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专利名称：检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及ー种免疫层析试条及制备方法，具体来说是一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法。
背景技术：
M-^t^M (echinococcosis) 31^1 ^^! (Hydatid disease Hydatidosis), 是由棘球属绦虫的幼虫寄生于人、畜体内引起的ー种人畜共患寄生虫�。�能感染人类的棘球属绦虫有4种细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球绦虫 (EEchinococcus multilocularis, Em)、少节棘球绦虫(E. oligarthrus)禾ロ伏氏棘球錄虫 (E. vogeli)。这4种棘球绦虫的成虫和幼虫期形态不同，可引起不同类型的棘球蚴病。我国有两种棘球蚴病即细粒棘球蚴病(cystic echinococ-cosis，CE)又称囊型包虫�。�和多 MMW-M'-M (alveolar echinococcosis, AE) 31禾尔夕包；^。包虫病是ー个重要的世界性公共卫生问题，广泛流行于欧、亚、非和地中海区域沿岸国家，以及澳洲和南美。在我国，包虫病主要流行于西部等12个省、自治区的牧区和农牧区，其中新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙和四川西部最为严重，是世界上包虫病患病率最高的地区。此外，吉林、陕西、云南、贵州和河南等省局部地区也有小范围流行。包虫病流行区受威胁人口约7000万。卫生部《全国人体重要寄生虫病现状调查》报告显示，这12省 (区)包虫病患病率为1.084%，据此推算，目前流行区约有病人38万人。由于B超诊断结果有一定的漏检率，实际患病人数可能达60万人以上。血清学检查发现人群的感染率平均为11. 98%，感染人数约为700万人，受威胁人口约7000万。包虫病需要手术或长期服药治疗，效果有限。其中囊型包虫病包囊破裂可导致过敏休克而致患者死亡。泡型包虫病被称为“恶性包虫病”是ー种致死性寄生虫�。�10-15年的病死率高达90%以上。漏诊的包虫病患者失去治疗时机而危及生命。包虫病不但给患者带来极大的痛苦和沉重的医疗负担，且发病的高峰为20-50岁的青壮年，严重的患者失去劳动力，给社会带来极大的压力，系西部农牧区群众因病致贫，因病返贫的重要原因。此外， 由于包虫病在牛羊的感染率相当高(可达90% )，毎年因包虫病也给我国畜产品造成的经济损失达数十亿。因此包虫病不但严重危害人民的生命健康，而且严重影响社会和经济发展、边疆稳定。包虫病的感染可长期(数年或十多年)无症状，一旦症状显现，药物治疗效果差 (因有两层厚实的囊包裹使药物难以进入达到有效浓度)，而不得不进行手术治疗，甚至要反复进行手木。因此，研究合适有效的免疫诊断技术用于早期诊断，以提高药物治疗效果， 是最有效的降低发病率和死亡率的根本途径，是包虫病防治中亟待解决的问题。目前对包虫病的诊断极大地依赖影像学方法，如X光检查、B型超声诊断、CT扫描、 核磁共振等物理诊断方法。但这些方法不能进行早期诊断(影像学诊断出的包虫病人已不太适合药物治疗)，且对有些囊肿、脓肿或肿块不能进行有效鉴别而误诊。由于影像检查设备携带不便，加之昂贵，且对操作人员的技术要求较高，在疾病诊断与流行病学调查中(特别在边远地区连电カ供应都受到限制)的应用受到限制。免疫学方法在包虫病诊断上的应用越来越受到重视，最有效的免疫学诊断方法是应用纯化天然抗原或重组抗原检测包虫病人特异抗体，常用检测方法有间接血凝法 (Indirect haemagglutination assay ；IHA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫电转移印淸法(Enzyme—iinkea ιmmunoelectrotransfer blot assay；EITBA)，以及金标免疫点印渍法(Gold-labelled dot blotting ；⑶B ；俗称膜法或渗滤法)。但这些方法或费时费力、或需要冷链系统保存试剂、或对仪器设备及操作人员的要求较高而不适合现场使用。在上述免疫方法中抗原的使用直接决定了检测的敏感性和特异性。包虫病免疫诊断抗原的研究经历了粗抗原、纯化抗原和重组抗原三个阶段。细粒棘球蚴包囊液粗抗原(HCF)广泛应用于囊型包虫病的诊断，其特点是检测的敏感性较高，可达75% -95%，但易于其他疾病如囊虫病等发生交叉反应。针对这ー问题许多学者采用不同的方法对囊液粗抗原进行分离和纯化，显著提高了检测的敏感性和特异性。EmlS抗原是泡球蚴种特异性抗原组分，有报道表明将纯化的天然EmlS抗原用于泡型包虫病的诊断，敏感性和特异性分别高达90. 91%和93. 80%，阳性预期值和阴性预期值分别为83. 33%和96. 80%，还能在一定程度上区分活动性和非活动性病灶，因而是ー种具有诊断和免疫随访意义的诊断抗原，但天然EmlS是从人工感染的泡球蚴原头节中提取的，提取难度大、产量少，不能满足诊断需要，因而人工合成的重组EM18抗原成为ー种在泡型包虫病鉴别诊断和病程随访中有应用价值的特异性诊断抗原。