专利名称：一种中药注射剂致敏原的综合检测方法
技术领域：
本发明涉及免疫学与中药学领域，具体涉及一种中药注射剂致敏原的快速检测方法。
背景技术：
中药注射剂系我国特有的现代化中药新剂型，在我国临床上已大量使用。随着中药注射剂临床应用的日益广泛，有关中药注射剂不良反应(ADR)及致死亡病例报道日益增多，过敏反应均为常见的不良反应之一。中药注射剂引起的过敏反应主要分为I型(速发型)、II型(细胞毒型)、III型 (免疫复合物型)、IV型(迟发型)过敏反应。其中，由IgE介导的I型过敏反应是中药注射剂在临床上最常引起的一类过敏反应，其发病急，可迅速出现皮肤潮红、瘙痒、腹痛甚至过敏性休克等严重症状。I型超敏反应是致敏原刺激抗体的淋巴结、肝、脾等器官的单核吞噬系统，触发浆细胞反应产生特异性IgE(SlgE)抗体。IgE分子的Fc端附着在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体上，使机体处于致敏状态。当机体再受同类型致敏原刺激时，致敏原与IgE分子交联，引起肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒化，释放出组胺、白三烯及细胞因子等化学物质产生过敏反应、导致机体的毛细血管扩张、水肿、平滑肌痉挛、内分泌活动亢进，引发过敏性疾病的临床症状，严重时可产生过敏性休克等危及生命。由于中药注射剂成分复杂，也并不是所有的成分能致敏，而是一部分能与体内蛋白自动结合的成分，可以与血液中蛋白结合，也可能与组织中蛋白结合而致敏，并且中药注射剂的原成分与代谢成分都可能是致敏性成分。目前的致敏原检测方法主要有皮肤主动过敏试验、全身主动过敏试验、皮肤被动过敏试验、小鼠耳廓肿胀试验(MEST)、啮齿类局部淋巴结实验(LLNA)、Buehler分析法、豚鼠最大值法(GPMT)等，但是这些检测方法仅适用于单成分制剂。怎样确定其中的致敏性成分和测定与其对应的特异性IgE含量方法对于安全使用中药注射剂是大家公认的国际性难题。目前有人提出将中药注射剂的成分分离并固定，然后再与所产生的抗体酶联免疫反应进行判断，一则小分子的半抗原不好固定，在进行固相酶联免疫吸附法时会被洗脱液洗掉的，故难实现目标；同时中药注射剂致敏原除了与血液中的IgE反应外，还与其它的 IgG, IgA, IgM, IgD反应，而后四者并非致敏性免疫球蛋白，因此会受其它的干扰。现又改成单个成分逐个分析法，旨在将中药注射剂中单个成分分离，然后按单成分的模式逐个来试，这对于中药注射剂致敏性动物实验是允许的，但无法进行中药注射剂对人体致敏原研究，因为中药注射剂是整体而不加佐剂使用的，不能将成分折分或加入免疫增强剂来进行研究，这样的实验结果与中药注射剂临床使用的真实情况不一致，因此该法也行不通。另外，如果是中药注射代谢产物产生致敏，现有方法无法进行确定，且对于含量少的成分也可能存在漏查。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中药注射剂致敏原的快速综合检测方法， 本发明所述检测方法具有高特异性，适用于多成分的同时检测，能够准确检测出中药注射剂中的致敏原成分，也可最大限度地防止漏查。本发明的基本思路采用已知成分抗原或抗体去套未知的致敏性多克隆特异性抗体IgE，具体就是1)宏观上仍采用酶联免疫吸附反应，中药注射剂致敏是I型超敏反应，标志性指标为免疫球蛋白IgE增加。2)在采用本法时，要用已知的抗体(抗原)去套人或动物按注射剂使用时所产生的 IgE。3)对于代谢产物或含量少的成分或可能漏查成分采用IgE与吸附中药注射剂指纹图谱弥补；4)对于与组织内的蛋白结合只能采用药物的半抗原决定簇，通过交叉反应弥补；5)多成分采用芯片同时测定；本发明是基于ELISA原理与指纹图谱差异性分析相结合技术，利用固相载体包埋抗原、IgE抗体、抗IgE抗体，分别采用中药注射剂成分抗原与标记好的抗IgE抗体间接酶联免疫反应、包埋的IgE抗体与血样中特异性的IgE竞争抗原的酶联免疫反应、包埋的抗IgE 抗体捕获血样中IgE抗体，再与标记的抗原，或抗原与标记抗体的酶联免疫反应、抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再结合中药注射剂成分，采用GC/MS、HPLC/MS分析其指纹图谱差异来确定中药注射剂(拟)使用者血样中的特异IgE。总体方法是用针对动物实验的抗原抗体去套人或动物使用中药注射剂剂致敏所产生的特异性抗体IgE及成分。或采用HPLC/MS、 GC/MS来分析特异性抗体IgE所作用的特异性成分，诸法联合确定中药注射剂剂致敏原。首先将中药注射剂的成分尽可能分离出来，本发明可采用本领域技术人员熟知的分离方法，如溶剂、水蒸气蒸馏、升化、分子蒸馏、膜分离、超临界流体萃取、逆流液滴分配及各种层析法等，对中药注射剂中各组分进行分离。中药注射剂中大分子可直接作为全抗原，大部分为小分子化学物质，属于半抗原， 故需要用化学合成的方法，将分离的各组分修饰为全抗原。根据分离的各组分的具体结构采用化学方法与丙种球蛋，人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、 血蓝蛋白以及人、�：图-球蛋白、卵黄蛋白或人工合成的多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等合成抗原；或分别注射到动物体内或混合在一起注射到动物体内等偶联得到抗原，或用聚乙烯吡咯酮、羧甲基纤维素、聚甲基丙酸酯微粒联接得抗原。其中，对于含氨基的化学组分，可采用重氮化法、戊二醛法、多元酸酐法、二异氰酸酯法、偶氮苯甲酸法、亚胺酸酯法来合成；对于含糖基的化学组分，可以采用碘酸盐氧化法来合成；对于含羧基的化学组分，可以采用混合酸酐法、碳二亚胺法、活泼酯法来合成；对于含酮基的化学组分，可以采用O-羧甲基羟胺法、对-胼基苯甲酸法、Marmich反应法来合成；对于羧酸甲酯衍生物，可以采用叠氮化法来合成；对于含羟基的化学组分，可以采用氯乙酸钠法、三氯三嗪试剂法来合成；对于含氨基、羟基、巯基的化学组分，可以采用卤代硝基苯法、苯醌法来合成。在中药注射剂的成分的全抗原合成时，载体蛋白的选择优选与注射剂使用情况尽
