5.9kDa肽的免疫学测定方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：5.9kDa肽的免疫学测定方法
5.9kDa肽的免疫学测定方法
技术领域：
本发明涉及用于从待测样品检测通过蛋白质组解析发现可作为肝脏疾病用肽标记物利用的，人纤维蛋白原α-E链、或者，是人纤维蛋白原α链的分解产物，有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(以下，称之为5. 9kDa肽)、或者，定量待测样品中的5. 9kDa肽浓度的免疫学测定方法、及，免疫学测定用试剂盒。另外，本发明涉及5. 9kDa肽的免疫学测定方法中使用的，识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体及识别C末端区域的抗体。
背景技术：
近年，在世界规模进行一并的蛋白质组解析，也广泛进行使用蛋白质组解析的疾病标记物的探索(专利文献1 2、非专利文献1 幻。在蛋白质组解析中，一般而言，各自分离作为活体来源样品中包含的蛋白质或其分解产物的肽，用质谱分析装置解析分离的蛋白质或肽的氨基酸序列，核对得到的氨基酸序列和数据库中的氨基酸序列，由此鉴定样品中包含的蛋白质或肽。由于根据疾病的有无而在活体内表达的蛋白质不同，通过蛋白质组解析而有可将发现疾病特异性地表达量增减的蛋白质或肽作为其疾病标记物利用的可能性。通过蛋白质组解析，本发明人从在以戒酒目的住院的酒精依赖症患者中经时采集的血清待测样品，作为伴随习惯饮酒而增减的新颖的血清肽之一鉴定了 5. 9kDa肽，发现可将这作为肝脏疾病诊断标记物利用(专利文献1、非专利文献1-2)。另外，本发明人发现，使用由M个残基组成的5. 9kDa肽的全长肽作为抗原而得到的两种类的单克隆抗体，使单离的5. 9kDa肽的免疫学测定成为可能(专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开第2004/058966号专利文献2 国际公开第2004/090550号非专利文献非专利文献 1 Nomura, F. et al.，Proteomics，4，1187-1194，2004非专利文献 2 =Nomura, F. et al.，J. Chromatogr. B.，855，35-41，2007非专利文献3 :Hanash，S. M. et al.，Nature，452，571-579，2008

发明内容发明要解决的技术课题至今，使用蛋白质组解析报告了几种临床上有用的肽。但是，在本发明人所知的范围内几乎未见到使用在临床诊断的领域广泛一般地使用的免疫学的检测方法而定量测定这些的疾病标记物候选肽的报告。此免疫学测定方法的确立困难的点妨碍通过蛋白质组解析发现的肽标记物的普及。
作为免疫学测定方法的确立困难的原因，第一，可举出对肽的特异性抗体的制备困难。第二，可举出通过蛋白质组解析发现的肽也多为活体来源样品中存在的成熟的蛋白质的分解产物，包含作为目的的肽的序列的目的肽以外的多种分解产物混在于样品中。这时，即便将作为目的的肽作为免疫原制出抗体，也发生与混在的分解产物的非特异性的反应，无法正确地定量分析目的肽。特别是，通过分解作为本发明的测定对象的5. 9kDa肽而产生的人纤维蛋白原是与凝固-纤溶系统无关的蛋白质，活体内大量存在其分解物。具体而言，纤维蛋白原在凝固系统中被凝血酶分解而产生纤维蛋白单体。在纤溶系统中，由于由纤维蛋白单体构成的纤维蛋白聚合物由纤溶酶在多个部位被分解，必然产生多个纤维蛋白原分解产物。例如，根据数据库卩印1:土(16八1:188 011^口//\￥ ^· peptideatlas. org/)中的 buildHuman Plasma PeptideAtlas 2009-05，作为人纤维蛋白原α-E链(数据库内蛋白质名ENSP00000306361)的分解产物观测到239种的肽。如前所述，本发明人成功进行了，对将由M个残基组成的5. 9kDa肽的全长肽作为抗原的5. 9kDa肽的两种类的单克隆抗体的制成、及，单离的5. 9kDa肽的免疫学测定(专利文献1)。但是，即便使用这些单克隆抗体，在充分地正确地测定有包含多个人纤维蛋白原分解产物的可能性的待测样品中的5. 9kDa肽的定量中也有再改良的余地。鉴于此实状，本发明的课题在于提供从有包含多个人纤维蛋白原α -E链/α链分解产物的可能性的待测样品特异性地检测5. 9kDa肽而定量的免疫学测定方法。而且，本发明的课题旨在提供用于在该免疫学测定方法中使用的试剂盒以及该免疫学测定方法及该试剂盒中使用的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体及识别C末端区域的抗体。解决课题的技术方案已知2种含5. 9kDa肽的氨基酸序列的纤维蛋白原链。即为，人纤维蛋白原α-E链(以下，也称之为F α-E链)和人纤维蛋白原α链(以下，也称之为F α链)。F α-E链和Fa链以5. 9kDa肽的序列作为基准，N末端侧上游区域的氨基酸序列完全地一致，但C末端侧下游区域的氨基酸序列不同。Fa-E链和Fa链的分解产物，如前所述，除了 5. 9kDa以外，在血液样品中存在至少200种以上的混杂肽。因此，本发明人当初制备了有Fa -E链和F α链中的几个氨基酸序列的多种肽作为抗原的多种抗体，在它们之中将以5. 9kDa肽的序列的最近傍区域作为抗原的抗体作为混杂肽除去用抗体，将其余作为5. 9kDa肽测定用抗体使用，尝试了测定5. 9kDa肽。S卩，在使用多种混杂肽除去用抗体除去混杂肽的操作之后，尝试了使用5. 9kDa肽测定用抗体测定样品中的5. 9kDa肽。具体而言，为了制成混杂肽除去用抗体而使用的抗原肽作为(al)F α -E链或F α链中的5. 9kDa肽的N末端侧上游区域7个的氨基酸序列(氨基酸序列EFPSRGK)、(a2)识别Fa -E链中的5. 9kDa肽区域的C末端侧下游区域的13个的氨基酸序列(氨基酸序列RDCDDVLQTHPSG)的抗体、及，(a3)Fa链中的5. 