS在细菌中发挥作用，而Arch3WT和Arch3D95N在哺乳动物细胞中发挥作用。注意对数坐标轴。基于细菌视紫红质的电压指示器比其他指示器更灵敏，更迅速。图11A-11D显示在表达Arch3D95N - eGFP的单个HL-1小鼠心肌细胞中动作电位的光学记录。记录动作电位至多为1000s，不具有光毒性信号。这个实验是采用基因编码电压指示器首次定量测定心脏动作电位。我们显示了在D95N-GFP融合体中展示Arch D95N和GFP荧光的外罩。图1lA显示膜片箝记录(虚线)和荧光(实线)测定的动作电位的比较。图11B-11D显示在不断增加的长间隔中单个HL-1细胞中的动作电位的光学记录。IlD中的数据已校正光漂白作用。图12显示表达Arch3D95N-eGFP的人类诱导多能干细胞(iPS)衍生的心肌细胞中动作电位的光学记录。人类诱导多能干细胞(hiPSC)由细胞动力学有限公司(CellularDynamics Inc.)提供。细胞在MatTek皿中以每平方厘米上20000，50000或75000的细胞的密度进行培养，其中该培养皿涂有0.1%明胶。这些条件显示细胞是稀疏且不自发搏动的(20K)，融合单分子层是自发搏动(50K)的，和密集的单分子层(75K)。iPS细胞在培养基中培养并保持48小时，且其后每48小时供给维持培养基(均来自细胞动力学公司)(Cellular Dynamics Inc.)。根据生产说明书使用Mirus LT-1转染iPS细胞。在包括20uL OPT1-MEM 的试管中，加入200ng的DNA和1.2uL的LT-1转染试剂。DNA混合物在室温下孵化20分钟。孵化过程中，将新鲜的维持培养基附加到iPS细胞中，DNA混合物滴加到平皿中。细胞在转染后的48小时到96小时成像。我们观察到毗邻细胞的同步搏动，表明VIPs可探测细胞间的传导。我们持续记录10分钟以上，几乎没有光毒性。如对该种群期望的，在细胞种群内，我们观察到了与心室的，心房的，和节的细胞的动作电位相匹配的细胞。药物的附加导致动作电位波形变化，该变化与常规膜片箝报告的记录变化相匹配。在荧光对比时间的图片中细胞I荧光信息为实线，细胞2荧光为虚线。图13实验证明了 VIPs与GFP同系物融合蛋白构建体的开发的一系列改进的电压指示器。每个条状的长度表明蛋白序列或接头区域的长度。颜色表明相应蛋白荧光的颜色。所有的构建体用Arch WT和Arch D95N骨架进行构建。该构建体的序列在下面的序列表提供:
权利要求
1.一种在表达编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞中测定膜电位的方法，该方法包括如下步骤: a)用至少一个波长的光体外激发至少一个包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞；和 b)体外检测来自至少一个细胞的至少一个光学信号，其中与参考相比，通过至少一个细胞的发射荧光强度水平指示细胞膜电位。
2.如权利要求1所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，与源自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，其离子泵活性降低。
3.如权利要求2所述的方法，其中修饰的细菌视紫红质包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是变形菌视紫红质蛋白家族的成员。
5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是古细菌视紫红质蛋白家族的成员。
6.如前述 权利要求任一项所述的方法，其中至少一个波长是在λ=594-645ηπι之间的波长。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中细胞是原核细胞。
8.如权利要求1-6任一项中的方法，其中细胞是真核细胞。.