5可能一致，如中药注射剂用于人，载体蛋白为人的血清蛋白；如为动物，则为动物的血清蛋白，这样合成的抗原在动物体内产生的已知抗体与使用者体内产生的抗体决定簇尽可能相似，注入动物得到抗体，可能是IgG、IgA、IgD、IgM、IgE，以IgE最好，分离出各抗原的特异性抗体。本发明既先分离中药注射剂中各成分，制成全抗原，注入动物体内产生抗体，分离出抗体；又同时对人或动物的血清中IgE进行分离，注入动物体内产生二抗，标记抗IgE抗体，采用间接酶联免疫与已知抗原、标记抗体敏联免疫反应来筛查中药注射剂中的致敏性成分，或对已捕获的IgE抗体与中药注射剂成分抗原抗体反应，或对已捕获的IgE抗体与中药注射剂指纹图谱分析方法，根据特征峰的缺失来确定致敏性成分。本发明所述中药注射剂致敏原的检测方法适用于所有中药注射剂，如双黄连注射液、鹿茸精注射液、去感热注射液、肿节风注射液、茵桅黄注射液、茶色素注射液、鸦胆子油乳注射液、复方苦参注射液、健骨注射液、勒马回注射液、生脉注射液、消痔灵注射液、华蟾素注射液、清开灵注射液、乌头注射液、正清风痛宁注射液、白花蛇舌草注射液、伊痛舒注射液、补骨脂注射液、鱼金注射液、鱼腥草注射液、冠心宁注射液、穿山龙注射液、香丹注射液、 柴胡注射液、清热解毒注射液、雪莲注射液、黄芪注射液、醒脑静注射液、蟾蜍注射液、肝炎灵注射液、刺五加注射液、参附注射液、参麦注射液、脉络宁注射液、夏天无注射液、猪苓多糖注射液、羚羊角注射液、黄瑞香注射液、丁公藤注射液、血塞通注射液、穿心莲注射液、莲必治注射液、银黄注射液、舒血宁注射液、丹参注射液、毛冬青注射液、板蓝根注射液、注射用灯盏花素、苦木注射液、复方大青叶注射液、复方当归注射液、复方蛤青注射液、复方蒲公英注射液、艾迪注射液、当归寄生注射液、灯盏花素注射液、灯盏细辛注射液、红花注射液、 红茴香注射液、血栓通注射液、抗腮腺炎注射液、祖师麻注射液、退热解毒注射液、骨痨敌注射液、射干抗病毒注射液、桑姜感冒注射液、热可平注射液、益母草注射液、野木瓜注射液、 雪上一支蒿总碱注射液、止喘灵注射液、香菇多糖注射液、止咳灵注射液、注射用双黄连冻干粉、丹红注射液、丹香冠心注射液、瓜蒌皮注射液、人参茎叶总皂苷注射液、苦碟子注射液、注射用血塞通冻干粉、板蓝根注射液、板蓝解毒注射液、肝净注射液、肝欣泰注射液、田基黄注射液、岩黄连注射液、清肝注射液、舒肝宁注射液、复方半边莲注射液、薄芝菌注射液、地龙注射液、康艾注射液、柴辛感冒注射液、柴胡注射液、野菊花注射液、胆木注射液、喜炎平注射液、清热解毒注射液、人参多糖注射液、乌头注射液、痛克宁注射液、消癌平注射液。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案本发明提供一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，包括步骤1 分离中药注射剂的各成分，制备全抗原；步骤2 将中药注射剂的各个成分的全抗原按顺序固定于固体支持物制成芯片， 向每个检测孔加入待测血清，同时设立空白对照，加入未致敏血清液；孵育，洗去未结合物质；步骤3 加入酶标记的抗IgE抗体，孵育，洗去未结合物质；步骤4:显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强度强于空白对照时，则检测孔中对应的抗原为中药注射剂的致敏原。本发明还提供一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，包括
步骤1、中药注射剂的各成分的全抗原的特异性抗体按顺序固定于固体支持物制成芯片，向每个检测孔加入中药注射剂的全抗原溶液；同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；步骤2 在检测孔中加入待测血清，孵育，洗去未结合物质；步骤3 在检测孔中加入酶标抗IgE抗体，孵育，洗去未结合物质；步骤4 显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强于空白对照时， 则检测孔中特异性抗体对应的抗原为致敏原尤为优�。鎏匾煨钥固逦狪gG、IgA、IgD、IgM或IgE，最优选为IgE。本发明还提供一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，包括步骤1、中药注射剂使用致敏者的特异性抗体按顺序固定于固体支持物制成芯片， 向每个检测孔加入酶标记的对应抗原；同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；步骤2、显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强于空白对照时，则检测孔中特异性抗体对应的抗原为致敏原。尤为优�。鎏匾煨钥固逦狪gG、IgA、IgD、IgM或IgE，最优选为IgE。本发明提供的一种中药注射剂致敏原的底芯片检测方法，包括步骤1、中药注射剂使用致敏者的特异性抗体IgE按顺序固定于固体支持物制成芯片，向每个检测孔加入中药注射剂成分的合成全抗原溶液；同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；步骤2、在检测孔中加入酶标抗体，孵育，洗去未结合物质；步骤3、显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔吸光度强于空白对照为阳性， 根据强弱程度确定致敏强度，根据所对应的IgE抗体确定原注射剂中的致敏成分。本发明提供的一种中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法检测方法，包括步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成芯片，加待测血清液至检测孔中，孵育，洗去未结合物质；步骤2、加中药注射剂或含药血清孵育，洗去未结合物质；步骤3、收集未结合物质，采用GC/MS或HPLC/MS对未结合物质和中药注射剂进行指纹图谱分析，根据指纹图谱特征峰差异确定中药注射剂中的致敏成分。本发明提供的一种中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法检测方法，包括步骤1、将中药注射剂使用致敏者的特异性抗体固定于固体支持物制成芯片；步骤2、加中药注射剂或含药血清孵育，洗去未结合物质；步骤3、收集未结合物质，采用GC/MS或HPLC/MS对未结合物质和中药注射剂进行指纹图谱分析，根据指纹图谱特征峰差异确定中药注射剂中的致敏成分。本发明提供的一种中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片对应检测方法，包括步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成底芯片，加待测血清液至检测孔中， 孵育，洗去未结合物质；步骤2、将中药注射剂的各成分的酶标全抗原进行做成盖芯片；步骤3、底芯片与盖芯片的孔一一对应，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，孵育，洗去未结合物质；