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法，所述的这种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法要解决现有技术中的检测囊型包虫病和泡型包虫病的方法复杂，而且不能早期诊断的技术问题。本发明提供了一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括ー个背板，所述的背板的上侧的一端设置有一个样品垫，所述的背板的上侧的另外一端设置有一个吸水垫，在所述的样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，所述的吸水垫和纤维素膜紧密连接，在所述的样品垫和所述的纤维素膜之间设置有ー个金标垫，所述的样品垫、金标垫和纤维素膜之间紧密连接，在所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在所述的质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置第一检测线和第二检测线，所述的第一检测线由囊型包虫病的纯化粗抗原組成，所述的第二检测线由重组的泡型包虫病的抗原EmlS組成，所述的金标垫上设置有胶体金标记的探针，所述的胶体金标记的探针是以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白，所述的质控线含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。进ー步的，所述的纤维素膜的一端设置在所述的金标垫的下側，所述的金标垫的一端设置在所述的样品垫的下側。进ー步的，所述金标垫中的胶体金标记探针是以人IgG作为抗原免疫小鼠获得的单克隆抗体，所述质控线含有羊抗鼠抗抗体。
进ー步的，所述金标垫中的胶体金标记探针可以为金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白，所述质控线含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌細胞表面蛋白抗体。进ー步的，囊型包虫病的纯化粗抗原蛋白的浓度为0. 1 10mg/mL，喷涂量为 8-12μ ν^πι;重组的泡型包虫病的抗原Eml8的蛋白浓度为0. 1 10mg/mL，喷涂量为 8-12yL/cm ；胶体金标记探针的浓度以蛋白浓度计为1 5mg/15 20mL。进ー步的，羊抗鼠抗抗体溶液的浓度为0. 1 5mg/mL，喷涂量为8_12 μ L/cm。进ー步的，抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌細胞表面蛋白抗体溶液浓度为0. 1 5mg/mL，喷涂量为8-12 μ L/cm。进ー步的，所述的维素膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述支持胶体金标记探针的金标垫选自玻璃纤维膜或聚脂膜，所述样品垫选自滤血膜、玻璃纤维或吸水紙，所述吸水垫为吸水紙。本发明还提供了ー种上述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备方法，包括一个制备囊型包虫病的纯化粗抗原的步骤、一个制备重组的泡型包虫病的抗原EmlS的步骤、ー个制备标记的抗人IgG的探针的步骤和ー个制备与胶体金标记探针特异结合的抗抗体的步骤，在上述步骤完成之后，将囊型包虫病的纯化粗抗原溶液喷涂到纤维素膜上形成第一检测线，将重组的泡型包虫病的抗原EmlS溶液喷涂到纤维素膜上形成第 ニ检测线，所述的第一检测线和所述的第二检测线相邻设置，将能与胶体金标记探针特异结合的抗体或抗抗体溶液喷涂到靠近吸水垫的纤维素膜上形成质控线，将喷涂有第一检测线、第二检测线、质控线的纤维膜在相対湿度40%以下的环境中干燥1 2小吋，然后进行制备金标垫的步骤，在所述的制备金标垫的步骤中，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记的探针溶液中，取出后将金标垫在相対湿度40%以下的环境中干燥1 2小时，将所述纤维素膜粘贴在ー个背板的中部，吸水垫粘贴在所述纤维素膜的靠近质控线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫的远离纤维素膜的一端， 得到检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条。本发明还提供了ー种试剂盒，由ー个盒体构成，将上述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条设置在ー个所述的盒体中，所述的盒体的一个侧面上设置有ー个加样孔和一个观察孔，所述的加样孔位于样品端吸水垫的上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。本发明还提供了一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，包括以下组分1)囊型包虫病的纯化粗抗原；2)重组的泡型包虫病的抗原Eml8，所述的重组的泡型包虫病的抗原Eml8的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；3)标记的抗人IgG的探针。