9kDa肽区域的C末端侧下游区域13个的氨基酸序列(氨基酸序列RGIHTSPLGKPSL)。另外，作为5. 9kDa肽测定用抗体，最终，以使用(bl)识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体、( )识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体为良好。但是，令人惊讶地，本发明人发现，不经前述的混杂肽的除去操作，通过仅免疫学测定使5. 9kDa肽与识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体和识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体接触而得到的5. 9kDa肽和两种抗体的免疫复合物，尽管通过通常的蛋白印迹法在待测样品中检测到这两种抗体结合的混杂肽，但也不受要通过前述的混杂肽除去操作除去的混杂肽的影响，可从有含多种人纤维蛋白原α-E链/α链分解产物的可能性的待测样品基本上仅测定5. 9kDa肽，从而完成本发明。从而，本发明涉及接下来举的待测样品中的5. 9kDa肽的免疫学测定方法、免疫学测定用试剂盒及它们中使用的抗体。[1] 5. 9kDa肽的免疫学测定方法，其特征在于，使识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段，以及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段与待测样品中的有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(5. 9kDa肽)接触而生成5. 9kDa肽和该2种抗体或它们的抗体片段的免疫复合物，以及测定得到的免疫复合物。[2]上述[1]所述的免疫学测定方法，其中，识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第1 39的氨基酸区域中存在的任何表位的抗体，识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第18 M的氨基酸区域中存在、并且相比识别上述N末端区域的抗体所识别的表位位于更C末端侧的任何表位的抗体，这2种抗体所识别的表位不互相重复，并且，这2种抗体不互相妨碍与5. 9kDa肽的结合。[3]上述[1]或[2]所述的免疫学测定方法，其中识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体。[4]上述[1] [3]之任一项所述的免疫学测定方法，其中识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体。[5]上述[1] [4]之任一项所述的免疫学测定方法，其中通过夹心ELISA法测定免疫复合物。[6]上述[1] [4]之任一项所述的免疫学测定方法，其中通过乳胶免疫凝集测定法测定免疫复合物。[7]上述[1] [6]之任一项所述的免疫学测定方法，其中待测样品是全血、血清、血浆、尿、唾液、脑脊髓液、胸水、腹水、心囊水、关节液、或者，淋巴液，且有包含5.9kDa肽的可能性。[8] 5. 9kDa肽的免疫学测定用试剂盒，其包含识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段、和识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段。[9]上述[8]所述的免疫学测定用试剂盒，其包含识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段、和识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段，
任何一方的抗体或其抗体片段是被标记的标记抗体或标记抗体片段，另一方的抗体或其抗体片段是结合到固相的固相结合抗体或固相结合抗体片段，且用于由夹心ELISA法的测定5. 9kDa肽。[10]上述[8]所述的免疫学测定用试剂盒，其包含致敏不溶性载体粒子的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段，和致敏不溶性载体粒子的识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段，且用于由乳胶免疫凝集测定法的测定5. 9kDa肽。[11]上述[10]所述的免疫学测定用试剂盒，其含用识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段，以及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段的2种抗体或它们的抗体片段的两方致敏1个不溶性载体粒子而得到的1种不溶性载体粒子；用该2种抗体或它们的抗体片段分别致敏不同的不溶性载体粒子而得到的2种不溶性载体粒子；或者，这3种不溶性载体粒子的混合物。[12]抗体或其抗体片段，其识别5.9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位。[13]抗体或其抗体片段，其识别5. 9kDa肽的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位。发明效果通过本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法，从有含多种混杂肽的可能性的待测样品，可简便并且正确地特异性地测定5. 9kDa肽。虽然使用质谱分析装置的5. QkDa肽的定量测定也可能，通过使用更简便地有同等的精度，并且，通量高的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法，定量作为肝脏疾病诊断用肽标记物的5. 9kDa肽，使容易地进行习惯饮酒者或问题饮酒者发症肝脏疾病的可能性或，饮酒以外的原因的肝脏疾病、例如，肝炎、肝硬变、或者，脂肪肝的诊断变得可能。