步骤4、加底物显色，显色孔中对应的盖芯片标记抗原为致敏原。本发明提供的一种中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片对应检测方法，包括步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成底芯片，加待测血清液至检测孔中， 孵育，洗去未结合物质；步骤2、将中药注射剂的各成分的全抗原进行做成盖芯片；步骤3、底芯片与盖芯片的孔一一对应，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，孵育，洗去未结合物质；步骤4、加入对应的酶标抗体孵育，洗去未结合物质；步骤5、加底物显色，显色孔中对应的盖芯片抗原为致敏原。本发明最终提供的一种中药注射剂致敏原的综合检测方法，其特征在于，包括需对底芯片法、底芯片与盖芯片对应法及免疫指纹图谱法信息信息进行综合分析，最终得出中药注射剂对人或动物的的致敏性成分及特异性IgE。制作芯片的所述固体支持物为本领域技术人员所公知，优选为酶标板。本发明对固体支持物的数量以及每个固体支持物上固定的抗原的数量不做具体限制，可根据具体中药注射剂分离出的化学组分的数量来调整。同时，本发明所述抗原可按照其对应的化学组分的英文字母顺序、中文笔划、功效、功能团等分类方法来系统的排列成芯片点阵。所述的抗原、抗体的标记方法可采用荧光标记法、酶标记、放射性核素及化学发光标记等。由以上技术方案可知本发明所述一种检测中药注射剂的方法高特异性，适用于多成分的同时检测，能够准确检测出中药注射剂中的致敏原成分。本专利采用酶联免疫与指纹图谱双重分析，可以防止漏查。本发明采用芯片技术，将中药注射剂成分分离制成全抗原，按一定规律制成芯片； 同时与使用过注射剂的人或动物的血清抗体反应，再用IgE 二抗反应显色(底芯片法)，同时采用包埋抗IgE抗体，捕获人体或动物特异性IgE，再与已知中药注射剂成分的标记抗原或抗原与标记抗体显色(底芯片、底芯片与盖芯片结合法)，同时包埋抗IgE抗体，捕获人体或动物特异性IgE，采用指纹图谱分析(免疫指纹图谱法)，多方面综合判定中药注射剂的致敏原。因此，本发明所述方法具有高综合性、高特异性、高灵敏度和高效性，能对中药注射剂已知结构成分、未知结构成分(经HPLC/MS、GC/MS分析)、及代谢产物的致敏性进行分析，防止漏查，操作简单方便，解决了检测中药注射剂多成分致敏原的国际性难题，对于中药注射剂的安全性评价有突破性进展。
图1所示为双黄连注射剂的HPLC谱图；图2所示为双黄连注射剂吸附后的HPLC谱图。
具体实施例方式本发明公开了一种中药注射剂致敏原的综合检测分析方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领
8域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法和芯片已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下以双黄连注射剂为例，就本发明提供的一种检测中药注射剂致敏原的方法及芯片，进行详细阐述。实施例1 分离双黄连注射剂的化学组分用溶剂、酸碱、高效色谱等分离技术分离双黄连注射剂，分离成分有绿原酸、异绿原酸、新绿原酸、黄芩素、黄芩新素、黄芩甙、汉黄芩素、汉黄芩甙、白杨黄素、干层纸素、干层纸素A甙、连翘苷、连翘苷元冷杉树脂酚、冷杉树脂酚-β -D-葡萄糖甙、连翘酯苷Α、连翘酯苷C、连翘酯苷D、齐墩果酸、白桦脂酸、熊果酸、芸香苷等，同时分离出在双黄连注射剂制备时中的除去的大分子多糖与蛋白质等。实施例2 已知组分的全抗原的制备1、糖类或含糖基化合物抗原的制备准确称取实施例1中任一糖类或含糖基化合物为0. Olmmol，加^iil的吡啶溶解， 为A液。0.015mmol高碘酸钠加2ml水溶解，为B液。将溶液B逐步加入A液，室温，搅拌反应0. 5h，加Iyl的乙二醇终止反应；准确称取牛血清白蛋(BSA) 65mg(0. OOlmmol)，加入 0. 01mol/L、pH7. 4PBS 5ml，此溶液称为溶液 C。将反应好的溶液逐滴加入C溶液中，边加边搅拌，室温搅拌池，然后加0. OlM的硼氢化钠新鲜水溶液1ml，室温搅拌反应lh，反应结束后，在4°C冰箱中用0.01M、pH7. 4PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析后的溶液冷冻干燥，得到糖类或含糖基化合物抗原，-20°C 保存。2、含羧基类化合物抗原的制备准确称取实施例1中任一含羧基类化合物为O.Olmol、N-羟基琥珀酰亚 (NHS)O. 015mmol、碳二亚胺(EDC)0. 02mol，加入5ml的N-N 二甲基甲酰胺(DMF)溶解，此溶液称为溶液A。溶液A室温搅拌，遮光反应24h ；准确称取牛血清白蛋白(BSA)65mg(0.OOlmmol)，加入 0. 01mol/LpH7. 4PBS 5ml, 此溶液称为溶液B。将反应好的溶液A逐滴加入溶液B中，边加边搅拌，室温搅拌3h，反应结束后，在4°C冰箱中用0. OlM PH7.4PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析后的溶液冷冻干燥，得到羧基类化合物抗原，-20°C保存。3、含羟基类化合物抗原的制备准确称取实施例1中任一羟基类化合物为0. Immol，加5ml 二甲亚砜(DMSO)溶解， 此溶液称为溶液A。0. 15mmol氯乙酸钠加Iml蒸馏水溶解，为溶液B ；pH为10的氢氧化钠溶液为C液。先将溶液B加入A液，在70°C边加边搅拌，然后加入C液，调pH为9 10，反应 IOh ；准确称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)O. 015mmol、碳二亚胺(EDC)O. 02mol、含上述反应物O.Olmol，加入5ml的N-N 二甲基甲酰胺(DMF)溶解，此溶液称为溶液D。溶液D室温， 搅拌，遮光反应Mh;准确称取牛血清白蛋白(BSA)65mg(0.OOlmmol)，加入 0. 01mol/LpH7. 4PBS 5ml, 此溶液称为溶液E。将反应好的溶液D逐滴加入溶液E中，边加边搅拌，室温搅拌3h，反应结束后，在4°C冰箱中用0. OlM PH7.4PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析后的溶液冷冻干燥，得到含羟基类化合物抗原，-20°C保存。4、含醛和酮类化合物抗原的制备准确称取实施例1中任一含醛或酮类化合物0. lmmol，加5ml吡啶溶解，加 0. 15mmol 0-羧甲基羟胺溶液在50°C搅拌反应池，挥干吡啶，加水溶解过滤，得到沉淀物，干燥。准确称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)O. 015mmol、碳二亚胺(EDC)O. 02mol、上述反应物O.Olmol，加入5ml的N-N 二甲基甲酰胺溶解，此溶液称为溶液Α。溶液A室温搅拌，反应 24h ；准确称取牛血清白蛋白(BSA)65mg(0.OOlmmol)，加入 0. 01mol/LpH7. 4PBS 5ml, 此溶液称为溶液B。将反应好的溶液A逐滴加入溶液B中，边加边搅拌，室温搅拌3h，反应结束后，在4°C冰箱中用0. 01MpH7. 4PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析后的溶液冷冻干燥，得到羧基类化合物抗原，-20°C保存。5、多糖与蛋白质可直接作为抗原使用。实施例3 =IgE抗体的制备将实施例2制备的双黄连注射剂各组分的全抗原分别注射新西兰大白兔进行免疫。以黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸的抗原为例。选21只健康雄性新西兰大白兔，分为7组，每组3只。1组注射生理盐水作为对照，另6组分别用上述抗原进行免疫。取浓度lmg. ml—1的上述抗原溶液(用生理盐水溶解)2ml，加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后进行基础免疫，即于兔背部多点注射，每只兔注射2ml (Img)。20d后， 以上述抗原溶液加等量体积弗氏不完全佐剂进行加强免疫，剂量与基础免疫相同。初次免疫后分别于2、4、8、12周共加强免疫4次，第4次免疫后3d，对家兔的耳缘静脉采血，于4°C 冰箱中静置过夜。IgG的分离与纯化取动物血清采用(NH4)2SO4饱和溶液盐析出粗免疫蛋白，再用半透膜除去小分子，过DEAE-52纤维素层析柱，用PH7. 4的PBS洗脱得到纯化的IgG。IgM的分离与纯化继续过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-200Superfine层析柱，以 0. OlMol · L^pHT. 4PBS洗脱，用A28tl值确定IgM浓度，用SDS还原聚丙烯酰胺凝胶鉴定IgM纯度。IgA的分离与纯化再用0. IMol · Ι^ρΗ6. 4PBS液洗脱，收集蛋白峰，即为IgA。再过 SephadexG200 柱，洗液为 0. OlMol · L、H7. 4PBS (0. 14Mol · L4NaCl)，收集洗脱液测 OD280 值，取第一峰即为纯化IgA。IgD的分离与纯化采用GS-I凝集素交联琼脂糖凝胶层析柱，以PBS-CA缓冲液洗柱，监测洗脱液A280值，再用预冷的PBS-CA-GAL缓冲液洗脱IgD，于4°C进行透析精制得 IgD。IgE的分离取DEAE-5210g，加入约15倍量的0. 5mol/L NaOH溶液，浸泡Ih，搅拌。 用布氏漏斗抽滤，超纯水洗涤至滤液接近中性。然后将其浸泡于15倍量的0.5mol/L HCl 溶液中lh，再抽滤，超纯水洗涤至滤液呈中性。再按前述方法用碱液处理，超纯水洗至中性后，将DEAE-52浸泡于起始缓冲液(pH 8. 00. 005mol/L PB缓冲液)中lh，不时搅拌，换几次缓冲液，抽滤，至倾出液的PH值与PB液的pH值相近为止。平衡好后装柱。
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将前述的纯化的血清免疫球蛋白液加入到用pH 8. 00. 005mol/LPB缓冲液平衡好的DEAE-52层析柱中，先用pH 8. 0的0. 005mol/L PB缓冲液洗脱，洗脱液不要，再用pH 8. 00. 025mol/L PB缓冲液洗脱，用20%磺基水杨酸检测蛋白质，呈阳性时，开始收集洗脱液，待检验呈阴性，停止收集，洗脱液用PEG-2000进行浓缩。血清IgE的凝胶层析kphadex G-200提取取l.Og Sephadex G-200于IOOmL超纯水中，在90°C水浴中充分溶胀釙，装柱。注意在水浴溶胀过程中，及时补足超纯水，以免蒸干。将用DEAE-52粗分离的IgE样品加入到用pH 8. 00. 01mol/L PBS缓冲液平衡好的kphadex G-200凝胶层析柱中，以pH 8. 00. Olmol/LPBS缓冲液进行洗脱，用20%磺基水杨酸检测蛋白质，呈阳性时，开始分管收集洗脱液，待检验呈阴性，停止收集，洗脱液用 PEG-2000进行浓缩，于4°C保存或-20°C分装冻存。实施例4 抗IgE抗体的制备参照实施例2的方法，将双黄连注射剂注射新西兰大白兔获得的的IgE以0. Img/ HiL免疫大鼠，方法同免疫新西兰大白兔，达到所需效价后，进行心脏采血。取20ml大鼠血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成20% (NH4)2S04溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min，3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白；在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml，使成50% (MM)2SO4溶液，充分混合， 静置30min，3000r/min离心20min，弃上清；于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加 (MM)2SO4饱和溶液10ml，使成33% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，静置30min，3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白，重复此步骤2 3次；用IOml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4°C透析Mh，中间换液数次。以1%8冗12检查透析液中的S042_或以纳氏试剂检查NH4+ (取3 細1透析液，加试剂1 2滴，出现砖红色即认为有NH4+存在，直至无S042—或 NH4+出现为止；离心去沉淀(去除杂蛋白)，上清液即为粗提抗IgE抗体(即、球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含、球蛋白)；过DEAE-纤维素层析柱，以0. 01mol/L pH7. 4PBS洗脱，收集洗脱液得到纯化的抗IgE抗体IgG ；然后预先准备大鼠抗IgE抗体IgG血清。将抗IgE抗体IgG血清进行双相双扩散，如抗IgE抗体 IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线；测定抗IgE抗体的含量。实施例5 酶标板的制备1、固定已知抗原的酶标板的制备用于固定的已知抗原的制备制备方法同实施例2，只是将制备方法中的“牛血清白蛋白(BSA) 65mg(0. OOlmmol) ” 改为“卵清白蛋白(OVA) 90mg(0. 002mmol) ”。用包被液(每升含159g碳酸钠、29. 3g碳酸氢钠的水溶液，pH9. 6或根据致敏原蛋白的特性选择的活化包被液)适当稀释制备的已知抗原(即用于固定的已知抗原)为 50ng/ml-10ng/ml的浓度，混勻，向侍固定的活化处理过的酶标板微孔内每孔加入100 μ 1 ； 酶标板封膜后4°C下反应过夜；倒掉固定的抗原溶液，洗板，每孔加入250μ 1封闭液(0. 