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专利名称：：甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法
技术领域：
：本发明涉及一种甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：目前甲型肝炎灭活疫苗的效力检测使用小鼠体内相对效力试验法，检测基本过程如下(1)将待检疫苗每批多支混合后作2倍系列稀释至l:64，试验同时设立效力试验参比品作为对照；(2)取1:4、1:16、1:64共3稀释度接种小鼠，每个稀释度接种小鼠10只，每只腹腔注射1.0ml，4周后采血，分离血清待测；(3)血清抗体测定使用甲型肝炎病毒抗体检测试剂盒测定小鼠血清的抗-HAV抗体；(4)结果计算根据每个稀释度抗体阳性及阴性的小鼠数，计算阳转率，采用Reed-Muarch法进行统计分析，计算EDs。；(5)计算待检样品与参比品的效力比，作出判定。此方法检测周期长达30余天，间接缩短了疫苗的有效期，增加了疫苗库存压力，这严重影响了疫苗的生产及销售，且由于在动物体内进行试验时，会因动物的种属、窝别、年龄、体重、性别、健康状况、饲养环境及饲料营养等诸多因素，直接影响到检测结果的准确性及可靠性，不可避免地影响到检测的重复性。所以需要对该检测方法进行改进，使之满足快速、灵敏、重复性好的要求，这将有利于提高检测结果的可靠性，进一步保证产品质量。
发明内容本发明的目的在于提供一种甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，以取代传统的小鼠体内相对效力试验，解决受试动物所带来的影响因素多、重复性差、检定周期长达30余天的不利因素，减少疫苗库存量，延长疫苗的有效期，降低检定成本及劳动强度。本发明通过下列技术方案实现一种甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于经过下列步骤A、将待检的甲型肝炎灭活疫苗及参比的甲型肝炎灭活疫苗用常规PBS稀释液进行不同稀释度的稀释；B、将稀释后的待检甲型肝炎灭活疫苗及参比甲型肝炎灭活疫苗分别按不同的稀释度加入酶标板对应的孔中，每个稀释度的疫苗分别放2孔，放入量为50150ri/孔，同时在酶标板的孔中加入对照用阳性抗原和阴性抗原，每个抗原各加入2孔，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37"C保温12小时后，洗板35次；C、按50150)4/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1:5003000的长臂生物素标记HAV抗体使用液，放入湿盒中，于37'C保温0.51小时后，洗板35次；D、按50150W/孔的量，在C步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1:200010000的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液，放入湿盒中，于37'C保温0.51小时后，洗板35次；E、在D步骤的酶标板各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50W/孔，混匀，放入湿盒中，37°C保温1015分钟；F、按50W/孔的量，在E步骤的酶标板的各孔中加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值。根据检测所得A值，进行下列计算-1)以每个稀释度的两孔的A值相加得出待检样品的反应值L、T2、T3、L和参比品的反应值S,、S2、S3、S4，将各反应值代入下列公式，计算相对效力R值R=D*antilg(IV/W)其中I=lg2=0.301，D=l，V=1/4(T,+T2+T3+T4-S,-S2-S3-S4)，W=l/20((T3—T2+S3—S2)+3(T4—T,+S4—S')〕2)待检样品与参比品的相对效力比值r的计算公式如下r=PT/Ps=R.AT/Ps(其中，PT=R.AT)其中PT为待检品T测得的效价，Ar为待检品T的标示效价或估计效价，R为测得的效价等反应剂量比值，Ps为参比品的效价。3)结果判断r》0.85时，体外相对效力试验合格。所述步骤A所述的不同稀释度为1:8、1:16、1:32、1:64。所述C步骤的长臂生物素标记HAV抗体经下列方法制备a、按长臂生物素甲型肝炎病毒抗体二l:520克分子比的比例，将市购的长臂生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.51.0小时，或28'C温度下放置13小时；b、用磷酸缓冲液于28t温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-2(rC以下保存备用。