专利名称：鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体及其应用的制作方法
鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体及其应用本发明涉及鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，同时涉及所述单克隆抗体的制备方法以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体在检测Pla中的应用、以及含有所述单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条及其在检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫中的应用。
背景技术：
鼠疫(Plague)是由耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性烈性传染病。鼠疫免疫检测是鼠疫防治工作中的一个重要环节，其在鼠疫的发现、疫区处理及临床诊断中发挥至关重要的作用。传统的鼠疫免疫检测，主线是针对Fl抗原。Fl抗原是由耶尔森氏鼠疫杆菌pMTl 质粒上cafl基因编码的一种荚膜蛋白。长期以来，Fl抗原被认为是鼠疫杆菌的特异性抗原，基于Fl的抗原、抗体检测方法被认为是较可信的鼠疫检测和诊断方法。然而，自然界已发现存在天然缺失Fl抗原的鼠疫菌株，加之，Fl抗原是一种温度调控表达抗原，在37°C时大量表达，而在时不予表达或微量表达，这也限制了它的应用研究范围。发展除Fl抗原外的检测和诊断技术较为必要，是鼠疫防治工作中的一个重要课题。鼠疫菌纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator,Pla)是鼠疫菌特有的pPCPl 质粒编码的细胞表面蛋白酶，研究表明，鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白是鼠疫菌从皮下感染扩散到循环系统的重要毒力因子(Sodeinde OA, Subrahmanyam YV, Stark K， et al. A surface protease and the invasive character of plague[J]Science,1992, 258(6) :1004-1007 ；Goguen JD, Hoe NP, Subrahmanyam YVBK. Proteases and bacterial virulence :a view fromthe trenches [J]. Infect Agents Dis，1995，4 (1) :47-54)，在鼠疫菌致病过程中发挥重要作用。且Pla的转录、翻译不受温度限制。针对Pla蛋白进行检测，对于鼠疫菌的检测和/或辅助诊断鼠疫，特别是对于Fl抗原缺失鼠疫菌株以及非37°C 条件生长的鼠疫菌株(特别是鼠疫的传播媒介蚤的检测)具有重要意义。目前对鼠疫菌Pla的检测主要是采用PCR技术，并取得了较好的检出效果。然而， 该方法对技术操作要求比较高，且检测过程需要数小时，时间较长。另一方面，单克隆抗体相较于多克隆抗体，具有特异性强、敏感性高的优点，可作为相关抗原的生物学功能研究的重要工具，用于Western blot、免疫沉淀、免疫细胞化学等实验，对于抗原的研究、相关疾病的检测、诊断、预后判断等具有重要意义。但目前未见国内有关于鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，该单克隆抗体对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性。本发明的另一个目的在于提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的另一个目的在于提供制备所述单克隆抗体的方法。本发明的另一个目的在于提供所述单克隆抗体在检测Pla蛋白中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条，它具有检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫作用。该胶体金免疫层析试纸条上含有本发明所述的单克隆抗体。本发明应用杂交瘤技术制备了鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体。首先，本发明的一个方面是提供了一种对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性的单克隆抗体。本发明中所述的“抗体的特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，识别抗原的能力就强。在本发明的一个具体实施方案中， 本发明的单克隆抗体对GST (谷胱苷肽转移酶)-Pla融合蛋白、天然Pla蛋白有特异性，对谷胱苷肽转移酶没有特异性。在本发明的一个优选的具体实施方案中，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO. C201091或CCTCC NO. C201094的杂交瘤细胞株分泌产生。抗体类型分别属于IgGl和IgG2a。本发明的另一个方面提供了产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定，产生本发明单克隆抗体的两株杂交瘤细胞株已保藏在国际保藏单位之一——中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC，地址中国武汉市武汉大学，邮政编码430072)，保藏日期2010 年 9 月 16 日，保藏编号CCTCC NO. C201091、CCTCC NO. C201094。本发明的另一个方面提供了一种制备所述单克隆抗体的方法。在本发明的实施方案中，是将Pla蛋白与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，以制备获得本发明的单克隆抗体。所述的标签选自谷胱苷肽-S-转移酶标签(GST标签)，在本发明的一个具体实施方案中，采用GST与去除信号肽的Pla蛋白形成的重组蛋白。制备本发明的单克隆抗体所用的抗原可以按本领域技术人员已知的常规方法制备。例如本发明Pla蛋白可以是重组蛋白，或从鼠疫菌中提取并纯化得到的天然Pla蛋白。