专利名称：甘草药材五波长融合法同时测定九种成分含量的控制方法
技术领域：
本发明属于采用现代分析检测手段和计算机信息融合方法检测中药材内在质量的技术领域，涉及中药材质量的控制方法，特别涉及甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法。
背景技术：
据中华人民共和国药典2010年版一部记载本品为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。始载于《神农本草经》列为“上品”。甘草性味甘平，药用历史悠久，是最常用的中草药品种。甘草为朴气类药，具有补益中气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、缓和药性之功。临床主要用于肾上腺皮质功能低下症、消化性溃疡、病毒性肝炎、呼吸系统感染、皮肤炎症、尿崩症和艾滋病等疾病的治疗。据现有资料报道，国内外已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物，60多种三萜类化合物以及香豆素类，18种氨基酸，多种生物碱等。甘草中主要含有黄酮类成分和三萜类成分，其中，黄酮类成分主要有甘草苷、异甘草苷、 芹糖基甘草苷等；三萜类成分主要有甘草酸、甘草次酸及其盐等。随着高效液相色谱二级管阵列检测器的普及，对同一样品可以实现多波长同时检测多种成分，对被检成分分别采用其最大紫外吸收波长绘制各自色谱图，以最大峰面积覆盖融合，使其成为一张可以同时反映多个波长下信息的谱图，此方法简便实用，可成为中药全面质量评价的重要手段。信息融合技术是协同利用多源信息，以获得对同一事物或目标的更客观、更本质认识的信息综合处理技术，它比直接从各信息源得到的信息更全面，对事物的评价更客观、更有价值。由于甘草药材含有多种有效成分，显然仅采用单一波长检测是无法实现对甘草多种化学成分的整体表达和全面评价。因此，本研究采用RP-HPLC-DAD对甘草药材中上述多种有效成分建立多特征吸收波长HPLC色谱图，并遵循信息最大化原则建立其融合谱，实现了对甘草药材的宏观定性和定量评价。近年来通过建立色谱图对中药材多种指标成分同时进行含量测定成为中药质量控制和评价的一种发展趋势。本研究对同一样品中不同组分、多波长同时定量，对中药质量评价具有现实意义。甘草药材在中药材中占有比较重要的地位。目前，市售的甘草药材质量参差不齐， 因此甘草药材内在质量稳定可靠性难以保证。2010版中国药典规定的含量测定本品按干燥品计算，含甘草苷不得少于0. 50% ;甘草酸以甘草酸铵计不得少于2. 0%。
发明内容
本发明的目的，在于采用现代分析检测手段和计算机信息融合方法建立甘草药材全时段五波长融合谱，以该融合谱为基�。云�9种指标成分进行含量测定的方法，以确保甘草药材的内在质量更加稳定、可靠。采用的技术方案是
甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，包括如下工艺
3步骤
(1)供试品溶液的制备取甘草药材粉末约5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入水IOOmL,称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过， 精密吸取续滤液20mL，加在AB-8树脂柱上，用蒸馏水120mL洗涤，再用100mL95%乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加20%乙腈使溶解并转移至IOmL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备精密称取疗糖基甘草昔对照品、甘草昔对照品、疗糖基异甘草苷、芒柄花苷对照品、异甘草苷对照品、甘草素对照品、毛蕊异黄酮对照品、异甘草素对照品和甘草酸单铵盐对照品适量，加甲醇分别制成每ImL含芹糖基甘草苷对照品4. 8159mg、甘草苷对照品8. 8425mg、芹糖基异甘草苷对照品2. 3482mg、芒柄花苷对照品I. 9803mg、异甘草苷对照品2. 4075mg、甘草素对照品3. 0825mg、毛蕊异黄酮对照品0. 8775mg、异甘草素对照品0. 5625mg和甘草酸单铵盐对照品4. 5225mg的溶液，分别吸取各对照品一定量制成混合对照品，即得；
(3)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂的AgilentTC-C18色谱柱；以0. 4%。甲酸水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱OlOmin为20°/T21%B， 10 20min 为 21% 25%B，20 30min 为 25% 32%B，30 45min 为 32% 46%B，45 60min 为 46% 47%B ;流速1. OmL/min ;柱温 30°C ;DAD检测器在波长 248nm、250nm、276nm、362nm、370nm 下同时进行检测；进样量IOu L ;理论塔板数计算，应不低于3000 ；