所述D步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品。所述洗板用PBS洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。所述磷酸盐缓冲液PBS、PBS洗液、PBS稀释液、碳酸盐缓冲液、终止液、TMB显色液A和B、封闭液均为现有技术的常规用液。所述酶标板预先经过下列方法处理1)酶标板包被将纯化的HAV-IgG用碳酸盐缓冲液PBS稀释至5-20Pg/ml，按50150W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，28。C过夜，洗板35次；2)酶标板封闭按150250Pl/孔的量加入封闭液，28。C过夜，对酶标板进行封闭，洗板35次，晾干，冰箱保存备用。本发明具有下列优点和效果采用上述方案，彻底取代了传统的小鼠体内相对效力测试方法，解决了使用动物所带来的影响因素多、重复性差、检定周期长达30余天的不利因素，只需约3.5小时即可完成测试，减少了疫苗库存量，间接延长了疫苗的有效期，降低了劳动强度，尤其在疫苗紧张时可多生产150-200万支疫苗，可创产值4500-6000万元。另外，本发明采用双平行线生物检定原理，提出的甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，使HAV病毒含量与相对应A值的对数之间表现出良好的线性回归，12均在0.97以上；检测结果表现出较好的稳定性及重复性，因此，是一种方便、快捷、可靠的测试方法。具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1所用甲型肝炎灭活疫苗效力试验参比品S为申请人严格按国家标准生产，并经理化及生物学检验达标的合格产品，其效价Ps为640EU/ml;待检的甲型肝炎灭活疫苗样品T也是申请人严格按国家标准生产的产品，其标示效价&为640EU/ml。所用溶液如下1、磷酸盐缓冲液PBS:磷酸氢二钠58g，磷酸二氢钾4g,氯化钠160g，加注射用水至1000ml。2、PBS稀释液将磷酸盐缓冲液PBS用注射用水作20倍稀释。3、PBS洗液将磷酸盐缓冲液PBS用注射用水作20倍稀释后，加入0.05%吐温20。4、碳酸盐缓冲液无水碳酸钠1.6g，碳酸氢钠2.93g，加注射用水至lOOOml。5、终止液浓硫酸54ml，加注射用水至500ml。6、TMB显色液A:TMB50mg，二甲基亚砜50ml，加注射用水50ml。7、TMB显色液B:醋酸钠6g，双氧水2.5ml，加注射用水至50ml。8、封闭液在1000ml磷酸盐缓冲液PBS中，加入20克牛血清白蛋白，溶解混匀。9、裂解液20%二乙醇胺1.25ml，10%TritonX1000.2ml，0.Olmol/LPBS(pH7.40)8.55ml。长臂生物素标记HAV抗体的制备1)按长臂生物素甲型肝炎病毒抗体=1:10克分子比的比例，将市购的长臂生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5小时；2)用磷酸缓冲液PBS于5t温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-2(TC以下保存备用。酶标板预先经过下列方法制备1)酶标检测板包被将纯化HAV-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至10Pg/ml，按100W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，5T:过夜，用PBS洗液在洗板机上洗板5次；2)酶标检测板封闭按200W/孔的量加入封闭液，5'C过夜，对酶标板进行封闭，用PBS洗液在洗板机上洗板5次，晾干，冰箱保存备用；具体测试1、将甲型肝炎灭活疫苗待检样品T及甲型肝炎灭活疫苗效力试验参比品S，加入等体积裂解液，室温下裂解30分钟；2、将甲型肝炎灭活疫苗待检样品T和甲型肝炎灭活疫苗参比品S分别用PBS稀释液进行下列稀释，稀释度为1:8、1:16、1:32、1:64;3、用微量移液器量将稀释后的甲型肝炎灭活疫苗待检样品T及甲型肝炎灭活疫苗参比品S从高稀释度开始依次加入酶标板中，每个稀释度加2个孔，100W/孔，同时加入抗原阳性、阴性对照各2个孔，设空白调零孔1孑L放入湿盒中，37t:保温2小时，用PBS洗液洗板5次；4、在上述酶标板的各个孔中加入稀释度为