在本发明的一个优选的具体实施方案中，以GST-Pla融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞作为能够产生抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。 还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行(Milstein et al., Mechods Enzymol.，1981，73，3-46)。更具体地说，免疫细胞和骨髓瘤细胞可以按照1 4 1 10的比例在培养基中充分混合，在融合促进剂的作用下进行细胞融合，例如将预热至 37°C的PEG (分子量1000 6000)溶液以30% 60% (W/V)的比例加入培养基。此外，还可以根据需要适当加入佐剂(如二甲基亚砜)以增强融合效果。用于融合的培养基包括 RPMI-1640培养基、DMEM培养基以及其他可用于此类培养的培养基，并根据需要补加适量的新生小牛血清等物质。可以用普通的选择培养基筛选杂交瘤细胞，例如用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT培养基。在HAT培养基中持续培养足够的时间，以使杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，一般为几天至几周。
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然后筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞并进行单克隆化。得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞制备本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于获取大量、高效价抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和色谱等方法。在本发明的一具体实施方案中，所述制备单克隆抗体的方法包括用GST-Pla融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对天然Pla蛋白有反应性、对谷胱苷肽转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物产生的腹水中获取单克隆抗体。在该方案中，具体是用纯化的GST-Pla融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠，血清效价达1 IO4 IO5时，将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。HAT选择培养第10天，杂交瘤细胞融合率为65%以上。融合后第10天进行第一次ELISA筛选、亚克�。撕笾馗唇蠩LISA筛选及亚克隆3 4次， 直至克隆阳性率100%。该方案中筛选出了 3株杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株 15 、杂交瘤细胞株19A4、杂交瘤细胞株HH4，该3株杂交瘤细胞株能稳定分泌抗Pla的单克隆抗体。将这些株杂交瘤细胞扩大培养并腹腔注射BALB/c小鼠，能诱导小鼠产生抗Pla 的腹水，腹水产量2 IOml/只，其效价达1 106。这对于将其应用于诊断技术创造了较好条件。杂交瘤细胞株15 、杂交瘤细胞株19A4、杂交瘤细胞株HH4所分泌产生的单克隆抗体(本发明中命名为单克隆抗体15 、单克隆抗体19A4、单克隆抗体14H4)，具有高度的抗原结合特异性。在本发明的一具体实施方案中，为分析Pla单克隆抗体的特异性，本发明用纯化的GST及GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白进行间接ELISA检测，实验结果表明，3株单克隆抗体与包被的纯化GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白均为强阳性反应，与包被的GST 蛋白均为阴性反应。以天然Pla蛋白为抗原，3株单克隆抗体为一抗，HRP-SPA为二抗进行 Western blot实验，结果显示3株单克隆抗体能特异性地识别提取天然蛋白中的Pla蛋白。本发明还提供了本发明的单克隆抗体的用途。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了所述单克隆抗体在检测Pla蛋白的水平中的应用。本发明还提供了一种检测Pla蛋白的制剂，该制剂含有本发明所述的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体特异性强、纯度高、效价高，可同时应用于ELISA方法，Western Blot杂交，免疫组织化学和细胞免疫化学方法检测Pla蛋白的表达水平。本发明的另一个方面还提供了所述单克隆抗体在制备检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条中的应用。本发明提供了一种检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条，该胶体金免疫层析试纸条上含有本发明所述的单克隆抗体。该含有本发明所述的单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条可用于检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫。由于本发明的单克隆抗体具有高度的抗原结合特异性，利用本发明的单克隆抗体建立检测技术，可作为鼠疫菌的检测和/或鼠疫的辅助诊断，尤其是对于Fl抗原缺失鼠疫菌株及非37°C条件生长的鼠疫菌株的诊断具有重要意义。因此，本发明的另一个方面还提供了本发明的单克隆抗体在制备用于检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫的制剂中的应用。本发明通过大量的实验研究证实本发明的单克隆抗体，具有高度的抗原结合特异性，主要的实验证据包括免疫小鼠应用GST-Pla融合蛋白，而获得的单克隆抗体经 ELISA法检测证实，与包被纯化的GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白为强阳性反应，而与包被GST蛋白均为阴性反应，且抗体效价达10_6。同时，以天然Pla蛋白为抗原，3株单克隆抗体为一抗，HRP-SPA为二抗进行Western blot实验，结果显示3株单克隆抗体能特异性地识别提取天然蛋白中的Pla成分，而与其它成分未发生反应。所以，本发明所制备的Pla单克隆抗体为进一步深入研究Pla的功能及其致病机制奠定了基�。欣谏钊胩教諴la的功能，将其用于针对Pla蛋白的检测，对于鼠疫菌的检测和/或辅助诊断，特别是对于Fl抗原缺失鼠疫菌株以及非37°C条件生长的鼠疫菌株的诊断具有重要意义。