2% 的OVA的PBS缓冲液)，4°C下封闭过夜；倒空封闭液，用洗涤液洗板4次，拍干；将酶标板真空干燥后，密封入带干燥剂的金属箔袋内，在4 °C贮存。根据实施例1分离的双黄连注射剂的化学组分，近20种，酶标板为12X8规格，按已知成分化学成分的拼音字母顺序排列为黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸。2、固定IgE抗体(包括已知与未知)的酶标板的制备方法同上，将已知抗原替换为IgE抗体。根据实施例1分离的双黄连注射剂的化学组分制备特异性抗体，共近20种，以黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、 绿原酸抗原为例，酶标板为12 X 8规格。3、固定抗IgE抗体的酶标板的制备方法同上，将已知抗原替换为抗IgE抗体，酶标板为12X8规格。4、合成抗原及标记物盖芯片板的制备将已知抗原或标记抗原用稀释液溶解并按规律制成盖芯片板。根据实施例1分离的双黄连注射剂的化学组分制备特异性抗体，共近20种，以黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸抗原为例，盖芯片板为12X8规格。实施例6 辣根过氧化物酶标记已知抗原、抗体和抗IgE抗体将实施例2制备的全抗原和实施例4制备的抗IgE抗体进行标记，方法如下(1)称取HRP溶解于Iml蒸馏水中，然后加入0. 2ml新配的0. lmol/LNaI04溶液， 室温下避光搅拌20min ；(2)将上述溶液装入透析袋中，用lmol/L pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜；(3)加20 μ 1 0. 2mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液，调节HRP溶液的pH值升高到 9. 0-9. 5，然后立即在Iml 0. Olmol/L碳酸盐缓冲液中加入已知抗原(抗体或抗IgE抗体)， 室温避光轻轻搅拌2小时；(4)加0. Iml新配的4mg/mL NaBH4,混勻，4°C下再静置2小时;( 将上述溶液装入透析袋中，对0. Olmol/L pH7. 4PBS透析，4°C过夜，如有沉淀
离心弃去；(6)色谱柱中装入 2ml ProteinA-Sepharose 4B Fast Flow ；用 5mlpH3. 0 柠檬酸钠缓冲液清洗柱，接着用10ml pH8. 0的磷酸缓冲液清洗；(7)用Tris调节上述制备的酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)溶液的pH值至8. 0， 以约5ml/h的速度将酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)溶液上柱；(8)用pH8. 0的磷酸缓冲液清洗色谱柱，清洗流出液含非免疫球蛋白等杂蛋白质；(9)用IOml 0. lmol/L的柠檬酸钠缓冲液洗酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)，酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)洗脱后柱用IOml磷酸缓冲液清洗；(10)在280nm处监控洗脱液的吸光度，收集大于基线的馏份，收集的馏份迅速用 2mol · L-ITris 溶液中禾口 ；(11)收集的馏份过PDI0(S^)hadeXG25)柱并用PBS交换洗脱馏份的介质溶液；(12)灭菌后，加入载体蛋白冷冻千燥，收集的酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)，贮存在4C以下的暗处。实施例7 本发明所述芯片固定有实施例2制备的全抗原的酶标板(即实施例5制备的已知抗原酶标板)，规格为12X8，已知抗原的排列按其对应的化学组分英文字母顺序排列。辣根过氧化物酶标记的抗IgE抗体(即实施例6制备的辣根过氧化物酶标记的抗IgE抗体)洗涤液含有占总体积0. 05%的吐温20、pH值为7. 4、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液抗体稀释液含有占总体积0. 的明胶、pH值为7. 4-7. 6、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液TMB显色液每IOml包含4. 2mgTMB的乙二醇溶液终止液2M的硫酸溶液。实施例8 本发明所述芯片固定有实施例3制备的IgE抗体(已知)的酶标板(即实施例5制备的IgE抗体酶标板)，规格为12X8。辣根过氧化物酶标记的抗IgE抗体(即实施例6制备的辣根过氧化物酶标记的抗 IgE抗体)。洗涤液含有占总体积0. 05%的吐温20、pH值为7. 4、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液抗体稀释液含有占总体积0. 的明胶、pH值为7. 4-7. 6、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液TMB显色液每IOml包含4. 2mgTMB的乙二醇溶液终止液2M的硫酸溶液。实施例9 本发明所述芯片固定有实施例3制备的IgE抗体(未知)的酶标板(即实施例5制备的IgE抗体酶标板)，规格为12X8。辣根过氧化物酶标记的已知抗原(即实施例6制备的辣根过氧化物酶标记的已知抗原)。洗涤液含有占总体积0. 05%的吐温20、pH值为7. 4、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液抗体稀释液含有占总体积0. 的明胶、pH值为7. 4-7. 6、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液，TMB显色液每IOml包含4. 2mgTMB的乙二醇溶液终止液2M的硫酸溶液。实施例10 本发明所述芯片固定有实施例3制备的IgE抗体(未知)的酶标板(即实施例5制备的IgE抗体酶标板)，规格为为12X8。辣根过氧化物酶标记的抗体(即实施例6制备的辣根过氧化物酶标记的抗体)洗涤液含有占总体积0. 05%的吐温20、pH值为7. 4、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液抗体稀释液含有占总体积0. 的明胶、pH值为7. 4-7. 6、浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液TMB显色液每IOml包含4. 2mgTMB的乙二醇溶液终止液2M的硫酸溶液。
