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专利名称：检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂，具体地涉及一种用于检测可溶性表氧化物水解酶活性的试剂，该试剂通过荧光检测可以测定细胞或组织中可溶性表氧化物水解酶活性。
背景技术：
可溶性表氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase, sEH,又称EPXH2)广泛存在于哺乳动物中，在肝脏、肾脏、肺、心脏、脑、脾脏、血管内皮和平滑肌等多个组织器官中都有分布；sHl蛋白是由两个大小为62kD的单体组成的同源二聚体，每个单体的N端和C端具有不同的酶活性，N端具有磷酸酶活性，C端具有表氧化物水解酶的活性，可以水解表氧化脂肪酸或其它表氧化物，将其转化为相应二醇，从而降低表氧化物的化学反应性，增加其水溶性，改变它们的生物活性(Newman Jff7Prog Lipid Res，2005 ;44 :1-5)。sHl的C端活性在多种疾病过程中发挥着关键的调节作用，抑制其活性可以降低血管紧张素2所导致的高血压(Imig JD, Hypertension, 2002 ;39 :690-94)、心肌肥大(Ai D, Proc Natl Acad Sci USA, 2009 ;106 :564-69)、动脉粥样硬化(Ulu A, J Cardiovasc Pharmacol, 2008 ；52 :314-23) 等，因而测定细胞及组织中的sHl活性对于相关疾病的研究及药物的开发具有至关重要的作用。目前测定sEHC端活性的方法主要有以下几种通过LC/MS/MS或ELISA的方法检测体液、尿液、血液、细胞裂解液或上清及组织匀浆中的sEH内源性底物EETs与产物 DHETs 的比例来反映 sEH 的活性(Nithipatikom K, Analytical Biochemistry, 2001 ;298， 327-336, Newman Jff, Prog Lipid Res，2002 ;43，1563-78);或将细胞裂解液与 EETs 或放射性标记的sHl底物孵育，检测产物生成量从而测定sHl的活性(Liu Y,Proc Natl Acad Sci USA，2005 ; 102，16747-52，Ai D, Proc Natl Acad Sci USA，2009 ; 106 :564-69)。这些方法中EETs及DHETs不稳定，极易氧化和降解且含量较低，对于实验条件和仪器设备要求高，而使用放射性物质，易造成污染或对人体伤害，因而限制了其应用。Nicola M. Wolf等人报道可以使用PHOME等化合物作为sHl的底物，高通量地评估 sEH 抑制剂的效果(WolfNM, Analytical Biochemistry, 2006 ；355 :71-80) 这类化合物被 sEH作用后的产物可以被激发出荧光，而化合物本身并不能被激发荧光，但此方法只被用于体外检测重组纯化sEH的活性。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂。本发明的又一目的在于提供一种制备上述试剂的方法。为实现上述目的，本发明提供的检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂，由裂解液、检测缓冲溶液、检测底物溶液和Sffi抑制剂溶液组成；通过下述方法制备得到裂解液包括低渗溶液和苯甲基磺酰氟溶液，其中
低渗溶液可以采用去离子水，也可以是如下配制的低渗溶液将三羟甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化镁15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；本发明优选的低渗溶液是去离子水。苯甲基磺酰氟溶液将苯甲基磺酰氟溶于异丙醇中，浓度为IOOmM ；苯甲基磺酰氟溶液与低渗溶液的体积比为1/1000 1/100 ；检测缓冲溶液将三羟甲基氨基甲烷溶解至水中，浓度为50禮，调节pH至