(4)全时段五波长融合法采用全时段五波长融合法将248nm、250nm、276nm、362nm、 370nm五个波长下的谱图数据进行有效融合，得到一张能够同时反映五个波长信息的融合P曰。(5)样品含量测定应用融合后的谱图数据，计算样品中9种指标成分的含量。(6)对上述确定的含量测定方法对专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性、 范围以及耐用性评价。本发明所述的甘草药材质量控制方法，得到的谱图数据，可以用于甘草药材的指纹定性分析。本发明所述的甘草药材质量控制方法，得到的谱图数据，可以用于甘草药材9种指标成分的定量分析。本发明所具有的积极效果在于
(I)本发明首次公开通过建立甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，此方法对甘草药材九种指标成分的五个波长同时定性定量分析，从而更有效地对甘草药材内在质量进行监测、评价与控制。(2)本发明通过计算机信息融合方法将甘草药材色谱图进行全时段五波长融合， 遵循最大信息化原则，获得一张同时反映五个波长信息的融合谱。(3)本发明的质量控制方法，其优点是操作简单，稳定可靠，精密度、重复性、回收率均达到定量分析要求，确保中药在安全、有效的前提下，保证中药质量均一性和疗效稳定性。(4)本发明通过建立甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，对甘草药材中的九种指标成分进行定性和定量分析，较全面真实地反映甘草
4药材的内在品质，是一种合理、有效的质量控制方法，从而保证了甘草药材的安全、可靠、稳定、优质，确保了其质量的均衡稳定和工艺的规范化。
图I是248nm波长下对照品芹糖基甘草苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮、异甘草素、甘草酸单铵盐的色谱图。图2是250nm波长下对照品芹糖基甘草苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮、异甘草素、甘草酸单铵盐的色谱图。图3是276nm波长下对照品芹糖基甘草苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮、异甘草素、甘草酸单铵盐的色谱图。图4是362nm波长下对照品芹糖基甘草苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮、异甘草素、甘草酸单铵盐的色谱图。图5是370nm波长下对照品芹糖基甘草苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮、异甘草素、甘草酸单铵盐的色谱图。图6是芹糖基甘草苷的紫外扫描图。
图7是甘草苷的紫外扫描图。
图8是芹糖基异甘草苷的紫外扫描图。
图9是芒柄花苷的紫外扫描图。
图10是异甘草苷的紫外扫描图。
图11是甘草素的紫外扫描图。
图12是毛蕊异黄酮的紫外扫描图。
图13是异甘草素的紫外扫描图。
图14是甘草酸单铵盐的紫外扫描图。
图15是甘草药材248nm波长下HPLC色谱图。
图16是甘草药材250nm波长下HPLC色谱图。
图17是甘草药材276nm波长下HPLC色谱图。
图18是甘草药材362nm波长下HPLC色谱图。
图19是甘草药材370nm波长下HPLC色谱图。
图20是甘草药材全时段五波长融合的色谱图及融合峰。
具体实施方式
实施例I
甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，包括如下工艺步骤
(I)供试品溶液的制备取甘草药材粉末约5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入水IOOmL,称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过， 精密吸取续滤液20mL，加在AB-8树脂柱上，用蒸馏水120mL洗涤，再用100mL95%乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加20%乙腈使溶解并转移至IOmL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液的制备精密称取疗糖基甘草昔对照品、甘草昔对照品、疗糖基异甘草苷、芒柄花苷对照品、异甘草苷对照品、甘草素对照品、毛蕊异黄酮对照品、异甘草素对照品和甘草酸单铵盐对照品适量，加甲醇分别制成每ImL含芹糖基甘草苷对照品4. 8159mg、甘草苷对照品8. 8425mg、芹糖基异甘草苷对照品2. 3482mg、芒柄花苷对照品I. 9803mg、异甘草苷对照品2. 4075mg、甘草素对照品3. 0825mg、毛蕊异黄酮对照品0. 8775mg、异甘草素对照品0. 5625mg和甘草酸单铵盐对照品4. 5225mg的溶液，分别吸取各对照品一定量制成混合对照品，即得；