9.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是哺乳动物细胞。
10.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是干细胞或多能细胞或祖细胞。
11.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是诱导多能细胞。
12.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是神经元。
13.如权利要求8中的方法，其中真核细胞是心肌细胞。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，还包括将载体体外转染给至少一个细胞的步骤，所述载体包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸。
15.如前述任一项权利要求所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸与细胞型特异的启动子可操作地连接启动子。
16.如前述任一项权利要求所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜-靶向的核酸序列。
17.如权利要求16所述的方法，其中膜靶向核酸序列是质膜靶向核酸序列。
18.如权利要求16所述的方法，其中膜靶向核酸序列是亚细胞区室靶向核酸序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中亚细胞区室是选自于线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
20.如前述任一项权利要求所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加额外的荧光蛋白或生色团的核酸。
21.如权利要求20所述的方法，其中至少一个附加额外的荧光蛋白是能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。
22.如权利要求21所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
23.如权利要求21所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
24.如权利要求20所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
25.如权利要求20所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
26.如权利要求20-25任一项所述的方法,其中突光蛋白的亮度对膜电位或局部化学环境不敏感。
27.如权利要求20-26任一项所述的方法还包括如下步骤:采用至少第一和第二波长的光体外激发至少一个细胞；和体外检测至少第一和第二光学信号，该信号由来自至少一个细胞的至少的第一和第二波长的激发引起。
28.如权利要求27所述的方法，其中第二波长在λ=447-594nm之间。
29.如权利要求26-28任一项所述的方法，还包括如下步骤:计算细菌视紫红质的荧光发射与至少一个附加荧光蛋白的荧光发射的比率，以获取不依赖于表达水平差异的膜电位测定。
30.如如前述任一项权利要求所述的方法还包括将至少一个细胞在体外暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激的步骤。
31.如权利要求30所述的方法，其中刺激是候选试剂。
32.如权利要求30所述的方法，其中刺激是细胞培养基组分的变化。
33.如权利要求30所述的方法，其中刺激是电流。
34.如前述任一项权利要求所述的方法，进一步包括在第一和至少第二时间点体外测定至少一个光学信号的步骤。
35.如权利要求34所述的方法，其中第一时间点是在将至少一个细胞暴露于刺激之前，至少第二时间点是将至少一个细胞暴露于刺激之后。
36.如前述任一项权利要求所述的方法包括多个细胞。
37.一种分离和纯化的核酸，其编码古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员，与来自于古细菌视紫红质蛋白家族的天然成员相比，离子泵活性降低。
38.如权利要求37所述的分离和纯化的核酸，古细菌视紫红质蛋白家族的修饰成员包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
39.如权利要求37-38任一项所述的分离和纯化的核酸，其可操作地连接于编码膜靶向核酸序列的核酸序列。
40.如权利要求39所述的分离和纯化的核酸，其中膜靶向的核酸序列是质膜靶向的核酸序列。
41.如权利要求39所述的分离和纯化的核酸，其中膜靶向的核酸序列是亚细胞膜靶向的核酸序列。
42.如权利要求41所述的分离和纯化的核酸，其中亚细胞膜是线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
43.如权利要求37-42任一项所述的分离和纯化的核酸，其与细胞型特异的启动子可操作地连接启动子。
44.如权利要求37-43任一项所述的分离和纯化的核酸，其可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。
45.如权利要求44所述的分离和纯化的核酸，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
46.如权利要求45所述的分离和纯化的核酸，其中至少一个附加荧光蛋白能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。
47.如权利要求46所述的分离和纯化的核酸，能够指示离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
48.如权利要求46所述的分离和纯化的核酸，能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