6.8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量为O. 1-0. 3mg/ml ；检测底物溶液将Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亚砜中配成5mM的溶液；sHl抑制剂溶液将sHl抑制剂溶解至二甲基亚砜中，配成IOmM的溶液。本发明提供的制备上述试剂的方法，其主要包括I)制备裂解液，所述裂解液包括低渗溶液和苯甲基磺酰氟溶液低渗溶液可以采用去离子水，也可以是如下配制的低渗溶液将三羟甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化镁15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至100ml，存放于 4。。；本发明优选的低渗溶液是去离子水；2)苯甲基磺酰氟溶液将苯甲基磺酰氟溶于异丙醇中，浓度为lOOmM，存放于-20°C至 4°C ；苯甲基磺酰氟溶液与低渗溶液的体积比为1/1000 1/100 ；3)检测缓冲溶液将三羟甲基氨基甲烷溶解至水中，浓度为50mM，调节pH至
6.8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量为O. 1-0. 3mg/ml，存放于4°C ；4)检测底物溶液将Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亚砜中配成5mM的溶液，存放于-20。。；5) sHl抑制剂溶液将sHl抑制剂溶解至二甲基亚砜中，配成IOmM的溶液，存放于-20 0C ο所述的sE；H抑制剂为12-(3-金刚烧-I-基-服基)_正十二烧酸[12-(3_adama ntan-l-yl-ureido) -dodecanoic acid, AUDA]、反式 _4-[4-(3_ 金刚烧-I-基-服基)-环己氧基]-苯甲酸{trans-4- [4- (3-Adamantan-l-yl-ureido) -cyclohexyloxy] -benzoic acid、t-AUCB}或1-(1-甲磺酰哌唳_4_基)-3-(4-三氟甲氧基苯基)-尿素[l-(l_methy lsulfonyl-piperidin-4-yl)-3-(4-trifluoromethoxy-phenyl)-urea, TUP S]。本发明的优点是I)利用该试剂的检测方法快速，简便易行，可以进行高通量检测。样本处理方法简单，除裂解液不同外，其它与普通蛋白提取方法无异，反应过程为酶促反应，无高难度技术， 可操作性强；操作中所使用试剂为无毒或低毒物品，不存在放射性，不会造成污染及对操作者的伤害；样本处理之后整个反应过程用时不超过I小时，检测快捷；使用96孔板，一次可检测40多个样本，方便大样本检测，且样品用量少。2)实现了组织特异的sEH活性检测。以往的检测方法多是检测纯品sEH活性，或通过检测EETs与DHETs的比值，间接反映sHl的活性，但EETs或DHETs都不稳定，在样本保存和提取过程中，容易被氧化降解，使方法准确性降低。而本方法则可直接检测组织中sEH 的活性，对于药物的研发和sEH在不同疾病模型中的作用评估提供了更为便捷的条件。


图I是小鼠肝脏和肾脏sEH活性测定加样示意图；图中的标记说明如下 空白对照； 肝脏裂解上清；·肝脏裂解上清+sEH抑制剂；@肾脏裂解上清； 肾脏裂解上清+sEH抑制剂。图2是小鼠肝脏sEH活性-反应时间曲线；图3是小鼠肾脏sEH活性-反应时间曲线；图4是sEH抑制剂tAUCB饮水给药对小鼠肝脏sEH活性的抑制效果；图5是sHl抑制剂tAUCB饮水给药对小鼠肾脏sEH活性的抑制效果；图6是HEK293细胞sHl活性测定加样示意图；图中的标记说明如下 空白对照；_细胞裂解上清；·细胞裂解上清+sEH抑制剂；图7是HEK293细胞sHl活性-反应时间曲线； 图8是sHl抑制剂tAUCB对HEK293细胞中sHl活性的抑制效果；图9是HEK293细胞过表达sHl后活性测定结果。