图1是示使用实施例2中制成的，作为第一抗体使用抗-5.9C，作为第二抗体使用抗-5. 9N的本发明的夹心ELISA测定系统，和比较例1中制成的，作为第一抗体使用抗-5. 9W1，作为第二抗体使用抗-5. 9W2的夹心ELISA测定系统，测定血清中的5. 9kDa肽浓度之时的标准曲线的图。纵轴表示在波长450nm处的吸光度，横轴表示将样品1/333稀释之前的5. 9kDa肽浓度(μ g/ml)。图2是示将同一血清样品中的5.9kDa肽浓度用本发明的ELISA测定定量的结果与使用SI-MS法定量的结果的相关的图。纵轴表示用本发明的ELISA测定测定的5. 9kDa肽浓度(μ g/ml)、横轴表示通过SI-MS法算出的5. 9kDa肽浓度(μ g/ml)。白色圆点表示从健康者得到的血清8个待测样品、黑色圆点表示从酒精依赖症患者得到的血清8个待测样品。
图3是示将同一血清样品中的5.9kDa肽浓度用本发明的乳胶免疫凝集测定(LATEX测定)定量的结果与通过本发明的ELISA测定定量的结果的相关的图。纵轴表示通过本发明的LATEX测定测定的5. 9kDa肽浓度(μ g/ml)、横轴表示通过本发明的ELISA测定测定的5. 9kDa肽浓度(μ g/ml)。实施方式通过本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒测定的5. 9kDa肽是有SEQ ID NO :1所示的由讨个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其理论分子量是5904. 2的肽。该肽在人纤维蛋白原α-E链及人纤维蛋白原α链的从N末端起第576 629的氨基酸区域中存在，通过人纤维蛋白原α-E链及人纤维蛋白原α链分解而产生。通过本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒测定的5. 9kDa肽是伴随习惯饮酒等的要因而从活体来源样品的检测量减少的肝脏疾病诊断用肽标记物。成为本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法的对象的待测样品而言，只要是有包含5. 9kDa肽的可能性的活体来源样品就不特别限制，可举出各种体液或细胞组织提取液等，从作为5. 9kD的临床标记物的功能及样品采集的简便性的观点，优选从疑似患肝脏疾病的患者采集的体液。其中，体液而言，可举出全血、血清、血浆、尿、唾液、淋巴液、脑脊髓液、或者，含腹水-胸水-心囊水-关节液的穿刺液等，在其中也是，特别优选含有凝固纤溶系统中涉及的纤维蛋白原及纤维蛋白，和含由这些产生的5. 9kDa肽的多种的分解产物的可能性高的血液来源样品、即，全血、血浆、血清。尤其是，由本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法测定的待测样品而言，适宜是从疑似患肝脏疾病的患者采集的血清。本发明的5. 9kD肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体是，可在5. 9kDa肽中存在的几个表位之中，识别不互相重复的表位，并且，不互相妨碍与5. 9kDa肽的结合的抗体。其中，本发明中使用的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体所识别的表位相比本发明中使用的识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体所识别的表位存在于更N末端侧。其中，本发明的5. 9kDa肽免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体只要是可进行对于5. 9kDa肽特异性的免疫学测定，则是单克隆抗体也可，是多克隆抗体也可。另外，该抗体的同种型不特别限定，例如，可举出IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM的同种型的抗体，从抗体纯化的容易度的观点来看，优选IgG型的抗体。然后，对于用于得到该抗体的制备方法-产生生物也不特别限定，例如，可举出使用小鼠来源杂交瘤细胞株的该抗体的制备。关于本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体，表位通常是指，由6 11个左右的氨基酸残基组成的抗原的分子表面中存在的氨基酸区域，抗体所识别而结合的抗原的特定的结构单位。通常、1个抗原有多个表位。关于本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体，2种抗体不互相妨碍与5. 9kDa肽的结合是指，例如，另一方的抗体识别5. 9kDa肽中的表位而结合之时，其抗体将另一方的抗体所识别的表位的全部或一部分立体覆盖而抑制另一方的抗体的表位识别，或者，另一方的抗体识别表位而结合之时通过2个抗体接触等的实施方式，无另一方的抗体的向5. QkDa肽的结合被另一方的抗体的结合阻碍。其中，为了使识别抗原中的不重复的表位的抗体不妨碍互相与一方的抗原的结合，2个不重复的表位要有的间隔，依赖于抗原可取的立体结构，但优选为在2个表位间存在6个残基以上的氨基酸区域、更优选为20个残基以上的氨基酸区域，再者优选为在2个表位间的氨基酸区域中含取β转角结构的氨基酸区域。通过在2个表位间存在某种程度的间隔，2种抗体互相成立体障碍的可能性减少。再者，通过在不重复的2个表位间存在由4个氨基酸残基形成的肽链急剧地转折的β转角结构，识别各自的表位的抗体互相接触的可能性减少。