进ー步的，所述的囊型包虫病的抗原B按如下方法制备取新鮮羊肝包囊液，离心后吸上清液入透析袋，用缓冲液于1_8°C下透析过夜，再离心后弃上清以除去白蛋白，沉淀用PBS缓冲液溶解，再加饱和硫酸铵，离心除去沉淀球蛋白，即得纯化的囊液粗抗原。进ー步的，所述的重组的泡型包虫病的抗原EmlS按如下方法制备将感染泡型包虫病的羊肝多房棘球蚴原头节用试剂盒进行原头节总RNA的抽提，以反转录试剂盒进行反转录合成cDNA第一链，上游引物序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO 2 所示，在上游引物中引入了 BamHI位点，在下游引物中引入了 EcoRI酶切位点，以合成cDNA 第一链为模板，RT-PCR方法扩增目的基因片段。进ー步的，所述的标记的抗人IgG的探针是利用人IgG免疫动物获得的多抗或单克隆抗体，或者金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白。进ー步的，所述的标记为酶标记、染料或者胶体金标记。进ー步的，所述的标记的抗人IgG的探针是鼠抗人IgG的单克隆抗体。进ー步的，所述的标记的抗人IgG的探针是金黄色葡萄球菌A蛋白。进ー步的，所述的标记的抗人IgG的探针是G群链球菌細胞表面蛋白。能感染人类的棘球属绦虫的4种棘球绦虫的成虫和幼虫期形态不同，可引起不同类型的棘球蚴病。包虫病患者体内血液中含有能特异性结合所感染的棘球蚴抗原的抗棘球蚴抗体，检测受试者体内血液中是否含有抗棘球蚴抗体，可作用受试者是否患有包虫病的指标。本发明的检测包虫病以及病原体种属的免疫层析试条适用于从囊型包虫病或泡型包虫病患者体内抽取的全血样品和血清样品。对于全血样品，本发明的检测囊型包虫病和泡型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中的样品垫采用滤血膜样品垫；如果仅检测血清样品，本发明的检测囊型包虫病和泡型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中的样品垫可采用玻璃纤维或吸水纸样品垫。本发明将包虫抗原固定在纤维素膜等支持物上作为固相抗原，用以捕获受试者者血样中的抗棘球蚴抗原抗体。本发明将我国常见的纯化囊型包虫病的纯化粗抗原固定在纤维膜上形成第一检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的抗纯化天然囊型包虫病粗抗原的抗体；将重组的泡型包虫病的抗原EmlS固定在纤维膜上形成第二检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的抗泡型包虫抗原EM18抗体，在检测线位置形成抗原抗体复合物沉淀。包虫病患者体内血液中含有的抗棘球蚴抗体的优势抗体类型为IgG抗体。胶体金标记探针采用抗人IgG抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白制备，该抗人IgG抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白可以是购买的商品化抗体，或按照常规方法自行制备。本发明的一个优选的方案中采用胶体金标记G群链球菌细胞表面蛋白为检测探针，该胶体金标记抗体附着于金标垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记抗体可与受试者血样中的人IgG抗体结合，从而当受试者血样中存在包虫病特异性抗体时在检测线位置形成色帯。胶体金标记抗体不限于金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白也可采用鼠抗人IgG的单抗或多杭，或者采用其他动物如兔抗人IgG抗体，同样能实现本发明的发明目的，这是本领域的一般技术人员都知晓的。本发明将与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体固定在纤维素膜上作为质控线。在本发明ー个优选的方案中，胶体金标记探针是G群链球菌細胞表面蛋白，相应的，质控线采用鸡抗SPG的IgY抗体。无论待检样品中是否含有抗棘球蚴抗体，本发明的检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中质控线位置总能形成色�。�该条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。
质控线不限于鸡抗SPG的IgY抗体，只要能与选定的胶体金标记探针特异性结合， 同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人员都知晓的。本发明的检测原理是測定时将样本血清或全血加在滤血膜样品垫上，1分钟后滴一滴(约50μυ样本稀释液，稀释液带动样品按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经金标垫时使金标垫上的胶体金标记抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、 吸水垫移动。胶体金标记探针可与样品中的抗体或抗体亚类结合，形成免疫复合物。