具体实施例方式本发明通过检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂而建立一种稳定可靠、简便易行的检测细胞和组织中sHl活性的方法。利用该试剂的方法基本原理是将细胞用低渗溶液通过低渗裂解，或组织通过匀浆器匀浆，离心，去除细胞及组织碎片，裂解液进行蛋白定量，取同等量的蛋白在96孔板的孔中与一种表氧化物Epoxy fluor 7反应，Epoxy fluor 7可以作为sHl底物，被sHl水解后，通过荧光酶标仪在330nm 的波长下被激发出荧光，在465nm处可以检测到荧光强度，通过该强度来判断此酶促反应的速率，体现sEH的酶活性高低。该检测试剂的制备如下I、溶液配制I)裂解液低渗溶液+苯甲基磺酰氟(PMSF)低渗溶液是将三羟甲基氨基甲烷(Tris) 55-65毫克、氯化镁(MgCl2) 15-25毫克、 乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA) 35-40毫克、乙二胺四乙酸(EDTA) 3_5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；低渗溶液也可以直接用去离子水。2)检测缓冲液50mM Tris中按O. 2mg/ml加入牛血清白蛋白(BSA), pH = 6. 8-7. 3，存放于 4°C ；3)检测底物Epoxy Fluor 7溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成5mM的储存液，存放于-20。。；4) sHl 抑制剂12-(3-金刚烷-I-基-脲基)_ 正十二烷酸[12-(3-adamantan-1-yl-ureido) -dodecanoic acid, AUDA]、反式 _4-[4-(3_ 金刚烧-I-基-服基)-环己氧基]-苯甲酸{trans-4-[4- (3-Adamantan-l-yl-ureido) -cyclohexyloxy] -benzoic acid、 t-AUCB}或1-(1-甲磺酰哌唳-4-基)-3-(4-三氟甲氧基苯基)-尿素[I-(1-methylsulf onyl-piperidin-4-yl) -3-(4-trifluoromethoxy-phenyl) -urea, TUP S]溶于 DMSO 中配成 IOmM的储存液，存放于_20°C2、样本处理I)细胞样本6孔板、12孔板或24孔板细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，吸净 PBS,加入200-100ul裂解液，冰上静置20分钟，让细胞由于处于低渗环境吸水胀裂，随后将细胞刮下，收集到EP管中，用271/4G注射器针头反复抽吸15次，使胞浆蛋白充分释放入裂解液。2)组织样本取约10-15ug组织，加入200ul裂解液，通过匀浆器匀浆，将匀浆液收集到EP管中。细胞裂解液或组织匀浆液4°C，12000RCF离心lOmin，取上清至新EP管中，BCA蛋
白定量。3、检测过程I)抑制剂孵育将每个样品分为两份，一份为纯样品组，一份为sEH抑制组。sEH抑制剂工作液配制sHl抑制剂用去离子水稀释至200uM ;取同等量的去离子水，加入与抑制剂溶液相同体积的DMS0，配制成对照溶液。分别取IOul sHl抑制剂工作液和对照溶液加入至costar 96孔黑色酶标板相应的孔中；取50或IOOug细胞或组织蛋白分别加入至加有sHl抑制剂或对照溶液的孔中， 用裂解液补足总体积至lOOul，震荡混匀，30°C孵育lOmin。用检测缓冲液稀释检测底物至 80uM，取IOOul加入costar 96孔黑色酶标板相应的样品孔中，震荡混匀，读取荧光强度。检测条件突光酶标仪，激发波长330nm,发射波长465nm,缝宽20nm,温度设定 300C，顶部检测。每5分钟读值一次，共30分钟。或在30°C孵育30分钟，读取荧光强度。3)酶活性的表示方法酶活性最终以相对荧光强度表示，即以纯样品孔的荧光强度值减去相应的sEH抑制孔的荧光强度值。根据不同时间点的相对荧光值绘制出反应曲线或柱状图。以下结合附图和实施例对本发明利用该试剂检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的效果作进一步的描述。实施例II、溶液配制I)裂解液 5ml :去离子水 4. 95ml+100mM PMSF50ul ；2)检测缓冲液50mM Tris+0. 2mg/ml BSA, pH 7. 0，存放于 4°C ；3)检测底物Epoxy Fluor 7溶于DMSO中配成5mM的储存液，存放于_20°C ；4) sEH抑制剂t-AUCB溶于DMSO中配成IOmM的储存液，存放于_20°C ；2、样本l)sHl抑制剂tAUCB溶于PEG400中，配成4mg/ml的溶液。8周大C57BL/6小鼠11 只，随机分成两组，一组6只，给予sHl抑制剂tAUCB加入到饮水中，使浓度为20mg/L，另一组5只，加入相同体积的溶剂PEG400至饮水中。小鼠自由饮食、饮水。