实施例中详述，通过确认表位存在于SEQ ID NO 1所示的5. ^cDa肽的氨基酸序列的从N末端起第1 17或第40 M的氨基酸区域，本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体优选为识别SEQ IDNO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第1 39的氨基酸区域中存在的任何表位的抗体，更优选为识别SEQ ID NO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体。另一方面，本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体，优选为识别在SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第18 M的氨基酸区域中存在的任何中存在，并且，相比上述识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体所识别的表位位于更C末端侧的表位的抗体，更优选为识别在SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的从N末端起第1 17或第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体而言，可举出将含SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第1 17或第40 M的氨基酸序列的肽、或者，该氨基酸序列中有1到数个氨基酸的选自缺失、取代、附加或插入的至少1种的变异，并且，有含该氨基酸序列的连续的90%以上的氨基酸序列的肽作为抗原而得到的抗体、或者，将作为该抗原的肽和载体结合而得到的复合物作为免疫原而得到的抗体。其中，作为抗原的肽，例如，可使用公知的肽合成技术化学合成而得到。另外，上述载体而言，可使用作为匙孔青贝的血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡血清白蛋白、聚-L-赖氨酸、聚丙氨酰赖氨酸、二棕榈基赖氨酸、破伤风类病毒或多糖类等的载体而公知的载体。其中，使载体和作为抗原的肽结合的方法而言，可举出例如，作为抗原的肽中包含的，或者，利用人工地导入作为抗原的肽的Cys残基的SH基而使载体和作为抗原的肽结合的MBS (马来酰亚胺苯甲酰氧基琥珀酸亚胺)法。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的从N末端起第1 17及第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体是单克隆抗体也可，是多克隆抗体也可。作为本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体，可举出，优选为，将在含SEQ ID NO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第1 17的氨基酸序列的抗原肽的N末端或C末端导入为了使抗原肽和上述载体结合而使用的Cys残基的肽和上述载体的复合物作为免疫原而得到的抗体、更优选为，将在其抗原肽的C末端导入为了使抗原肽和载体结合而使用的Cys残基的肽、即有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的肽和作为载体的KLH的复合物作为免疫原而得到的抗体、特别是优选为，由本发明人建立的杂交瘤5. 9N-06(国际保藏号NITEBP-797)产生的单克隆抗体。另一方面，作为本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体，可举出，优选为，将在含SEQ ID N0:1所示的5.9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第40 M的氨基酸序列的抗原肽的N末端或C末端导入为了使抗原肽和上述载体结合而使用的Cys残基的肽和上述载体的复合物作为免疫原而得到的抗体、更优选为，将在其抗原肽的N末端导入为了使抗原肽和载体结合而使用的Cys残基的肽、即有SEQ IDNO 3所示的氨基酸序列的肽和作为载体的KLH的复合物作为免疫原而得到的抗体、特别是优选为，由本发明人建立的杂交瘤5. 9C-02(国际保藏号NITEBP-798)产生的单克隆抗体。在本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中，只要可识别各自的抗体所识别的表位，可同样地使用识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体的抗体片段、及，识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体的抗体片段。另外，对于本发明中提供的识别5. 9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体或识别5. 9kDa肽的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体，只要可识别各自的抗体所识别的表位，也同样地提供它们的抗体片段。这些的抗体片段而言，不特别限定。具体而言，可举出Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、Diabody、dSFV、含互补决定区域(以下，也称之为OTR)的肽。Fab是在将IgG型抗体用蛋白质分解酶木瓜蛋白酶处理而得到的片段之中，H链的N末端侧约一半和L链全体通过二硫(S-S)键结合的分子量约5万Da的有对抗原的特异性结合能力的抗体片段。在本发明中，Fab，例如，可将本发明中提供的识别5.9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体或识别5. 9kDa肽的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体用蛋白质分解酶木瓜蛋白酶处理而得到。