此免疫复合物流至第二检测线吋，若标本中有针对抗原ΕΜ18的抗体或抗体亚类(抗泡型包虫病抗原的抗体)，即被第二检测线的特异性固相抗原所捕获，在硝酸纤维素膜上的第二检测线位置显出红色检测线条；若标本中有针对纯化粗抗原的抗体或抗体亚类(抗囊型包虫病抗原的抗体)，即被第一检测线的特异性固相抗原所捕获，第一检测线位置显出红色检测线条此免疫复合物流经质控线时，即被质控线的固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线， 仅显示质控线。如果质控线不显示，则表示试条失效。本发明的免疫层析试条具有以下优点(1)敏感性及特异性高实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试条检测囊型包虫病患者血清的敏感性可达89. 89% (囊型阳性例数/囊型总例数)，特异性为91% (非包虫病患者阴性例数/非包虫病患者总例数)，检测泡型包虫病患者血清的敏感性为94% (泡型阳性例数/泡型总例数)，特异性为100% (非包虫病患者阴性例数/非包虫病患者总例数)；(2)本发明的检测试条可以区別诊断囊型包虫病和泡型包虫�。�(3)检测方法简单、快速检测过程中标本处理简単，血清或全血都可以直接使用，无需处理，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的抗体经10分钟左右的层析后，即可出现肉眼可见的检测线，从而为包虫病人的治疗争取了时间，很适合现场和基层使用；(4)制备方法简单，成本低廉，易于进行エ业化生产。本发明将在包虫病的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。


图1是检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的正面结构示意图。图2是检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的纵截面结构示意图。其中1为样品垫；2为金标垫；3为纤维素膜；4为吸水垫；5为第二检测线；6为第一检测线；7为质控线；8为背板。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进ー步阐述本发明。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含里。实施例1本发明ー种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括一个背板8，所述的背板8的上侧的一端设置有ー个样品垫1，所述的背板8的上侧的另外一端设置有ー个吸水垫4，在所述的样品垫1和吸水垫4之间设置有一个纤维素膜3，所述的吸水垫4和纤维素膜3紧密连接，在所述的样品垫1和所述的纤维素膜3之间设置有ー个金标垫2，所述的样品垫1、金标垫2和纤维素膜3之间紧密连接，在所述纤维素膜3上远离金标垫2的一端设置质控线7，在所述的质控线7和金标垫2之间的纤维素膜3上设置第一检测线6和第 ニ检测线5，所述的第一检测线6由囊型包虫病的纯化粗抗原組成，所述的第二检测线5由重组的泡型包虫病的抗原EmlS組成，所述的金标垫2上设置有胶体金标记的探针，所述的胶体金标记的探针是以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白，所述的质控线7含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。进ー步的，所述的纤维素膜3的一端设置在所述的金标垫2的下側，所述的金标垫 2的一端设置在所述的样品垫1的下側。进ー步的，所述金标垫2中的胶体金标记探针是以人IgG作为抗原免疫小鼠获得的单克隆抗体，所述质控线7含有羊抗鼠抗抗体。进ー步的，所述金标垫2中的胶体金标记探针可以为金黄色葡萄球菌A蛋白或G 群链球菌細胞表面蛋白，所述质控线7含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌細胞表面蛋白抗体。实施例2检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备1、囊型包虫病的纯化粗抗原的制备取新疆源新鮮羊肝包囊液，以IOOOg离心30min，吸上清液入透析袋，用pH5. 0的 5mM乙酸缓冲液于4°C下透析过夜，50000g离心30min，弃上清以除去白蛋白。沉淀用pH8. 0 的0. 2M PBS溶解，加饱和硫酸铵至40%，离心除去沉淀球蛋白，即得纯化囊液粗抗原。2、重组的泡型包虫病的抗原Eml8按如下方法制备2. 1目的基因的克隆、转化在新疆采集自然感染的羊肝多房棘球蚴原头节。用试剂盒(E.Z.N.A Kit I) 进行原头节总RNA的抽提。以反转录试剂盒(PR0MEGA)进行反转录合成cDNA第一链。根据文献设计引物，为便于定向克隆在引物中分别引入了 BamHI(上游引物)和 EcoRI (下游引物)酶切位点(斜体字母表示)。引物序列如下EmlS F (5’-GC GGATCC AAGGAGTCTGACTTAGCGGA-3，)和 Eml8 R (5，-GC GAATTC GGCTTCACTTTCATCATCCTG-3‘)，引物由上海生エ公司合成。以合成cDNA第一链为模板，RT-PCR方法扩增目的基因片段，所述的重组的泡型包虫病的抗原Eml8的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。