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专利名称：一种用生物传感器检测脂酶非均相催化反应过程的方法
技术领域：
本发明涉及一种用生物传感器检测固定化脂酶非均相催化反应过程的方法。
背景技术：
随着科学技术的发展，生物传感器已经成为生物质技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质分子水平的快速、微量分析方法，具有较高的选择性和灵敏度生物传感器是一种特殊的器件或装置，应用的是生物机理，与传统的化学传感器和离线分析技术落后相比，具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、能在复杂体系中进行快速在线监测等优点。基本工作原理是将生物敏感元件发生的特异性反应及信号经由物理元件——换能器，转变为光、电、声等易检测信号，从而可将反映程度用离散或连续的数字信号表达出来，间接地获知待测物的有关信息。目前生物传感器主要应用于食物、农业、 生物技术、药物和军事领域。但目前还没有利用生物传感器检测脂肪酶催化反应过程的方法。

发明内容
本发明提供一种用生物传感器检测脂酶非均相催化反应过程的方法，以解决目前还没有利用生物传感器检测脂肪酶催化反应过程的方法的问题，将固定化脂肪酶催化底物所产生的电子转移过程转换成电流或电阻并输出，从而判断脂肪酶催化反应的终点。使用本发明方法的装置包括恒温水浴锅1、敞口玻璃容器2、圆柱形石墨体3、钼片 4、玻璃板、离子交换膜5、阴极室7以及阴极室内缓冲溶液、阳极室6以及阳极室内缓冲液、 电流表8、电阻9、单片机10、仿真机11、PC机12、电路板13、5V电源14和钼丝15 ；敞口玻璃容器2置于恒温水浴锅1中，圆柱形石墨体3和钼片4分别置于阴极室7和阴极室6中，阴极室7和阳极室6之间由玻璃板隔断，且阴极室6与阴极室7之间由安装在玻璃板上的离子交换膜5相连通，圆柱形石墨体3与钼片4之间由钼丝15相连接，电流表8和电阻9串联在钼丝15上，电阻9的中间抽头连接在单片机10的信号输入端上，仿真机11的一个通信端口连接单片机10，仿真机11的另一个通信端口连接PC机12，5V电源14给单片机10 提供电源；本发明的步骤如下步骤一水浴温度65°C，采用恒温水浴控制；步骤二 制取阳极液PBS 称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钠分别为1. 36g和1. 42g， 用200ml去离子水配制成浓度为0. lmol/L的缓冲溶液(PBS)；步骤三制取阴极液用去离子水将铁氰化钾配成过饱和溶液，阴极液为铁氰化钾过饱和溶液和PBS的混合液；步骤四测试将缓冲溶液的PH分别调到6、7、8，再将Novozym 435固定化脂肪酶 0. 09g与甘油三酯快速混勻，置于阴极室内；步骤五记录电流强度采用灵敏电流表分别对三种不同PH环境下的电流强度进行测试进行测试，每隔半分钟记录一次数值；步骤六实验过程五中取不同反应时间的混合液进行离心分离，得到的上层液用液相色谱测出脂肪酸和酯的含量，从而验证电流值与脂肪酸和酯之间含量的对应关系。本发明是以固定化脂肪酶作为生物元件，以甘油三酯为反应底物，设计、研制了能将脂肪酶催化底物所产生的电子转移转换为电流或电阻输出的电化学生物传感器，并研究了 PH变化对其输出数据的影响。固定化脂肪酶生物传感器能够将脂肪酶的专一性、灵敏性和电学的简便、迅速巧秒地结合起来，可以在一个复杂的体系中，不受其他物质干扰，快速准确的测出某些物质的含量，并可测定酶与底物反应的程度。


图1是本发明应用的装置的结构示意图。
具体实施例方式具体实施方式
一结合图1说明，本实施方式如下使用本发明方法的装置包括恒温水浴锅1、敞口玻璃容器2、圆柱形石墨体3、钼片 4、玻璃板、离子交换膜5、阴极室7以及阴极室内缓冲溶液、阳极室6以及阳极室内缓冲液、 电流表8、电阻9、单片机10、仿真机11、PC机12、电路板13、5V电源14和钼丝15 ；敞口玻璃容器2置于恒温水浴锅1中，圆柱形石墨体3和钼片4分别置于阴极室7和阴极室6中，阴极室7和阳极室6之间由玻璃板隔断，且阴极室6与阴极室7之间由安装在玻璃板上的离子交换膜5相连通，圆柱形石墨体3与钼片4之间由钼丝15相连接，电流表8和电阻9串联在钼丝15上，电阻9的中间抽头连接在单片机10的信号输入端上，仿真机11的一个通信端口连接单片机10，仿真机11的另一个通信端口连接PC机12，5V电源14给单片机10 提供电源；步骤一恒温水浴锅1内的水浴温度为65°C，采用恒温水浴控制；步骤二 制取阳极液PBS 称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钠分别为1. 36g和1. 42g， 用200ml去离子水配制成浓度为0. lmol/L的缓冲溶液(PBS)；步骤三制取阴极液用去离子水将铁氰化钾配成过饱和溶液，阴极液为铁氰化钾过饱和溶液和PBS的混合液；步骤四测试将溶液的pH分别调到6、7、8，再将固定化脂肪酶0.09g与甘油三酯快速混勻，置于阴极室内；步骤五记录电流强度采用灵敏电流表分别对三种不同PH环境下的电流强度进行测试进行测试，每隔半分钟记录一次数值；步骤六实验过程五中取不同反应时间的混合液进行离心分离，得到的上层液用液相色谱测出脂肪酸和酯的含量，从而验证电流值与脂肪酸和酯之间含量的对应关系。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤一中恒温水浴的温度为50 70°C，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤二中PBS的浓度为0. 01 lmol/L，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤四中的PH为5 9，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤四固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 1 0. 