F(ab' )2是在将IgG型抗体用蛋白质分解酶胃蛋白酶处理而得到的片段之中，相比Fab经铰链区域的S-S键结合的略大的，分子量约10万Da的有对抗原的特异性结合能力的抗体片段。在本发明中，F(ab' )2，例如，可将本发明中提供的识别5.9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体或识别5. 9kDa肽的从N末端起第40 54的氨基酸区域中存在的表位的抗体用蛋白质分解酶胃蛋白酶处理而得到。或者，可通过将下述的Fab’硫醚键合或S-S键合而制成。Fab，是切断上述F(ab，)2的铰链区域的S-S键的分子量约5万Da的有对抗原的特异性结合能力的抗体片段。在本发明中，可将F (ab’)2用还原剂二硫苏糖醇处理而得到。scFv是将1条H链可变区域(VH)和1条L链可变区域(VL)用12个残基以上的适当的肽接头⑵连结的VH-P-VL乃至VL-P-VH多肽，且有对抗原的特异性结合能力的抗体片段。
双抗体是抗原结合特异性的相同或不同的scFv形成2聚体的抗体片段，对相同的抗原有高于scFV的反应性的，或者，对不同的抗原有同样的特异性结合能力的抗体片段。dsFv是将H链可变区域及L链可变区域中的各自1个氨基酸残基用Cys残基取代的多肽经该Cys残基间的S-S键结合的抗体片段。含CDR的肽是含H链可变区域或L链可变区域的⑶R的至少1个区域以上而构成。含多个CDR的肽可通过直接或经适当的肽接头结合而制备。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的各种的抗体是，将含各自的抗原、例如，各自的抗体所识别的表位的5. 9kDa肽片段、其变体、5. 9kDa肽的全长肽、5. 9kDa肽的全长肽的变体、或者这些的肽和上述载体的复合物作为免疫原而免疫动物之后，关于多克隆抗体，从其动物的血清可通过公知的方法制备，关于单克隆抗体，可从通过将由其动物的脾脏等来源的产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞融合而得到的杂交瘤经回收及纯化而得到。其中，作为免疫原的肽从人血液等的活体来源样品纯化而得到也可，使用公知的肽合成技术化学合成而得到也可。不限于此，由重组体产生的肽也可作为抗原使用。产生本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的各种的抗体的杂交瘤可根据公知的方法、例如，Kohler和Milstein的方法(Kohler, G. & Milstein，C. Nature，256，495-497，1975)制成。即，将上述免疫原与公知的佐剂一同混和之后，将制成的佐剂液向小鼠、大鼠、仓鼠、山羊等的各种免疫动物间隔时间免疫必要次数，确认抗体价的升高后，将由其动物的脾脏等来源的产生抗体的细胞和小鼠、大鼠等的哺乳动物的骨髓瘤细胞进行细胞融合而制成杂交瘤。本发明人制成并建立的，产生前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体的杂交瘤5. 9N-06、及，产生前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的从C末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体的杂交瘤5. 9C-02在2009年8月19日国内保藏到〒四2-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心(NPMD)，作为保藏号，各自赋予NITE P-797及NITE P-798。其后，将这些的国内保藏，在2010年8月20日基于布达佩斯条约进行向国际保藏的移管请求，在2010年9月13日，作为国际保藏号，各自赋予NITE BP-797及NITEBP-798。为了从杂交瘤获得本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的各种的单克隆抗体，首先，对制成的杂交瘤使用选择培养基进行选择，将选择的杂交瘤的培养上清用如ELISA法一样的适当的免疫测定法分析，选择产生目的的单克隆抗体的杂交瘤。接下来，将选择的克隆用如有限稀释法等一样的方法进行克隆而单克隆化。接下来，将克隆的杂交瘤用通常细胞培养中使用的培养基、例如α -MEM、RPMI1640、ASF、S-clone等进行培养，可由其培养上清回收单克隆抗体。将作为杂交瘤的来源的动物、裸鼠预先用姥鲛烷处理，通过向该动物腹腔内注射细胞而贮留腹水，从其腹水回收单克隆抗体也可。最后，由上清、腹水回收单克隆抗体的方法而言，可使用通常的方法。例如，可举出由硫酸铵、硫酸钠等的盐析法或层析、离子交换层析、一般而言，由蛋
11白G等的亲和层析等。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的各种的抗体或其抗体片段也可通过将编码这些的DNA序列通过公知的方法解析之后，制成含其DNA序列的基因重组载体，将制成的基因重组载体导入适当的宿主、例如，大肠杆菌或酵母，由得到的基因重组体回收该抗体或其抗体片段，纯化而得到。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中生成的免疫复合物是，通过将前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的N末端的抗体或其抗体片段及识别5. 9kDa肽的C末端的抗体或其抗体片段分别同时与5. 9kDa肽接触-结合，或者，通过一方的抗体或其抗体片段与5. 9kDa肽接触-结合而形成的5. 9kDa肽和抗体或其抗体片段的复合物上再接触-结合另一方的抗体或其抗体片段而形成的，5. 9kDa肽和2种抗体或它们的抗体片段的复合物。其中，形成的复合物是3聚体也可，是其以上的多聚体也可。