采用HiFi DNA Amplification Kit(BBST)试剂盒，聚合酶为Pfu。扩增条件反应在50ul.体系中进行，循环參数为 94°C 变性 3min，94°C 30s, 50 °C 45s, 72 °C 60s，共;35 个循环，72 °C 延伸 lOmin。扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳检查。将酶切产物分别进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将凝胶中的目的片段( 380bp)和pGEX-3X表达载体( 5000bp)切下，用Solarbio 公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将目的基因和表达载体用T4连接酶连接，连接体系如下
权利要求
1.一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括ー个背板，其特征在于 所述的背板的上侧的一端设置有一个样品垫，背板的上侧的另外一端设置有ー个吸水垫， 在所述的样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，吸水垫和所述的纤维素膜紧密连接， 在样品垫和纤维素膜之间设置有ー个金标垫，所述的样品垫、金标垫和纤维素膜之间紧密连接，在纤维素膜上靠近吸水垫的一端设置质控线，在所述的质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置第一检测线和第二检测线，所述的第一检测线含有囊型包虫病的纯化囊液粗抗原，所述的第二检测线含有重组的泡型包虫病的抗原Eml8，所述的金标垫上设置有胶体金标记的探针，所述的胶体金标记的探针是以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体、或金黄色葡萄球菌A蛋白、或G群链球菌細胞表面蛋白，所述的质控线含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。
2.如权利要求1所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其特征在于 所述的纤维素膜的一端设置在所述的金标垫的下側，所述的金标垫的一端设置在所述的样品垫的下側。
3.如权利要求1所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其特征在于 所述的金标垫中的胶体金标记探针是以人IgG作为抗原免疫小鼠获得的单克隆抗体，所述的质控线含有羊抗鼠抗抗体。
4.如权利要求1所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其特征在于 所述的金标垫中的胶体金标记探针为金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白， 所述的质控线含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌細胞表面蛋白抗体。
5.如权利要求1所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其特征在于 囊型包虫病的纯化粗抗原蛋白的浓度为0. 1 10mg/mL，喷涂量为8 12PL/cm，重组的泡型包虫病的抗原Eml8的蛋白浓度为0. 1 10mg/mL，喷涂量为8 12PL/cm，胶体金标记探针的浓度以蛋白浓度计为1 5mg/ 15 20mL。
6.如权利要求3所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其特征在于 所述的羊抗鼠抗抗体溶液的浓度为0. 1 5mg/mL，喷涂量为8 12PL/cm。
7.如权利要求4所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其特征在于 抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌細胞表面蛋白抗体溶液浓度为0. 1 5mg/ mL，喷涂量为 8-12PL/cm。
8.如权利要求1所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其特征在于 所述的维素膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的支持胶体金标记探针的金标垫选自玻璃纤维膜或聚脂膜，所述样品垫选自滤血膜、玻璃纤维或吸水紙，所述吸水垫为吸水纸。