实施例11 本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法用实施例7所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下将双黄连注射剂引起的致敏血清分别加入到固定有已知抗原的各个检测孔中，每孔100 μ 1，同时以相同加入量将稀释液加入到空白对照中，然后在37°C下孵育45分钟。③加样向芯片板中每孔加入50 μ L的稀释成1 20 4000的待测血样液，室温恒温孵育1. 5h ；④洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min 后拍干，重复三次；⑤向芯片板中每孔加入酶标抗IgE抗体工作液100 μ L，室温恒温孵育 1. 5h ；⑥洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑦加底物量每孔加IOOuL四甲替联苯胺；⑧终止每孔加2mol · L-I硫酸50 μ 1 终止反应；⑨检测用酶标仪测定每孔的吸光度，算得致敏率进行判断。向各个检测孔以及空白对照中分别加入100 μ 1终止液，20分钟内在酶标仪的450nm波长下测出每孔的吸光度值，并与空白对照吸光度值对比，当强度强于空白对照时，则已知抗原对应的双黄连注射剂的化学组分为致敏原。3)结果分析:芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸的孔呈阳性反应，显色；而连翘苷等成分的孔呈阴性反应，不显色。运用此方法筛选出双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸具致敏原性。实施例12 本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法用实施例8所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下①分别向芯片板中每孔加入50 μ L的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷Α、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸全抗原溶液，室温恒温孵育1. 5h ；②洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250uL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；③加样向芯片板中每孔加入50 μ L的稀释成1 20 4000的待测血样液，室温恒温孵育1. ;④洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑤向芯片板中每孔加入酶标抗IgE抗体工作液100 μ L，室温恒温孵育1. 5h ；⑥洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑦加底物量每孔加IOOuL四甲替联苯胺；⑧终止每孔加2mol · L—1硫酸50 μ 1终止反应；⑨检测用酶标仪测定每孔的吸光度， 算得致敏率进行判断。3)结果分析芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸抗体的孔呈阳性反应，显色；而连翘苷等的抗体孔呈阴性反应，不显色。运用此方法筛选出双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸具致敏原性。实施例13 本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法用实施例9所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下①加样分别向芯片板每孔加入含50 μ L的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷Α、连翘酯苷 C、连翘酯苷D、绿原酸酶标记的全抗原溶液，室温恒温孵育1. 5h ；②并设立空白对照，向芯片板每孔只加入50 μ L稀释液，室温恒温孵育1. 5h ；③洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；④加底物量每孔加100 μ L四甲替联苯胺；⑤终止每孔加2mol -Γ1硫酸50 μ 1终止反应；⑥检测用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者进行判断，同时读出致敏成分。3)结果分析:芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸抗体的孔颜色强于空白对照的孔，而连翘苷等成分的抗体孔颜色弱于空白对照孔，运用此方法筛选出双黄连注射液中黄芩苷、 绿原酸具致敏原性。实施例14 本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法用实施例10所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下①分别向芯片板中每孔加入含50 μ L的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、 连翘酯苷D、绿原酸的全抗原溶液，室温恒温孵育1. 5h ；②并设立空白对照，向芯片板每孔只加入含50 μ L稀释液，室温恒温孵育1. 5h ；③洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；④向芯片板中每孔加入酶标抗体工作液 100 μ L，室温恒温孵育1. 5h ；⑤洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑥加底物量每孔加100 μ L四甲替联苯胺；⑦终止每孔加2mol · L—1硫酸50 μ 1终止反应；⑧检测用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者进行判断，同时读出致敏成分。3)结果分析芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸抗体的孔颜色强于空白对照的孔；而连翘苷等成分的抗体孔颜色弱于空白对照孔，运用此方法筛选出双黄连注射液中黄芩苷、 绿原酸具致敏原性。实施例15 本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片法方法(1)筛选致敏原成分盖芯片产品的组成第一种方案a.包被特异性抗IgE抗体的固相载体底芯片；b.黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸的全抗原溶液的盖芯片；c.辣根过氧化物酶标记过的抗体工作液5ml ；d.浓缩磷酸盐缓冲液(PBQ 20ml ；e.浓底物缓冲液5ml ；f.底物储存液2ml 含IOmg · ml-1四甲替联苯胺(TMB)的乙醇液；g.