(3)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂的AgilentTC-C18色谱柱；以0.4%。甲酸水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱5min为20%B，IOmin为 21%B,20min 为 25%B,30min 为 32%B,45min 为 46%B ;流速 I. OmL/min ;柱温 30 °C ；DAD 检测器在波长248nm、250nm、276nm、362nm、370nm下同时进行检测；进样量IOy L ;理论塔板数计算，应不低于3000 ；
(4)全时段五波长融合法采用全时段五波长融合法将248nm、250nm、276nm、362nm、 370nm五个波长下的谱图数据进行有效融合，得到一张能够同时反映五个波长信息的融合P曰。(5)样品含量测定应用融合后的谱图数据，计算样品中9种指标成分的含量。(6)对上述确定的含量测定方法对专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性、 范围以及耐用性评价。实施例2
甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，包括如下工艺步骤
(1)供试品溶液的制备取甘草药材粉末约5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入水IOOmL,称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过， 精密吸取续滤液20mL，加在AB-8树脂柱上，用蒸馏水120mL洗涤，再用100mL95%乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加20%乙腈使溶解并转移至IOmL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备精密称取疗糖基甘草昔对照品、甘草昔对照品、疗糖基异甘草苷、芒柄花苷对照品、异甘草苷对照品、甘草素对照品、毛蕊异黄酮对照品、异甘草素对照品和甘草酸单铵盐对照品适量，加甲醇分别制成每ImL含芹糖基甘草苷对照品4. 8159mg、甘草苷对照品8. 8425mg、芹糖基异甘草苷对照品2. 3482mg、芒柄花苷对照品I. 9803mg、异甘草苷对照品2. 4075mg、甘草素对照品3. 0825mg、毛蕊异黄酮对照品0. 8775mg、异甘草素对照品0. 5625mg和甘草酸单铵盐对照品4. 5225mg的溶液，分别吸取各对照品一定量制成混合对照品，即得；
(3)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂的AgilentTC-C18色谱柱；以0. 4%。甲酸水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱IOmin为21%B，15min为 23%B,25min 为 29%B,40min 为 41%B,55min 为 47%B ;流速 I. OmL/min ;柱温 30 °C ；DAD 检测器在波长248nm、250nm、276nm、362nm、370nm下同时进行检测；进样量IOy L ;理论塔板数计算，应不低于3000 ；
(4)全时段五波长融合法采用全时段五波长融合法将248nm、250nm、276nm、362nm、370nm五个波长下的谱图数据进行有效融合，得到一张能够同时反映五个波长信息的融合P曰。(5)样品含量测定应用融合后的谱图数据，计算样品中9种指标成分的含量。(6)对上述确定的含量测定方法对专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性、 范围以及耐用性评价。实施例3
甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，包括如下工艺步骤
(1)供试品溶液的制备取甘草药材粉末约5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入水IOOmL,称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过， 精密吸取续滤液20mL，加在AB-8树脂柱上，用蒸馏水120mL洗涤，再用100mL95%乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加20%乙腈使溶解并转移至IOmL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备精密称取疗糖基甘草昔对照品、甘草昔对照品、疗糖基异甘草苷、芒柄花苷对照品、异甘草苷对照品、甘草素对照品、毛蕊异黄酮对照品、异甘草素对照品和甘草酸单铵盐对照品适量，加甲醇分别制成每ImL含芹糖基甘草苷对照品4. 8159mg、甘草苷对照品8. 8425mg、芹糖基异甘草苷对照品2. 3482mg、芒柄花苷对照品I. 9803mg、异甘草苷对照品2. 4075mg、甘草素对照品3. 0825mg、毛蕊异黄酮对照品0. 8775mg、异甘草素对照品0. 5625mg和甘草酸单铵盐对照品4. 5225mg的溶液，分别吸取各对照品一定量制成混合对照品，即得；
