专利名称：单个荧光探针的定位方法、装置及超分辨成像方法、系统的制作方法
技术领域：
本发明属于显微成像领域，尤其涉及一种单个荧光探针的定位方法、装置及超分辨成像方法、系统。
背景技术：
荧光显微成像由于受光学衍射极限的限制，其空间分辨率只能达到横向约200nm、 轴向约600nm。对于尺度小于衍射极限的单个荧光探针来说，探测到荧光图像的大小是由显微光学系统的艾里斑确定的，而该荧光探针的实际空间位置可由该弥散斑的质心确定， 其定位精度可达纳米级。单个荧光探针的定位和探测为监测蛋白质及生物大分子的动力学过程提供了强大的工具，成为细胞生物学最重要的研究领域之一，如在感染过程中的流感病毒的运动，分子马达的运动等。超分辨荧光成像可以以纳米级的空间分辨率直观地显示被标记分子在被标记物内的空间分布，并能用来研究被标记分子之间的相互作用过程，可用于生物领域研究细胞内DNA、RNA与蛋白质分子之间的相互作用和运动规律。目前常用的荧光成像方法是利用荧光标记物本身的开关效应来进行定位的显微成像技术，通过时分复用、质心定位以及图像复合来进行纳米分辨成像。例如，光敏定位显微(PALM)、随机光学重建显微(STORM)等等，它们在每个时刻获取稀疏分布的荧光标记物的定位信息，然后将不同时刻获得的定位信息叠加，最终实现高横向纳米分辨。结合轴向分辨辅助元件或方法，可进行三维纳米显微成像。根据基于单分子定位方法的超分辨荧光显微的原理可知，单分子定位方法的优劣对超分辨图像质量和数据处理速度都有重要的影响，提高荧光分子的定位速度是进行实时成像的重要途经。目前，单个荧光探针定位方法主要有质心法、高斯拟合法、极大似然法，解线性方程组法，马良算法等。在这些方法中，质心法速度快，但定位精度较低。高斯拟合法在弱信号水平下能保持较高的定位精度，从而成为超分辨成像中应用最广泛的一种定位方法，然而该方法需要进行迭代拟合运算，收敛速度和精度对初始值的选取有很强的依赖性，并且非�：氖薄＜笏迫环ㄒ彩且桓龅呕椒ǎ敫咚鼓夂戏ù嬖谕奈侍狻＝庀咝苑匠套榉ㄊ窃谥烙夥肿映上衲Ｐ陀氡尘霸肷慷鹊那榭鱿拢汲鲆桓鱿咝苑匠套椋ü蠼庀咝苑匠套榛竦糜夥肿拥木肺恢茫盟惴ㄋ俣群芸欤栽肷拦烙泻芮康囊览敌�。 马良算法将极大似然估计和图形处理单元(graphics processing unit, GPU)并行计算相组合，实现了单分子定位的快速运算，但算法的本质还是一种迭代优化算法。并且，对厚样品成像来说，精确估计噪声是非常困难的，非焦面荧光在不同的获取时刻在空间和时间上都是变化的，即使是在均勻光照明下，CCD中不同的像素也具有不同的噪声和背景标准，因此该方法受噪声的影响仍然很大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单个荧光探针的定位方法，旨在解决传统定位方法定位速度慢及受噪声影响大的问题。
本发明是这样实现的，ー种单个荧光探针的定位方法，所述方法包括下述步骤以所述单个荧光探针的荧光图像的极大值点为中心，选取一矩形区域；对所述矩形区域内的荧光图像进行傅里叶变换，获得所述荧光图像的傅里叶频 谱
权利要求
1. 一种单个荧光探针的定位方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤 以所述单个荧光探针的荧光图像的极大值点为中心，选取一矩形区域； 对所述矩形区域内的荧光图像进行傅里叶变换，获得所述荧光图像的傅里叶频谱
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的矩形区域的宽度为成像系统的点扩散函数的半高全宽的2 5倍。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述矩形区域内的荧光图像进行傅里叶变换，获得所述荧光图像的傅里叶频谱的步骤具体为采用补零快速傅里叶变换算法对所述矩形区域内的荧光图像进行傅里叶变换，获得所述荧光图像的傅里叶频谱。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述步骤对单个荧光探针进行轴向定位，获取轴向位置坐标；将所述轴向位置坐标与所述二维位置坐标相结合，获得所述单个荧光探针的三维位置坐标。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对单个荧光探针进行轴向定位，获取轴向位置坐标的步骤具体为分别在成像系统的像焦平面的前方和后方相同距离处采集所述单个荧光探针的荧光图像；将采集的两幅荧光图像的荧光强度信号差动相减，根据相减后得到的探测信号确定荧光标记物的轴向位置。
6.一种超分辨荧光显微成像方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤采集多幅荧光图像；在每幅荧光图像中搜索极大值点；采用权利要求1至5任一项所述的单个荧光探针的定位方法对每幅图像的每个极大值点对应的图像区域进行分析，获取全部荧光探针的位置信息； 根据全部荧光探针的位置信息描绘出超分辨荧光图像。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述在每幅荧光图像中搜索极大值点的步骤具体为将每幅荧光图像的强度与预设强度阈值进行比较，选取所述强度大于所述阈值的点作为所述极大值点。
8.—种单个荧光探针的定位装置，其特征在于，所述定位装置包括区域选取单元，用于以单个荧光探针的荧光图像的极大值点为中心，选取一矩形区域；傅里叶变换单元，用于对所述矩形区域内的荧光图像进行傅里叶变换，获得所述荧光图像的傅里叶频谱
9.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述装置还包括轴向定位单元，用于根据荧光图像对单个荧光探针进行轴向定位，获取轴向位置坐标；三维坐标获取单元，用于将所述轴向位置坐标与所述二维位置坐标相结合，获得所述单个荧光探针的三维位置坐标。
10.一种超分辨荧光显微成像系统，其特征在于，所述系统包括用于采集多幅荧光图像的图像采集器，以及与所述图像采集器相连接、用于获取超分辨荧光图像的图像处理器；所述图像处理器包括权利要求8或9所述的单个荧光探针的定位装置；以及输入端与所述图像采集器相连接、输出端与所述定位装置相连接的搜索装置，用于搜索每幅荧光图像的极大值点；与所述定位装置相连接的重构装置，用于根据所述定位装置输出的每个荧光探针的位置信息重构超分辨荧光图像。
全文摘要
本发明适用于显微成像领域，提供了一种单个荧光探针的定位方法、装置及超分辨成像方法、系统，该定位方法包括下述步骤以单个荧光探针的荧光图像的极大值点为中心，选取一矩形区域；对矩形区域内的荧光图像进行傅里叶变换，获得所述荧光图像的傅里叶频谱；获得荧光图像的傅里叶频谱的相移；对相移进行梯度运算，获得单个荧光探针的二维位置坐标。该定位方法是一种噪声自由的频率域非迭代的定位方法，对运算初始值的选取及噪声的评估没有依赖性，可实现快速、精确定位。基于该定位方法的超分辨荧光显微成像方法可以对探测物品中的多个荧光探针进行快速定位。该定位方法及成像方法在活体细胞三维纳米成像和单分子追踪等方面具有广阔的应用前景。
文档编号G01N21/64GK102288589SQ201110171648
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者于斌, 屈军乐, �：┍�, 陈丹妮 申请人:深圳大学
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