49.如权利要求44-45所述的分离和纯化的核酸，其中至少一个附加荧光蛋白是能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
50.如权利要求37-49任一项所述的分离和纯化的核酸，其进一步包括载体。
51.如权利要求50所述的分离和纯化的核酸，其中载体是病毒载体。
52.如权利要求51所述的分离和纯化的核酸，其中病毒载体是慢病毒载体。
53.如权利要求51所述的分离和纯化的核酸,其中病毒载体是腺相关病毒载体。
54.一种试剂盒，包括在容器中的权利要求37-53任一项所述的分离和纯化的核酸。
55.一种分离细胞，其包括编码细菌视紫红质蛋白的核酸，其中细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，离子泵活性降低。
56.如权利要求55所述的分离细胞，其中修饰的细菌视紫红质蛋白包括邻近希夫碱基的突变质子受体。
57.如权利要求55-56任一项所述的分离细胞，其中细菌视紫红质是变形菌视紫红质家族的成员。
58.如权利要求55-56任一项所述的分离细胞，其中细菌视紫红质是古细菌视紫红质家族的成员。
59.如权利要求55-58任一项所述的分离细胞，其中细胞是真核细胞。
60.如权利要求55-58任一项所述的分离细胞，其中细胞是原核细胞。
61.如权利要求55-60任一项所述的分离细胞，其中修饰的细菌视紫红质基因可操作地连接于启动子。
62.如权利要求61所述的分离细胞，其中启动子是细胞型特异性的启动子。
63.如权利要求55-62任一项所述的分离细胞，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向的核酸序列。
64.如权利要求63所述的分离细胞，其中膜靶向核酸是质膜靶向的核酸序列。
65.如权利要求63所述的分离细胞，其中膜靶向性核酸是亚细胞区室-靶向的核酸序列。
66.如权利要求65所述的分离细胞，其中亚细胞区室是选自于线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
67.如权利要求55-66任一项所述的分离细胞，其中编码修饰的细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。
68.如权利要求67所述的分离细胞，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
69.如权利要求67-68任一项所述的分离细胞，其中至少一个附加荧光蛋白是能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
70.如权利要求67-68任一项所述的分离细胞，其中至少一个附加荧光蛋白的亮度是对膜电位或局部化学环境不敏感的荧光蛋白。
71.如权利要求67-68任一项所述的分离细胞，其中至少一个附加荧光蛋白能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。
72.如权利要求71所述的分离细胞，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白，是钙指示器。
73.如权利要求71所述的分离细胞，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
74.如权利要求55-73任一项所述的分离细胞，其中细胞是干细胞，多能细胞，或诱导多能细胞，或其分化或未分化的子代细胞。
75.如权利要求55-73任一项所述的分离细胞，其中细胞是分化细胞。
76.如权利要求75所述的分离细胞,其中分化细胞是神经元。
77.如权利要求75所述的分离细胞，其中分化细胞是心肌细胞。
78.一种分离细胞，其含有权利要求37-53任一项所述分离和纯化的核酸。
79.—种试剂盒，含有权利要求55-78任一项所述的在合适的细胞培养基上的多个细胞和容器。
80.一种用于膜电位光学测定的工程细胞的生产方法，包含采用编码细菌视紫红质蛋白的核酸转导细胞的步骤。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，相比于天然细菌视紫红质蛋白，其离子泵活性降低。
82.如权利要求80-81任一项所述的方法，其中修饰的细菌视紫红质包括突变的邻近希夫碱基的质子受体。
83.如权利要求80-82任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向核酸序列。
84.如权利要求83所述的方法，其中膜靶向核酸序列是质膜靶向的核酸序列。
85.如权利要求83所述的方法，其中膜靶向性的核酸序列是亚细胞膜靶向的核酸序列。
86.如权利要求85所述的方法，其中亚细胞膜是线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
87.如权利要求82-86任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸与细胞型特异的启动子可操作地连接启动子。
88.如权利要求80-87任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的附加核酸。
89.如权利要求88所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
90.如权利要求88-89任一项所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白能够指示细胞内离子浓度。
91.如权利要求90所述的方法，其中能够指示细胞内的离子浓度的至少一个附加荧光蛋白是钙指示器。
92.如权利要求90所述的方法，其中能够指示细胞内的离子浓度的至少一个附加荧光蛋白是PH指示器。
93.如权利要求80-92任一项所述的方法，其中细胞是分化细胞。
94.如权利要求93所述的方法，其中分化细胞是神经元。
95.如权利要求93所述的方法，其中分化细胞是心肌细胞。