终止液2ml :2mol · L-1硫酸。h. 3 种化合物的致敏者IgE液各1瓶，按浓度需要分别配制系列标准品液。第二种方案a.包被特异性抗IgE抗体的固相载体底芯片；b.辣根过氧化物酶标记过的抗原溶液的盖芯片；c.浓缩磷酸盐缓冲液(PBQ 20ml ；d.浓底物缓冲液5ml ；e.底物储存液anl，含IOmg · ml—1四甲替联苯胺(TMB)的乙醇液；f.终止液2ml :2mol · L—1硫酸； g. 3种化合物的致敏者IgE液各1瓶，按浓度需要分别配制系列标准品液。第一种方案①加样向底芯片板中每孔加入50 yL的按1 20 2000稀释的待测血样溶液，室温恒温孵育1. 5h ；②洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250uL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；③向芯片板加入含50 μ L的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷 Α、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸的全抗原盖芯片，底芯片与盖芯片每孔一一对应，压紧， 扎破盖芯孔，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，室温恒温孵育1. 5h，去掉盖芯片；④洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑤向芯片板中每孔加入酶标抗体工作液100 μ L，室温恒温孵育1. 5h ；⑥洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑦加底物量每孔加100 μ L 四甲替联苯胺；⑧终止每孔加2mol -Γ1硫酸50 μ 1终止反应；⑨检测用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者进行判断，同时读出致敏成分。第二种方案①加样向底芯片板中每孔加入50 yL的按1 20 2000稀释的待测血样溶液，室温恒温孵育1. 5h ；②洗涤倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250uL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；③向芯片板加入含50 μ L的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷Α、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸的标记抗原盖芯片，底芯片与盖芯片每孔一一对应，压紧，扎破盖芯孔，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，室温恒温孵育1.证，去掉盖芯片；④洗涤 倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250 μ L的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑤加底物量每孔加100 μ L四甲替联苯胺；⑥终止每孔加2mol ·厂1硫酸50 μ 1终止反应；⑦检测用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者进行判断，同时读出致敏成分。3)结果分析芯片中加入血样，黄芩苷、绿原酸标记抗原(抗体)孔呈阳性反应，显色；而连翘苷等成分标记抗原(抗体)的孔呈阴性反应，不显色。故双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸为致敏原。实施例16 本发明所述检测中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法方法为了避免中药注射剂化学组分分离的遗漏，本实施例用实施例5包被的特异性抗 IgE抗体的芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下检测步骤①按中药注射剂成分建立指纹图谱分析条件，并进行方法学分析，用已知标准成分建立成分标准曲线；②加样向孔中加入50μ L的按1 20 2000稀释的待测血样溶液，室温恒温孵育1. 5h ；③洗涤倾出孔中液体，向孔加入250uL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次； ④加入中药注射剂液，室温恒温孵育1. 5h ；⑤测定吸出孔中未吸附成分液体，采用HPLC、 HPLC/MS等技术测定指纹图谱进行特征峰面积。3)结果分析根据中药注射剂指纹图谱特征峰前后变化作出是否为致敏成分的判断。采用本方法对双黄连注射剂的致敏成分进行筛查，其结果如下①HPLC检测条件=C18柱(250mmX4. 6mm, 5 μ m),流动相乙腈1 %醋酸水溶液； 梯度洗脱0min(8 92)—15min(15 85)—25min(25 75) ^35min(70 30) — 40min(80 20)—45min(8 92) ；UV 检测波长:0min_15min，324nm ;15min_45min，274匪；流速 ImL .mirT1 ； 柱温25°C ；进样量10 μ L。将收集到的未结合液体与双黄连注射剂分别进行HPLC检测， 根据与双黄连注射剂指纹图谱特征峰差异确定其致敏成分；未结合液体与双黄连注射剂的谱图见图1、图2，具体结果见表1。表1特异性IgE对双黄连注射剂中特征峰(成分)吸附影响
权利要求
1.一种中药注射剂致敏原的综合检测方法，其特征在于，包括(1)分离中药注射剂的成分，将各成分或各成分合成全抗原所产生的特异性抗体IgA、 IgD、IgE、IgG、IgM按一定规律包埋抗原或抗体成底芯片点阵，与经中药注射剂致敏的人或动物中的特异性IgE结合，再与标记好的抗人或抗动物IgE抗体显色，根据显色强、弱、有、 无，由底芯片成分判断中药注射剂对人或动物致敏成分及IgE ；(2)包埋抗IgE抗体制成底芯片，捕获拟用或使用过中药注射剂的人或动物血液中的 IgE，再与由中药注射剂已知结构成分抗原的标记物盖芯片，或与由中药注射剂已知结构成分作抗原，注射到动物体内产生特异性抗体IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，的标记物有规律排列构成的盖芯片反应，根据显色强、弱、有、无，由盖芯片成分判断中药注射剂对人或动物致敏成分及IgE ；(3)包埋抗IgE抗体，捕获拟用或使用过中药注射剂的人或动物血液中的IgE，再与中药注射剂液、含药血清反应，采用HPLC、HPLC/MS、GC/MS测定，比较反应前后相应指纹图谱的差异确定中药注射剂对人或动物致敏成分及IgE ；(4)综合上述分析，最终确定中药注射剂对人或动物产生致敏的成分及特异性的IgE。