2)给药4天后，将小鼠麻醉，右心室取血后，自左心室使用生理盐水灌流，之后取肝脏和肾脏组织，液氮速冻，之后冻于-80°C，用于后续实验分析。分别取适量肝脏或肾脏组织，加入裂解液200ul，玻璃匀浆器冰上匀浆。之后将组织匀浆转移至I. 5mlEP管中，使用 Eppendorf离心机,4°C, 12000RCF离心IOmin,吸取上清至新的EP管中。3)使用BCA定量法，对组织匀浆上清进行蛋白定量。3、检测I)将DMSO溶解的IOmM的sHl抑制剂tAUCB取IOul溶解至490ul的去离子水中， 配成200uM的抑制剂溶液。再取IOul DMSO溶解至490ul去离子水中，配成对照溶液。2)取96孔黑色酶标板，在相应的孔中分别加入IOul对照溶液或10ul200uM的sHl 抑制剂。计算组织匀浆上清的蛋白浓度，取IOOug蛋白分别加入至对照溶液和sHl抑制剂孔中，用裂解液补足总体积至lOOul，吹吸混匀每个孔中的溶液。空白对照孔加入IOul对照溶液和90ul裂解液，混匀。30°C孵育10分钟。3)荧光酶标仪设置激发波长330nm，发射波长465nm，缝宽20nm，温度设定30°C， 顶部读值。每5分钟读值一次，共30分钟。4)稀释检测底物，取160ul 5mM的Epoxy Fluor 7溶解至9. 84ml检测缓冲液中， 配成80uM的底物溶液，在步骤2配制的每个样本孔和空白孔分别加入IOOul底物溶液，迅速震荡混匀，酶标仪下读值。4、计算酶活性将平行孔的荧光强度读值取平均值，用对照溶液孔的荧光强度值减去相应的抑制剂孔荧光强度值，得到相对的荧光强度值，用此表示sEH的酶活性。绘制以反应时间为横坐标，相对荧光强度为纵坐标的曲线，可以看到反应速率的变化(图2、图3)。酶活性也可以以反应30分钟时的相对突光强度表不(图4、图5)。实施例2I、溶液配制I)先配制低渗溶液将三羟甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化镁15_25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；取低渗溶液2. 475ml，加入浓度为IOOmM的PMSF 25ul，制成裂解液5ml ；2)检测缓冲液50mM Tris+0. 2mg/ml BSA, pH 7. 0，存放于 4°C ；3)检测底物Epoxy Fluor 7溶于DMSO中配成5mM的储存液，存放于_20°C4) sEH抑制剂t-AUCB溶于DMSO中配成IOmM的储存液，存放于_20°C2、样本I)细胞培养与处理人胚胎肾293细胞系，铺于6cm细胞培养皿中，细胞80%融合，换液，给予处理。共分4组，每组3个平行处理。第一组溶剂DMS0I 1000 ；第二组sHl抑制剂t_AUCB I 1000，终浓度为 IOuM ;第三组对照腺病毒Ad_GFP 20moi ；第四组腺病毒过表达sEH Ad-sEH 20moi ；37°C,5% CO2 培养 24 小时。
2)细胞弃去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，将残留PBS吸净，每个皿加入 200ul裂解液，冰上放置20min，刮取细胞收于EP管中，使用271/4G注射器针头反复吹吸15 次，40C，12000RCF离心lOmin，吸取上清至新的EP管中。3)使用BCA定量法，对裂解上清进行蛋白定量。3、检测I)将DMSO溶解的IOmM的sHl抑制剂tAUCB取2ul溶解至98ul的去离子水中，配成200uM的抑制剂溶液。再取2ul DMSO溶解至98ul去离子水中，配成对照溶液。2)取96孔黑色酶标板，在相应的孔中分别加入IOul对照溶液或10ul200uM的SEH 抑制剂。计算细胞裂解上清的蛋白浓度，取IOOug蛋白分别加入至对照溶液和sHl抑制剂孔中，用裂解液补足总体积至lOOul，吹吸混匀每个孔中的溶液。空白对照孔加入IOul对照溶液和90ul裂解液，混匀，30°C孵育10分钟。(图6)3)荧光酶标仪设置激发波长330nm，发射波长465nm，缝宽20nm，温度设定30°C， 顶部读值。每5分钟读值一次，共30分钟。4)稀释检测底物，取48ul 5mM的Epoxy Fluor 7溶解至2. 952ml检测缓冲液中， 配成80uM的底物溶液，在步骤2配制的每个样本孔和空白孔分别加入IOOul底物溶液，迅速震荡混匀，酶标仪下读值。4、计算酶活性将平行孔的荧光强度读值取平均值，用对照溶液孔的荧光强度值减去相应的抑制剂孔荧光强度值，得到相对的荧光强度值，用此表示sEH的酶活性。绘制以反应时间为横坐标，相对荧光强度为纵坐标的曲线，可以看到反应速率的变化(图7、图8、图9)。