96.如权利要求80-92任一项所述的方法，其中细胞是多能细胞，干细胞或诱导多能干细胞。
97.如权利要求96所述的方法，进一步包括多能细胞，干细胞或诱导多能干细胞分化为分化细胞的步骤。
98.如权利要求80-97任一项所述的方法，其中转导采用瞬时转染来实施。
99.如权利要求80-97任一项所述的方法，其中转导是采用稳定转染来实施。
100.如权利要求80-99任一项所述的方法，其中采用权利要求37-53任一项所述的分离和纯化的核酸转导细胞。
101.一种在表达编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞中测定膜电位的方法，该方法包括步骤: a)用至少一个波长的光激发至少一个包含编码细菌视紫红质蛋白的核酸的细胞；和 b)检测来自至少一个细胞 的至少一个光学信号，其中与参考相比，由至少一个细胞的发射荧光强度水平指示细胞膜电位。
102.如权利要求101所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是修饰的细菌视紫红质蛋白，或与来自于天然的细菌视紫红质蛋白相比，该蛋白离子泵活性降低。
103.如权利要求102所述的方法，其中细菌视紫红质包括邻近希夫碱基的突变的质子受体。
104.如权利要求101-103任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是变形菌视紫红质蛋白家族的成员。
105.如权利要求101-103任一项所述的方法，其中细菌视紫红质蛋白是古细菌视紫红质蛋白家族的成员。
106.如权利要求101-105任一项所述的方法，其中至少一个波长是在λ=594-645ηπι之间的波长。
107.如权利要求101-106任一项所述的方法，其中细胞是原核细胞。
108.如权利要求101-106任一项所述的方法，其中细胞是真核细胞。
109.如权利要求108所述的方法，其中真核细胞是哺乳动物细胞。
110.如权利要求108所述的方法，其中真核细胞是干细胞或多能细胞或祖细胞。
111.如权利要求108所述的方法，其中真核细胞是诱导多能细胞。
112.如权利要求108所述的方法，其中真核细胞是神经细胞。
113.如权利要求108所述的方法，其中真核细胞是心肌细胞。
114.如权利要求101-112任一项所述的方法，进一步包括采用载体转染至少一个细胞的步骤，所述载体包括编码细菌视紫红质蛋白的核酸。
115.如权利要求101-114任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸与细胞型特异的启动子可操作地连接。
116.如权利要求101-115任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于膜靶向的核酸序列。
117.如权利要求116所述的方法，其中膜靶向核酸序列是质膜靶向核酸序列。
118.如权利要求116所述的方法，其中膜靶向核酸序列是亚细胞区室靶向核酸序列。
119.如权利要求118所述的方法，其中亚细胞区室是选自于线粒体膜，内质网，肌质网，突触小泡，内涵体或吞噬小体。
120.如权利要求101-119任一项所述的方法，其中编码细菌视紫红质蛋白的核酸可操作地连接于编码至少一个附加荧光蛋白或生色团的核酸。
121.如权利要求120所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是能够指示细胞内离子浓度的荧光蛋白。
122.如权利要求121所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是钙指示器。
123.如权利要求121所述的方法，其中能够指示离子浓度的荧光蛋白是pH指示器。
124.如权利要求120所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白能够进行非放射性荧光共振，使能量转移到细菌视紫红质，其能量转移速率取决于膜电位。
125.如权利要求120所述的方法，其中至少一个附加荧光蛋白是绿色荧光蛋白或其同系物。
126.如权利要求120-125任一项所述的方法，其中荧光蛋白的亮度对膜电位或局部化学环境不敏感。
127.如权利要求120-126任一项所述的方法，进一步包括如下步骤:采用至少第一和第二波长的光体外激发至少一个细胞；和体外检测至少第一和第二光学信号，该信号由来自至少一个细胞的至少第一和第二波长的激发引起。
128.如权利要求127所述的方法，其中至少第二波长在λ=447-594ηπι之间。
129.如权利要求120-128任一项所述的方法，进一步包括如下步骤:计算细菌视紫红质的荧光发射与至少一个附加荧光蛋白的荧光发射的比率，以获取不依赖于表达水平差异的膜电位测定。
130.如权利要求101-129任一项所述的方法，进一步包括将体外至少一个细胞暴露于能够或预期能够改变膜电位的刺激的步骤。
131.如权利要求130所述的方法，其中刺激是候选试剂。
132.如权利要求130所述的方法，其中刺激是细胞培养基组分的变化。
133.如权利要求130所述的方法，其中刺激是电流。
134.如权利要求101-133任一项所述的方法，进一步包括在第一和至少第二时间点体外测定至少一个光学信号的步骤。
135.如权利要求134所述的方法，其中第一时间点是在将至少一个细胞暴露于刺激之前，以及至少第二时间点是将至少一个细胞暴露于刺激之后。
136.如权利要求101-135任一项所述的方法，包括多个细胞。
137.如权利要求101-136任一项所述的方法，其中细胞是非人类细胞。
全文摘要
本发明提供膜电位的光学测量方法，细胞和构建体。这些方法可用于采用现有电极方法不可接触到的细胞。本方法可用于，例如，高通量药物筛选试验中测定能够影响靶细胞膜电位的试剂。
文档编号G01N33/50GK103168236SQ201180050734
公开日2013年6月19日 申请日期2011年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者亚当·E·科恩, 乔尔·M·克拉利, 亚当·D·道格拉斯 申请人:哈佛大学管理委员会