在本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中生成的免疫复合物中，形成复合物的前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的N末端的抗体或其抗体片段及识别5. 9kDa肽的C末端的抗体或其抗体片段之中一方维持其抗原识别能力的实施方式中，将固相、即，聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯等向作为原料的基材、例如，塑料管或微滴定板直接或间接物理结合或化学结合、利用亲和性等结合也可。另外，在不结合于上述固相的另一方的抗体或其抗体片段维持其抗原识别能力的实施方式中，用标记物质、例如，HRP等的标记酶、胶体金、铕等的标记金属、FTTC、若丹明、德克萨斯红、Alexa、GFP等的化学、生物性各种荧光物质、32P、51Cr等的放射性物质等标记也可。或者，在本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中生成的免疫复合物中，在前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的N末端的抗体或其抗体片段及识别5. 9kDa肽的C末端的抗体或其抗体片段的两方维持其抗原识别能力的实施方式中，将不溶性载体粒子、例如，如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物一样的有机高分子向如乳胶或氧化硅、氧化铝一样的无机氧化物等直接或间接物理结合或化学结合、利用亲和性等结合也可。测定本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中生成的免疫复合物的手段而言，可例示酶联免疫测定法(ELISA法)、免疫比浊测定法(TIA法)、乳胶免疫凝集测定法(LATEX法)、电化学发光法、荧光法等。另外免疫层析法、利用试验纸的方法也有效。从有优良的灵敏度及定量性的方面，测定本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中生成的免疫复合物的手段而言，优选ELISA法，更优选夹心ELISA法。另外，从测定简便并且迅速的方面来看，测定本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中生成的免疫复合物的手段而言，优选乳胶免疫凝集测定法。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中进行的由夹心ELISA法的测定是，在前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的N末端的抗体或其抗体片段及识别5. 9kDa肽的C末端的抗体或其抗体片段之中一方维持其抗原识别能力的实施方式中，使用由标记物质、例如，HRP等的标记酶、胶体金、铕等的标记金属、FTTC、若丹明、德克萨斯红、Alexa, GFP等的化学、生物学的各种荧光物质、32P、51Cr等的放射性物质等标记的标记抗体或标记抗体片段。再者，本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中进行的由夹心ELISA法的测定是，在上述标记抗体或标记抗体片段中未使用的另一方的抗体或其抗体片段维持其抗原识别能力的实施方式中，使用将固相、即，聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯等向作为原料的基材、例如，塑料管或微滴定板直接或间接物理结合或化学结合、利用亲和性等结合的固相结合抗体或固相结合抗体片段。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中进行的由夹心ELISA法的测定可使用上述标记抗体或标记抗体片段和固相结合抗体或固相结合抗体片段，通过公知的方法进行。即，首先，向固相结合抗体或固相结合抗体片段加待测样品而使反应，反应一定时间之后，清洗固相，加标记抗体或标记抗体片段而再反应2次。接下来，再度清洗固相，加发色底物等而进行反应。其中，发色底物而言，作为标记抗体或标记抗体片段的标记物质使用HRP时，可使用已知的DAB、TMB等。本发明中提供的由夹心ELISA法的5. 9kDa肽免疫学测定用试剂盒具备前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中进行的由夹心ELISA法的测定中使用的标记抗体或标记抗体片段及固相结合抗体或固相结合抗体片段。再者，本发明中提供的由夹心ELISA法的5. 9kDa肽免疫学测定用试剂盒可含底物、待测样品稀释液、清洗液、阳性对照、阴性对照等。其中，为了简便并且迅速地测定多个待测样品，优选以用自动ELISA装置测定可能的免疫学测定试剂盒构成。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中进行的由乳胶免疫凝集测定法的测定使用致敏不溶性载体粒子的前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法及免疫学测定用试剂盒中使用的，或者，本发明中提供的识别5. 9kDa肽的N末端的抗体或其抗体片段和识别5. 9kDa肽的C末端的抗体或其抗体片段。其中，向不溶性载体粒子的抗体或其抗体片段的致敏是指，在维持其抗原识别能力的实施方式中，直接或间接物理结合或化学结合、利用亲和性等而向不溶性载体粒子结合抗体或其抗体片段。不溶性载体粒子而言，可举出例如，如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物一样的有机高分子的如乳胶或氧化硅、氧化铝一样的无机氧化物等。致敏不溶性载体粒子的上述2种抗体或它们的抗体片段的使用实施方式而言，使用由上述2种抗体或它们的抗体片段的两方致敏1个不溶性载体粒子而得到的仅1种不溶性载体粒子也可，将由上述2种抗体或它们的抗体片段分别致敏不同的不溶性载体粒子而得到的2种不溶性载体粒子混合而使用也可，将这3种不溶性载体粒子混合而使用也可。