(3)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂的AgilentTC-C18色谱柱；以0. 4%。甲酸水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱IOmin为21%B，20min为 25%B, 30min 为 32%B，45min 为 46%B，60min 为 47%B ;流速 I. OmL/min ;柱温 30°C ；DAD 检测器在波长248nm、250nm、276nm、362nm、370nm下同时进行检测；进样量10 y L ;理论塔板数计算，应不低于3000 ；
(4)全时段五波长融合法采用全时段五波长融合法将248nm、250nm、276nm、362nm、 370nm五个波长下的谱图数据进行有效融合，得到一张能够同时反映五个波长信息的融合P曰。(5)样品含量测定应用融合后的谱图数据，计算样品中9种指标成分的含量。(6)对上述确定的含量测定方法对专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性、 范围以及耐用性评价。
权利要求
1.甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，其特征在于，包括如下工艺步骤(1)供试品溶液的制备取甘草药材粉末约5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入水 IOOmL,称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液20mL，加在AB-8树脂柱上，用蒸馏水120mL洗涤，再用100mL95%乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加20%乙腈使溶解并转移至IOmL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液的制备精密称取疗糖基甘草昔对照品、甘草昔对照品、疗糖基异甘草苷、芒柄花苷对照品、异甘草苷对照品、甘草素对照品、毛蕊异黄酮对照品、异甘草素对照品和甘草酸单铵盐对照品适量，加甲醇分别制成每ImL含芹糖基甘草苷对照品4. 8159mg、甘草苷对照品8. 8425mg、芹糖基异甘草苷对照品2. 3482mg、芒柄花苷对照品I. 9803mg、异甘草苷对照品2. 4075mg、甘草素对照品3. 0825mg、毛蕊异黄酮对照品0. 8775mg、异甘草素对照品0. 5625mg和甘草酸单铵盐对照品4. 5225mg的溶液，分别吸取各对照品一定量制成混合对照品，即得；(3)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂AgilentTC-C18色谱柱；以0.4%。甲酸水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱(TlOmin为209T21%B， 10 20min 为 21% 25%B，20 30min 为 25% 32%B，30 45min 为 32% 46%B，45 60min 为 46% 47%B ;流速1. OmL/min ;柱温 30°C ;DAD检测器在波长 248nm、250nm、276nm、362nm、370nm 下同时进行检测；进样量IOu L ;理论塔板数计算，应不低于3000 ；(4)全时段五波长融合法采用全时段五波长融合法将248nm、250nm、276nm、362nm、 370nm五个波长下的谱图数据进行有效融合，得到一张能够同时反映五个波长信息的融合(5)样品含量测定应用融合后的谱图数据，计算样品中9种指标成分的含量；(6)对上述确定的含量测定方法对专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性、范围以及耐用性评价。
全文摘要
本发明公开了甘草药材全时段五波长融合法同时测定九种成分含量的质量控制方法，它是将现代分析检测手段和计算机信息融合方法结合起来，遵循最大信息化原则，对中药材指标成分的光谱和色谱信息进行有效融合，从而可以采取宏观和综合量化的手段有效地反映中药材的内在质量。本发明的质量控制方法操作简单、稳定可靠、重现性较好，可用于中药材质量评价和控制及中药新药研发中。特别是可将其作为甘草药材质量控制及真伪鉴别的指标之一。
文档编号G01N30/02GK102539576SQ20121002059
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月30日 优先权日2012年1月30日
发明者包永睿, 吴寅萍, 孟宪生, 康廷国, 王帅 申请人:辽宁中医药大学
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