权利要求
1.一种检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂，由裂解液、检测缓冲溶液、检测底物溶液和SHl抑制剂溶液组成；通过下述方法制备得到裂解液包括低渗溶液和苯甲基磺酰氟溶液，其中低渗溶液为去离子水，或按如下配制将三羟甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化镁15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸35-40 毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；苯甲基磺酰氟溶液将苯甲基磺酰氟溶于异丙醇中，浓度为IOOmM ；苯甲基磺酰氟溶液与低渗溶液的体积比为1/1000 1/100 ；检测缓冲溶液将三羟甲基氨基甲烷溶解至水中，浓度为50禮，调节pH至6. 8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量为O. 1-0. 3mg/ml ；检测底物溶液将Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亚砜中配成5mM的溶液； sEH抑制剂溶液将sHl抑制剂溶解至二甲基亚砜中，配成IOmM的溶液。
2.根据权利要求I所述的试剂，其中，低渗溶液为去离子水。
3.根据权利要求I所述的试剂，其中，所述sEH抑制剂为12-(3-金刚烷-I-基-脲基)-正十二烷酸、反式-4-[4- (3-金刚烷-I-基-脲基)-环己氧基]-苯甲酸或I- (I-甲磺酰哌啶-4-基)-3- (4-三氟甲氧基苯基)-尿素。
4.权利要求I所述试剂的制备方法，其主要包括1)制备裂解液，所述裂解液包括低渗溶液和苯甲基磺酰氟溶液低渗溶液为去离子水，或按如下配制将三羟甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化镁15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸35-40 毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至100ml，存放于4°C ；2)苯甲基磺酰氟溶液将苯甲基磺酰氟溶于异丙醇中，浓度为IOOmM,存放于-20°C至4 0C ；苯甲基磺酰氟溶液与低渗溶液的体积比为1/1000 1/100 ；3)检测缓冲溶液将三羟甲基氨基甲烷溶解至水中，浓度为50禮，调节pH至6.8-7. 3， 加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量为O. 1-0. 3mg/ml，存放于4°C ；4)检测底物溶液JfEpoxyFluor 7溶解至二甲基亚砜中配成5mM的溶液，存放于-20 0C ；5)sHl抑制剂溶液将sHl抑制剂溶解至二甲基亚砜中，配成IOmM的溶液，存放于-20 0C ο
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，低渗溶液为去离子水。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述sHl抑制剂为12-(3-金刚烷-I-基-脲基)-正十二烷酸、反式-4-[4- (3-金刚烷-I-基-脲基)-环己氧基]-苯甲酸或I- (I-甲磺酰哌啶-4-基)-3- (4-三氟甲氧基苯基)-尿素。
全文摘要
一种检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂，由裂解液、检测缓冲溶液、检测底物溶液和sEH抑制剂溶液组成。本发明还提供了制备上述试剂的方法。
文档编号G01N21/64GK102608081SQ201110330608
公开日2012年7月25日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者何金龙, 刘燕, 朱毅, 李楠 申请人:北京大学