本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中进行的由乳胶免疫凝集测定法的测定可使用上述2种不溶性载体粒子，通过公知的方法进行。S卩，向待测样品加上述2种不溶性载体粒子而进行反应，反应一定时间之后，测定形成的凝集。本发明中提供的由乳胶免疫凝集测定法的5. 9kDa肽免疫学测定用试剂盒具备致敏前述的本发明的5. 9kDa肽的免疫学测定方法中进行的由乳胶免疫凝集测定法的测定中使用的不溶性载体粒子的识别5. 9kDa肽的N末端的抗体或其抗体片段和识别5. 9kDa肽的C末端的抗体或其抗体片段。再者，本发明中提供的由乳胶免疫凝集测定法的5. 9kDa肽免疫学测定试剂盒可含待测样品稀释液、阳性对照、阴性对照等。其中，为了简便并且迅速地测定多个待测样品，优选作为用自动乳胶免疫凝集测定装置测定可能的免疫学测定试剂盒而构成。接下来举实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。实施例实施例1识别5.9kDa肽的N末端区域的抗体、及，识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体的制成及其特性的鉴定(1)免疫原的制成为了制成识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体、及，识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体，制成包含含有5. 9kDa肽的N末端或C末端的氨基酸序列的肽的免疫原。具体而言，首先，合成在由SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第1 17的17个氨基酸残基组成的抗原肽(以下，也称之为5. 9N)的C末端导入为了结合抗原肽和载体而使用的Cys残基的肽、即有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的肽。另外，合成5. 9kDa肽的C末端起的15个残基、S卩，在由SEQ ID NO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的从N末端起第40 M的15个氨基酸残基组成的抗原肽(以下，也称之为5. 9C)的N末端导入为了结合抗原肽和载体而使用的Cys残基的肽、即有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的肽。接下来，向这些的肽的N末端Cys残基或C末端Cys残基通过MBS (马来酰亚胺苯甲酰氧基琥珀酸亚胺)法缀合作为载体的匙孔青贝血蓝蛋白(KLH)，制成作为免疫原使用的复合物。O)向小鼠的免疫上述⑴中得到的免疫原施用给小鼠，得到免疫小鼠。具体而言，首先，将上述(1)中制成的含5. 9N、或者，5. 9C的免疫原分别用PBS溶解至达到lmg/ml。接下来，取50 μ 1(50 μ g)与弗罗因德完全佐剂(和光纯药工业)50 μ 1充分混和至乳化。接下来，将制备的悬浮液向Balb/c6周龄雌小鼠(日本Clea)在二乙基醚麻醉下各自腹腔内施用。2周后，将含同量的5. 9N、或者，5. 9C的免疫原与弗罗因德不完全佐剂(和光纯药工业)混和，通过与弗罗因德完全佐剂之时完全同样的操作，作为乳化悬浮液，各自施用到小鼠。往后每2周进行同样的操作，在第4次，作为最终免疫将含5. 9N、或者，5. 9C的免疫原50 μ 1 (50 μ g)通过小鼠尾静脉注射施用。(3)杂交瘤的确立将上述O)中得到的免疫小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合而制成杂交瘤。具体而言，首先，最终免疫含5. 9N、或者，5. 9C的免疫原的3天后，将由各自的小鼠在二乙基醚麻醉下外科摘出的脾脏无菌分散，制备脾脏细胞。细胞融合根据Kohler和Milstein 的方法(Kohler，G.& Milstein，C. Nature，256，495-497，1975)进行，使用聚乙二醇(PEG4000) (Merck)将脾脏细胞和骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8_Ul (P3U1)融合。融合比率是相对于脾脏细胞数8\107个而骨髓瘤细胞？3163488』1( 3肌)2\107个，是约4 1。将融合细胞分散到 10% FCS(INVITROGEN) α -MEM(IRVINE)HAT (Cosmo Bio)培养基而分注到96孔微滴定培养板(住友Bakelite)，在37°C、5% CO2条件下培养。⑷集落的筛选
在确立上述(3)的杂交瘤的约2周后，确认集落的生长，筛选产生抗体的杂交瘤。具体而言，首先，为了制成筛选用板而将上述(1)中合成的5.9N、或者，5.9C溶解到PBS中，分注到96孔微滴定板(Nunc)至达到2 μ g/100 μ 1/孔。接下来，将板于4°C静置2晚之后，用含0.05% Tween20 (PBS-T)(和光纯药工业)的PBS清洗3次，为了抑制非特异性反应而分注200μ1用PBS稀释4倍的N-102(日本油脂)溶液，再于4°C静置1晚。接下来，将完成的板用PBS-T清洗1次之后，使与上述(3)中得到的杂交瘤的培养上清100 μ 1反应，再进行清洗之后，加作为第二抗体的HRP标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(Zymed)而进行反应。清洗后，加100 μ 1作为HRP的发色底物的，TMB溶液(Kainos)而发色一定时间之后，再添加100 μ 1作为停止液的IN硫酸(和光纯药工业)，对测定波长450nm处的吸光度进行测定。通过上述筛�。杂谂卸衔粜缘目寺。ü邢尴∈头ń性倏寺。俣热啡仙锨�。作为结果，得到与致敏5. 