图1显示转化体BL21_rPla诱导表达产物Pla的SDS-PAGE分析结果。图中，1 分子量标准；2 转化体BL21-rPla诱导表达后的菌体裂解后沉淀；3 转化体BL21_rPla诱导表达后的菌体裂解后上清；4 转化体BL21-rPla诱导前全菌蛋白；5 转化体BL21_rPla诱导表达后的菌体裂解后沉淀经初步纯化后的产物。图2为秋水仙素法检查本发明的杂交瘤细胞株15 、杂交瘤细胞株19A4、杂交瘤细胞株HH4的染色体核型分析图形(Giemsa染色，X 1000)。图3为纯化腹水的SDS-PAGE图形。图中，M 分子量标准；1 :15B8a ；2 :15B8b ；3 19A4a ；4 :19A4b ；5 :14H4a ；6 :14H4c ；7 :14H4d。图4显示Western blot鉴定所述单抗特异性识别天然Pla蛋白的实验结果。图中，M 预染 marker ；1 :15 ；2 :19A4 ；3 =HH40图5显示所述单抗的亚类检测实验结果。图6A显示检测Pla抗原胶体金免疫层析试纸条检测培养EV76菌体实验结果；图6B显示检测Fl抗原胶体金免疫层析试纸条检测培养EV76菌体实验结果。用于专利程序的微生物保存(一 )分泌本发明单克隆抗体15 的杂交瘤细胞株15 保藏日期2010年9月16日；保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏编号CCTCCNO :C201091 ；分类命名杂交瘤细胞株15&。( 二)分泌本发明单克隆抗体19A4的杂交瘤细胞株19A4保藏日期2010年9月16日；保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏编号CCTCCNO :C201094 ；分类命名杂交瘤细胞株19A4。
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下各实施例中，所用原始实验材料、仪器用具及试剂均可商购获得，以下提供主要实验材料、仪器用具及试剂的来源1实验材料1) BALB/c小鼠购自上海实验动物中心(合格证号SCXK (沪)2007-0005)、昆明医学院实验动物中心(合格证号SCXK (滇)2005-0008)。2)小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0 购自云大生物科技有限公司。3)rPla蛋白购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。4)鼠疫耶尔森氏菌EV76菌株购自云南省地方病防治所菌种库。2实验仪器及用具
权利要求
1.一种对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO :C201091或CCTCC NO :C201094的杂交瘤细胞分泌。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，该抗体对天然Pla蛋白有特异性，对谷胱苷肽转移酶没有特异性。
3.分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CCTCCNO. C201091 或 CCTCC NO. C201094。
4.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，该方法包括用GST-Pla融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对天然Pla蛋白有反应性、对谷胱苷肽转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。
5.由保藏号为CCTCCNO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在体外检测样品中Pla蛋白的表达水平中的应用。
6.由保藏号为CCTCCNO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在制备用于检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫的制剂中的应用。
7.一种检测Pla蛋白的制剂，该制剂含有由保藏号为CCTCC NO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
8.—种检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条，该胶体金免疫层析试纸条上含有由保藏号为CCTCC NO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
9.一种检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫的胶体金免疫层析试纸条，该胶体金免疫层析试纸条上含有由保藏号为CCTCC NO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NOC201091或CCTCC NOC201094的杂交瘤细胞分泌。本发明同时涉及所述单克隆抗体的制备方法以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，还涉及含有所述单克隆抗体胶体金免疫层析试纸条及其在检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫中的应用。
文档编号G01N33/577GK102174107SQ201110043910
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者唐雪, 宋志忠, 尹家祥, 张建中, 杜春红, 王鹏, 郭英 申请人:云南省地方病防治所
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