专利名称：大景深三维纳米分辨成像方法、光学组件及成像系统的制作方法
大景深三维纳米分辨成像方法、光学组件及成像系统技术领域
本发明属于显微成像技术领域，特别涉及一种大景深三维纳米分辨成像方法、光学组件及成像系统。
背景技术：
细胞是生物体及生命活动的基本单元,对细胞的深入研究是揭开生命奥秘，改造生命和征服疾病的关键。在完整细胞下进行分子成像，进而获取亚细胞精细结构甚至分子图谱，并能在活体细胞下获取这些结构变化及分子动态过程的信息一直是细胞学研究的重要方向。同时，对完整细胞进行纳米分辨三维结构和功能成像，在更高水平上认识亚细胞结构与细胞功能变化的关系和规律，是生命科学的迫切需求，也是对成像科学的重大挑战。
近年来，远场纳米分辨荧光显微成像技术取得了较大的发展。目前最为突出的方法有两种，一种是基于缩小有效激发光斑，通过直接减小点扩展函数的半高宽来提高分辨率，包括STED，GSD等；另一种则是基于单分子定位技术，包括STORM，PALM等。前者是通过受激态或基态耗尽的方式，压缩荧光有效发射区域；后者则是利用荧光标记本身的开关效应,通过稀疏激发、分时成像、质心定位以及图像合成来实现纳米分辨成像，已经实现20nm 的横向空间分辨率。
然而，利用单分子定位技术对直径为10 μ m以上的细胞进行纳米分辨三维成像仍然存在很多问题。首先，单分子定位对于轴向分辨率并没有提高，常常需要结合某些改进轴向分辨率的方法，如柱面镜像散法、双螺旋点扩散函数法(DH-PSF)、双层平面探测法、虚拟空间超分辨显微术(VVSRM)等，可实现横向空间分辨率达20-30nm左右，轴向分辨率达 40-70nm的三维成像，目前，这些方法的成像深度只有2 μ m。另外，干涉光敏定位显微技术 (iPALM)可将三维的分辨率提高到20nm以内，但成像范围仅被限制在盖玻片以下500nm的深度范围内，因此，这些方法的成像深度均较小。
细胞内动态成像要实现细胞内同时追踪多个分子，这要求成像手段在三维空间以纳米定位精度快速探测十几微米景深范围内的多个目标分子。目前的单分子追踪(SPT) 方法，既可以对样品中只包含目标分子的区域进行局部探测，实现Inm精度的荧光成像 (FIONA);也可以采用宽场成像的方法，实现同时追踪多个分子。虽然宽场探测的SPT方法已经发展了图像堆栈、离焦成像、用聚焦激光光束环绕粒子运动、Fresnel粒子追踪(FPT)， 以及柱面镜像散等多种轴向分辨的方法，已经可以实现三维的纳米定位，但目前实现的成像深度仅仅为3 μ m左右，而一般完整细胞的厚度有十几微米，因此，现有的方法仍不能满足细胞内多分子追踪的大景深要求。发明内容
本发明的目的在于提供一种大景深三维纳米分辨成像方法，旨在解决传统方法成像深度�。岩月惴肿佣ㄎ坏拇缶吧钜蟮奈侍�。
本发明是这样实现的，一种大景深三维纳米分辨成像方法，包括下述步骤
创建具有双螺旋点扩散函数和离焦光栅多阶成像性质的光学�？椋煌ü龉庋？槎源夥肿咏谐上瘢竦么夥肿拥乃菪枷瘢煌ü鏊菪枷裰兴菪园甑闹械阍诔上衩嫔系奈恢萌范ù夥肿拥暮嵯蛭恢茫煌ü鏊菪枷裰兴菪园甑闹行牧叩男嵌燃八鏊菪园甑闹械阍诔上衩嫔系奈恢萌范ù夥肿拥闹嵯蛭恢�。本发明的另一目的在于提供一种用于大景深三维纳米分辨成像的光学组件，包括沿光路传输方向依次设置的第一透镜，用于将待测分子发出的荧光进行准直；光学�？椋哂兴菪憷┥⒑屠虢构庹ざ嘟壮上裥灾剩糜诮鲇庾晃哂兴菪岸嘟壮上裥灾实某上窆馐坏诙妇担糜诮龀上窆馐涑鲆杂糜诔上�。本发明的又一目的在于提供一种大景深超分辨荧光显微成像探测系统，包括沿光路传输方向依次设置的探测物镜，用于接收含有待测分子发出的荧光的光束；滤光片，用于对所述光束进行滤波并输出所述荧光；双色镜，用于对所述荧光进行反射；管镜，用于将反射的荧光聚焦并向成像组件输出；成像组件，采用上述的光学组件，用于将所述荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束；探测器，用于接收所述成像光束并进行双螺旋及多阶成像。本发明创建了综合双螺旋点扩散函数及离焦光栅多阶成像双重效应的光学模块，多阶成像的景深较大，双螺旋成像的分辨率较高且具有一定的景深，通过上述光学�？槌上袷保环矫嫱ü嘟壮上窈退菪上翊蠓壤┐罅司吧睿硪环矫嫱ü菪上裣灾奶岣吡朔直媛剩痉⒚鞯某上窬吧羁纱锸肝⒚祝瓤捎糜谕暾赴谌我馍疃妊窍赴亩段С上瘢挚苫竦枚喔鲈硕肿拥亩δ芡枷瘢杂谠诟咚缴先鲜堆窍赴峁褂胂赴δ鼙浠墓叵岛凸媛删哂兄匾庖�。
图1是本发明第一实施例提供的大景深三维纳米分辨成像方法的流程图；图2是不同深度的双螺旋点扩散函数和标准点扩散函数成像的对照图；图3是双螺旋点扩散函数成像的强度与相位分布；图4是双螺旋点扩散函数在不同轴向位置处的成像图形；图5是双螺旋图像两个旁瓣中心连线的旋转角度与Z轴位置的关系曲线图；图6是离焦光栅成像原理示意图；图7是本发明第一实施例提供的相位片的示意图；图8是利用图7所示相位片进行成像的效果图；图9是本发明第二实施例提供的用于大景深三维纳米分辨成像的光学组件示意图10是本发明第三实施例提供的一种大景深超分辨荧光显微成像探测系统示意 图；图11是本发明第三实施例提供的另一种大景深超分辨荧光显微成像探测系统示 意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行更加详细的描述实施例一:图1示出了本发明第一实施例提供的大景深三维纳米分辨成像方法的流程图，为 了便于说明，仅示出了与本实施例相关的部分。