9N的板反应的杂交瘤5. 9N-06、及，与致敏5. 9C的板反应的杂交瘤5. 9C-02。再有，得到的杂交瘤的培养上清与对照的BSA板完全不反应。杂交瘤5. 9N-06及5. 9C-02在2009年8月19日国内保藏到〒292-0818本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心(NPMD)，作为保藏号，各自赋予NITE P-797及NITE P-798。其后，将这些的国内保藏在2010年8月20日，基于布达佩斯条约进行向国际保藏的移管请求，在2010年9月13日作为国际保藏号，各自赋予NITE BP-797及NITEBP-798。(5)抗体的同种型鉴定鉴定上述中得到的杂交瘤5.9N-06、及，杂交瘤5.9C-02各自产生的单克隆抗体抗-5. 9N、及，抗-5. 9C的同种型。具体而言，使用单克隆抗体分型试剂盒(Amersham Pharmacia)，根据附带的使用说明书，检验各自的杂交瘤产生的抗体的同种型。作为结果，确认单克隆抗体抗-5. 9N、及，抗-5. 9C属于表1所示的同种型。表1单克隆抗体的同种型
权利要求
1.5. 9kDa肽的免疫学测定方法，其特征在于，使识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段，以及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段与待测样品中的有SEQID NO 1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(5. 9kDa肽)接触而生成5. 9kDa肽和该2种抗体或它们的抗体片段的免疫复合物，以及测定得到的免疫复合物。
2.权利要求1所述的免疫学测定方法，其中，识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第1 39的氨基酸区域中存在的任何表位的抗体，识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第18 M的氨基酸区域中存在、并且相比识别上述N末端区域的抗体所识别的表位位于更C末端侧的任何表位的抗体，且这2种抗体所识别的表位不互相重复，并且，这2种抗体不互相妨碍与5. 9kDa肽的结合。
3.权利要求1或2所述的免疫学测定方法，其中识别5.9kDa肽的N末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位的抗体。
4.权利要求1 3之任一项所述的免疫学测定方法，其中识别5.9kDa肽的C末端区域的抗体是识别在5. 9kDa肽的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位的抗体。
5.权利要求1 4之任一项所述的免疫学测定方法，其中通过夹心ELISA法测定免疫复合物。
6.权利要求1 4之任一项所述的免疫学测定方法，其中通过乳胶免疫凝集测定法测定免疫复合物。
7.权利要求1 6之任一项所述的免疫学测定方法，其中待测样品是全血、血清、血浆、尿、唾液、脑脊髓液、胸水、腹水、心囊水、关节液、或者，淋巴液，且有包含5. 9kDa肽的可能性。
8.5. 9kDa肽的免疫学测定用试剂盒，其包含识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段、和识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段。
9.权利要求8所述的免疫学测定用试剂盒，其包含识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段、和识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段，且任何一方的抗体或其抗体片段是被标记的标记抗体或标记抗体片段，另一方的抗体或其抗体片段是结合到固相的固相结合抗体或固相结合抗体片段，且其用于由夹心ELISA法测定5. 9kDa肽。
10.权利要求8所述的免疫学测定用试剂盒，其包含致敏不溶性载体粒子的识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段，和致敏不溶性载体粒子的识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段，且其用于由乳胶免疫凝集测定法测定5. 9kDa肽。
11.权利要求10所述的免疫学测定用试剂盒，其包含用识别5. 9kDa肽的N末端区域的抗体或其抗体片段，以及识别5. 9kDa肽的C末端区域的抗体或其抗体片段的2种抗体或它们的抗体片段的两方致敏1个不溶性载体粒子而得到的1种不溶性载体粒子；用该2种抗体或其抗体片段分别致敏不同的不溶性载体粒子而得到的2种不溶性载体粒子；或者这3种不溶性载体粒子的混合物。
12.抗体或其抗体片段，其识别在5.9kDa肽的从N末端起第1 17的氨基酸区域中存在的表位。
13.抗体或其抗体片段，其识别在5.9kDa肽的从N末端起第40 M的氨基酸区域中存在的表位。
全文摘要
通过使识别肽标记物的N末端的抗体和识别肽标记物的C末端的抗体与疑似在含有混杂肽的活体来源样品中存在的作为人纤维蛋白原α-E链或α链的分解产物的分子量5.9kDa的肝脏疾病诊断用肽标记物接触而形成该肽标记物和2种抗体的免疫复合物，以及免疫学测定得到的免疫复合物来可特异性地测定该肽标记物。
文档编号G01N33/53GK102597772SQ20108004860
公开日2012年7月18日申请日期2010年10月13日优先权日2009年10月28日
发明者三浦俊英, 佐藤百惠, 小岛良, 曾川一幸, 清川严, 菊地涉, 野村文夫, 野田健太申请人:日东纺绩株式会社

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5.9kDa肽的免疫学测定方法