9.一种制备检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备方法，其特征在于 包括一个制备囊型包虫病的纯化粗抗原的步骤、一个制备重组的泡型包虫病的抗原EmlS 的步骤、ー个制备标记的抗人IgG的探针的步骤和ー个制备与胶体金标记探针特异结合的抗抗体的步骤，在上述步骤完成之后，将纯化的囊型包虫病的抗原B溶液喷涂到纤维素膜上形成第一检测线，将重组的泡型包虫病的抗原EmlS溶液喷涂到纤维素膜上形成第二检测线，所述的第一检测线和所述的第二检测线相邻设置，将能与胶体金标记探针特异结合的抗体或抗抗体溶液喷涂到靠近吸水垫的纤维素膜上形成质控线，将喷涂有第一检测线、第二检测线、质控线的纤维膜在相対湿度40%以下的环境中干燥1 2小吋，然后进行制备金标垫的步骤，在所述的制备金标垫的步骤中，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记的探针溶液中，取出后将金标垫在相対湿度40%以下的环境中干燥1 2小时，将所述纤维素膜粘贴在ー个背板的中部，吸水垫粘贴在所述纤维素膜的靠近质控线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫的远离纤维素膜的一端，得到检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条。
10.ー种试剂盒，由ー个盒体构成，其特征在于将权利要求1所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条设置在所述的盒体中，所述的盒体的一个侧面上设置有ー个加样孔和一个观察孔，所述的加样孔位于样品端吸水垫的上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。
11.一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于包括以下组分囊型包虫病的纯化粗抗原；重组的泡型包虫病的抗原Eml8，所述的重组的泡型包虫病的抗原EmlS的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 所示；标记的抗人IgG的探针。
12.如权利要求11所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于所述的囊型包虫病的纯化粗抗原按如下方法制备取新鮮羊肝包囊液，离心后吸上清液入透析袋，用缓冲液于1_8°C下透析过夜，再离心后弃上清以除去白蛋白，沉淀用PBS缓冲液溶解，再加饱和硫酸铵，离心除去沉淀球蛋白，即得纯化的囊液粗抗原。
13.如权利要求11所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于所述的重组的泡型包虫病的抗原EmlS按如下方法制备将感染泡型包虫病的羊肝多房棘球蚴原头节用试剂盒进行原头节总RNA的抽提，以反转录试剂盒进行反转录合成cDNA第一链，上游引物序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO: 2所示，在上游引物中引入了 Bamm位点，在下游引物中引入了^boRI酶切位点，以合成cDNA第一链为模板，RT-PCR方法扩增目的基因片段。
14.如权利要求11所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于所述的标记的抗人IgG的探针是利用人IgG免疫动物获得的多抗或单克隆抗体，或者金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌細胞表面蛋白。
15.如权利要求14所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于所述的标记为酶标记、染料标记或者胶体金标记。
16.如权利要求11所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于所述的标记的抗人IgG的探针是鼠抗人IgG的单克隆抗体。
17.如权利要求11所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于所述的标记的抗人IgG的探针是金黄色葡萄球菌A蛋白。
18.如权利要求11所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于所述的标记的抗人IgG的探针是G群链球菌細胞表面蛋白。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，公开了一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括一个背板，背板的上侧的一端设置有一个样品垫，另外一端设置有一个吸水垫，在样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，在样品垫和纤维素膜之间设置有一个金标垫，在所述纤维素膜上设置第一检测线、第二检测线、质控线，第一检测线含有针对囊型包虫病的纯化粗抗原，第二检测线含有针对泡型包虫病的重组抗原，质控线含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。本发明还提供了上述的一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备方法，本发明的免疫层析试条具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。
文档编号G01N33/68GK102539782SQ20111030149
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者杨玥涛, 汪俊云, 石锋, 胡薇, 高春花 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所