参考附图1，该方法主要包括下述步骤在步骤S101中，创建具有双螺旋点扩散函数和离焦光栅多阶成像性质的光学模 块；在步骤S102中，通过光学�？槎源夥肿咏谐上瘢竦么夥肿拥乃菪� 像；在步骤S103中，通过双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点在成像面上的位置确定待 测分子的横向位置；在步骤S104中，通过双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心连线的旋转角度及双螺旋 旁瓣的中点在成像面上的位置确定待测分子的轴向位置。通过双螺旋点扩散函数(DH-PSF)实现三维纳米定位是基于一种被称为自成像的 现象。DH-PSF是一种三维光学响应，具有随离焦量不断旋转的圆形不对称横截面轮廓，如 图2所示。双螺旋点扩散函数主要通过位于拉盖尔-高斯(Laguerre-Gauss,简记为LG) 模式平面上特定直线上的LG光束模式的线性叠加构成带有旋转和缩放的自成像光束，然 后将自成像光束的一个横截面中的复合场作为光学�？榈墓庋Т莺敲矗庋？� 的传递函数就是双螺旋点扩散函数。该拉盖尔-高斯光束模式为
权利要求
1.一种大景深三维纳米分辨成像方法，其特征在于，包括下述步骤 创建具有双螺旋点扩散函数和离焦光栅多阶成像性质的光学�？椋� 通过所述光学�？槎源夥肿咏谐上瘢竦么夥肿拥乃菪枷瘢� 通过所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点在成像面上的位置确定待测分子的横向位置； 通过所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心连线的旋转角度及所述双螺旋旁瓣的中点在成像面上的位置确定待测分子的轴向位置。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述光学�？榈乃菪憷┥⒑ü率龇椒ㄊ迪� 通过位于拉盖尔-高斯模式平面上特定直线上的拉盖尔-高斯光束模式的线性叠加构成带有旋转和缩放的自成像光束； 将自成像光束的一个横截面中的复合光场作为所述光学�？榈墓庋Т莺顾龉庋？榫哂兴菪憷┥⒑�。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述拉盖尔-高斯光束模式为
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述光学模块的相位函数为 ①h_①db+①g 其中，Cdb为所述五种拉盖尔-高斯光束模式等权重叠加后形成的复振幅的相位；
5.如权利要求4所述的万法其特征在于，所述光学�？槲捎梦⑾讣庸ぜ际踔谱鞯南辔黄虿捎每占涔獾髦破魇迪�。
6.一种用于大景深三维纳米分辨成像的光学组件，其特征在于，包括沿光路传输方向依次设置的 第一透镜，用于将待测分子发出的光束进行准直； 光学�？椋哂兴菪憷┥⒑屠虢构庹ざ嘟壮上裥灾剩糜诮龉馐晃哂兴菪岸嘟壮上裥灾实某上窆馐� 第二透镜，用于将所述成像光束输出以用于成像。
7.如权利要求6所述的光学组件，其特征在于，所述光学�？榈南辔缓�
8.—种大景深超分辨荧光显微成像探测系统，其特征在于，包括沿光路传输方向依次设置的 探测物镜，用于接收含有待测分子发出的荧光的光束； 滤光片，用于对所述光束进行滤波并输出所述荧光； 双色镜，用于对所述荧光进行反射； 管镜，用于将反射的荧光聚焦并向成像组件输出； 成像组件，采用权利要求6或7所述的光学组件，用于将所述荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束； 探测器，用于接收所述成像光束并进行双螺旋及多阶成像。
9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述光学组件中的光学�？槲ü⑾讣庸ぜ际踔谱鞯南辔黄�
10.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述光学组件中的光学�？槲占涔獾髦破鳎鱿低郴拱� 偏振片，位于所述双色镜和管镜之间，用于将所述荧光转换为适用于所述空间光调制器的线偏振光。
全文摘要
本发明适用于显微成像技术领域，提供了一种大景深三维纳米分辨成像方法，包括下述步骤创建具有双螺旋点扩散函数和离焦光栅多阶成像性质的光学�？椋煌ü庋？槎源夥肿咏谐上瘢竦盟菪枷瘢煌ü菪枷裰兴菪园甑闹械愕奈恢萌范ù夥肿拥暮嵯蛭恢茫煌ü菪枷裰兴菪园甑闹行牧叩男嵌燃八菪园甑闹械阄恢萌范ù夥肿拥闹嵯蛭恢�。本发明将双螺旋点扩散函数及离焦光栅多阶成像的双重效应相结合，既扩大了景深，又提高了分辨率，该方法可用于完整细胞内任意深度亚细胞的动态范围成像，可获得多个运动分子的动态功能图像，对于在更高水平上认识亚细胞结构与细胞功能变化的关系和规律具有重要意义。
文档编号G01N21/64GK102980875SQ20121046780
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者于斌, 陈丹妮, �：┍�, 李恒 申请人:深圳大学
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