2.—种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，其特征在于，包括步骤1 分离中药注射剂的各成分，直接或与蛋白质化学合成为全抗原；步骤2 将中药注射剂的各个成分的全抗原按顺序固定于固体支持物制成芯片，向每个检测孔加入待测血清，同时设立空白对照，加入稀释液；孵育，洗去未结合物质；步骤3 加入酶标记的抗IgE抗体，孵育，洗去未结合物质；步骤4 显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强度强于空白对照时， 则检测孔中对应的抗原可能为中药注射剂的致敏原。
3.—种中药注射剂致敏原的底芯片检测方法，其特征在于，包括步骤1、中药注射剂的各成分的合成全抗原的特异性抗体IgE按顺序固定于固体支持物制成芯片，向每个检测孔加入中药注射剂成分的合成全抗原溶液；同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；步骤2、在检测孔中加入待测血清，孵育，洗去未结合物质；步骤3、在检测孔中加入酶标抗IgE抗体，孵育，洗去未结合物质；步骤4、显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强于空白对照时，则检测孔中特异性抗体对应的抗原为致敏原。
4.一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，其特征在于，包括步骤1、中药注射剂使用致敏者的特异性IgE抗体按顺序固定于固体支持物制成芯片， 向每个检测孔加入酶标记的对应合成抗原；同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；步骤2、显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强于空白对照时，则检测孔中特异性抗体对应的抗原可能为致敏原。
5.一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，其特征在于，包括步骤1、中药注射剂使用致敏者的特异性抗体IgE按顺序固定于固体支持物制成芯片， 向每个检测孔加入中药注射剂成分的合成抗原溶液；同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；步骤2、在检测孔中加入酶标抗体，孵育，洗去未结合物质；步骤3、显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔吸光度强于空白对照为阳性，根据强弱程度确定致敏强度，根据所对应的IgE抗体可确定原注射剂中的致敏成分。
6.一种中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法检测方法，其特征在于，包括步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成芯片，加待测血清液至检测孔中，孵育，洗去未结合物质；步骤2、加中药注射剂或含药血清孵育，洗去未结合物质；步骤3、收集未结合物质，采用GC/MS或HPLC/MS对未结合物质和中药注射剂进行指纹图谱分析，根据指纹图谱特征峰差异确定中药注射剂中的致敏成分。
7.—种中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法检测方法，其特征在于，包括步骤1、将中药注射剂使用致敏者的特异性IgE抗体固定于固体支持物制成芯片； 步骤2、加中药注射剂或含药血清孵育，洗去未结合物质；步骤3、收集未结合物质，采用GC/MS或HPLC/MS对未结合物质和中药注射剂进行指纹图谱分析，根据指纹图谱特征峰差异确定中药注射剂中的致敏成分。
8.—种中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片对应检测方法，其特征在于，包括 步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成底芯片，加待测血清液至检测孔中，孵育，洗去未结合物质；步骤2、将中药注射剂的各成分的酶标全抗原进行做成盖芯片； 步骤3、底芯片与盖芯片的孔一一对应，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，孵育，洗去未结合物质；步骤4、加底物显色，显色孔中对应的盖芯片标记抗原为致敏原。
9.一种中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片对应检测方法，其特征在于，包括 步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成底芯片，加待测血清液至检测孔中，孵育，洗去未结合物质；步骤2、将中药注射剂的各成分的全抗原进行做成盖芯片；步骤3、底芯片与盖芯片的孔一一对应，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，孵育，洗去未结合物质；步骤4、加入对应的酶标抗体孵育，洗去未结合物质； 步骤5、加底物显色，显色孔中对应的盖芯片抗原为致敏原。
10.根据权利要求1-9任一项所述中药注射剂致敏原的检测方法，其特征在于，所述的抗原、抗体的标记方法可采用荧光标记法、酶标记、放射性核素及化学发光标记。
全文摘要
本发明涉及免疫学与中药学领域，公开了一种中药注射剂致敏原的综合检测方法。本发明是基于ELISA原理与指纹图谱差异性分析相结合技术，利用固相载体包埋抗原、IgE抗体或抗IgE抗体的免疫反应，分别采用中药注射剂成分抗原与标记抗IgE抗体、包埋IgE抗体与标记抗原、包埋IgE抗体与已知合成抗原，再与酶标抗体、包埋抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再与标记抗原或抗原与标记抗体等形式的标记免疫反应；捕获IgE抗体对中药注射剂GC/MS、HPLC/MS指纹图谱差异分析，综合多方面信息来确定中药注射剂致敏的人与动物血样中的特异IgE及对应的致敏原。本发明所述中药注射剂的检测方法具有高特异性、高灵敏度和高效性，操作简单方便的特点，适用于多成分的同时检测，可有效防治漏查。
文档编号G01N33/543GK102353771SQ20111017152
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者刘文龙, 唐昱, 戴儒文, 曾姣丽, 石继连, 贺福元, 邓凯文, 邱云, 陈锋 申请人:湖南中医药大学
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