3%，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤五中记录时间为 1 60秒。其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。步骤一水浴温度65°C，采用恒温水浴控制；步骤二 阳极液PBS:称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钠分别为1.36g和1. 42g，用 200ml去离子水配制成浓度为0. lmol/L的缓冲溶液液(PBS)；步骤三阴极液用去离子水将铁氰化钾配成过饱和溶液，阴极液为铁氰化钾过饱和溶液和PBS的混合液；步骤四离子交换膜阳极室和阴极室之间安装离子交换膜；步骤五按照说明书附图连接反应装置；步骤六测试将溶液的pH分别调到6、7、8，再将固定化脂肪酶0. 09g与甘油三酯 3ml快速混勻，置于阴极室内，分别对三种不同pH环境下的电流强度进行测试；步骤七记录电流强度采用灵敏电流表对电路中的电流强度进行测试，每隔30 秒记录一次数值；步骤八实验过程中将混合液进行离心分离，得到的上层液用液相色谱测出脂肪酸和酯的含量，从而验证实验的结论。本实施方式中采用的主要设备为恒温水浴锅。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤一中恒温水浴的温度为50 70°C，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤二中PBS的浓度为0. 01 lmol/L，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤四中的pH为5 9，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤四固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 1 0. 3%，其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同点在于步骤五中记录时间为 1 60秒。其它组成和步骤与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.一种用生物传感器检测脂酶非均相催化反应过程的方法，其特征在于在阴极室的缓冲液铁氰化钾过饱和溶液和PBS的混合液中，固定化脂肪酶催化底物产生离子，离子通过离子交换膜进入阳极室，在石墨和钼片之间形成了循环电路，因此，电子转移过程转换成电流或电阻输出。本方法基于下述装置实现一种在线监控脂酶非均相催化反应生物传感器装置，其特征在于所述一种监测固定化脂肪酶水解过程的生物传感器装置，将敞口玻璃容器置于恒温水浴锅中，而圆柱形石墨和钼片又分别置于阴极室和阳极室中，且阴极室与阳极室之间由离子交换膜相连通，石墨与钼片之间由钼丝相连接，电阻R和电源与之串联。在电阻R上连一单片机，单片机又分别于5V电源、电路板和仿真机连接最后仿真机连接于PC 机上。此过程通过以下步骤实现步骤一水浴温度65°C，采用恒温水浴控制；步骤二 阳极液PBS 称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钠分别为1. 36g和1. 42g，用200ml去离子水配制成浓度为0. lmol/L的缓冲溶液液(PBS)；步骤三阴极液用去离子水将铁氰化钾配成过饱和溶液，阴极液为铁氰化钾过饱和溶液和PBS的混合液；步骤四离子交换膜阳极室和阴极室之间安装离子交换膜；步骤五按照说明书附图连接反应装置；步骤六测试将溶液的PH分别调到6、7、8，再将固定化脂肪酶0. 09g与甘油三酯快速混勻，置于阴极室内，分别对三种不同PH环境下的电流强度进行测试；步骤七记录电流强度采用灵敏电流表对电路中的电流强度进行测试，每隔半分钟记录一次数值；步骤八实验过程中将混合液进行离心分离，得到的上层液用液相色谱测出脂肪酸和酯的含量，从而验证实验的结论。
2.根据权利要求1所述的一种用生物传感器检测固定化脂酶非均相催化反应过程的方法，其特征在于步骤一中恒温水浴的温度为50 70°C。
3.根据权利要求1所述的一种用生物传感器检测固定化脂酶非均相催化反应过程的方法，其特征在于步骤二中PBS的浓度为0. 1 lmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种用生物传感器检固定化测脂酶非均相催化反应过程的方法，其特征在于步骤六中的pH为5 9。
5.根据权利要求1所述的一种用生物传感器检测固定化脂酶非均相催化反应过程的方法，其特征在于步骤六固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 01 0. 3%。
6.根据权利要求1所述的一种用生物传感器检测固定化脂酶非均相催化反应过程的方法，其特征在于步骤七中记录时间为1 60秒。
全文摘要
一种脂酶非均相催化反应的生物传感器的研究方法。本发明将固定化脂肪酶催化底物所产生的电子转移过程转换成电流或电阻并输出，从而判断脂肪酶催化反应的终点。本发明的步骤如下首先按照说明书附图连接装置，然后将PBS放入阳极室内；PBS和铁氰化钾过饱和溶液的混合液放入阴极室内。将底物和固定化脂肪酶快速混匀，置于阴极室内进行测试。用液相色谱测出脂肪酸和酯的含量，测出相对误差仅为4.7％，验证了本发明可快速准确地测定酶与底物反应过程中发生的酯键断裂程度。本发明以固定化脂肪酶作为生物元件，将脂肪酶的专一性、灵敏性和电学的简便、迅速巧秒地结合起来，可准确输出电学信号，推算出反应底物的自重，从而决定反应终点。
文档编号G01D5/12GK102212609SQ20111008150
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者于殿宇, 孔庆明, 富校轶, 张佳宁, 张敏, 时敏, 李振岚, 李越, 王妍, 王玉, 王立琦, 王雪, 齐颖 申请人:哈尔滨商业大学