1:800的生物素标记HAV抗体使用液，100W/孔，放入湿盒中，37'C保温0.5小时，用PBS洗液洗板5次；5、在上述酶标板的各个孔中加入稀释度为1:4000的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液，100W/孔，放入湿盒中，37"C保温0.5小时，用PBS洗液洗板5次；6、在上述酶标板的各个孔中加入TMB显色液A、B液各50W/孔，混匀，放入湿盒中，37'C保温10分钟；7、在上述酶标板的各个孔中加入终止液，50yl/孔，置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后测吸光度A值，得表l数据表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>阳性对照平均A值(1.845)—阴性对照平均A值(0.055)》0.4本次试验成立;8、以每个稀释度2复孔的A值相加作为反应值，将各反应值代入公式，计算效价<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>9、相对效力值(R)计算公式R=D*antilg(IV/W)其中I=lg2=0.301，D=l，V=1/4(T,+T2+T3+T4—S「S2—S3—S4)W=l/20〔(T3—T2+S3—S2)+3(^—1+S4—SJ)按公式计算得V=0.590W=0.9247R=lg_'0.192=1.55510、样品与参比品的相对效力比值(r)计算r=PT/Ps(其中PT=R.AT)=R.AT/Ps=1.555X640(EU/ml)/640(EU/ml)=1.555结果判定r=l.555^0.85，体外相对效力试验合格。1.检测样品含量与反应值的线性关系评价用本发明的方法对甲型肝炎病毒抗原进行检测，以样品稀释度(1:81:1024)的对数值为横座标、相对应A值及A值的对数为纵座标进行直线回归分析，所有样品均表现出良好的线性回归，特别是样品稀释度的对数值为横座标与A值的对数之间具有高度的相关性，其4点法R2(绝对指数)均在0.97以上，平均值为0.990，可以用于建立生物检定方法。R2如表l所示。2.双平行线检测方法的可靠性检验根据线性回归分析结果，取线性最好的4点进行分析，建立双平行线检定方法。按统计分析的基本要求，双平行线(4，4)检定方法应为直线回归非常显著(p<0.01=，偏离平行、二次曲线及反向二次曲线三个参数检验均应为不显著(p〉0.05)。本所建立的4.4复孔检测法Hl，8)0.01=11.26，8)0.05=5.32即当26时，p<0.01，非常显著；尸<5.32时，p>0.05，不显著。满足以上条件时验证通过。对本所建立的效力试验参比品(批号200501和20060301、20060303、20060303批)灭活疫苗进行三批样品三人次检测，对本发明体外相对效力试验方法进行验证(表2)，对同批次效力试验r值分析(表3)，并与常规相对效力试验结果进行比较，验证结果显示本发明体外相对效力试验方法可以通过可靠性验证。表1.HAAg含量与A值线性回归分析比较样品批号A值均数8点直线R2A值均数对数4点直线R2200603010.9550.977第一次200603020.9580.995检测结果200603030.9580.9900501标10.9600.995200603010.9430.979第二次200603020.9280.979检测结果200603030.9470.9920501标20.9510.984200603010.9580.997第三次200603020.9570.998检测结果200603030.9540.9980501标30.9480.995最大值0.9600.998最小值0.9280.977结果分析平均值0.9510.990S0.0090.008cv1%0.8%注4点为1:8-1:64;8点为1:8-1:1024。本发明体外相对效力试验进行了3批3人次检测均通过验证，其R值在27次检测结果中，同批次r值CVM分别为20060301:12.32%、20060302:7.69%、20060303:5.48%表明检测结果稳定重复性较好。所有批次的R值最大为1.43，最小为0.849，平均1.026，标准差为0.169。表2.双平行线可靠性验证次批号分回归偏离平二次曲反二次曲验证结3.应用效果评价用现有的方法检测2006年、2007、2008年3年产品，同时与本发明体内相对效力试验结果进行应用比较(表4)。从表4可以看出，三年样品体外相对效力试验r值的标准差及CV值均低于体内相对效力试验，表明本发明体外相对效力试验更稳定，重复性更好。200603012006030220060303PFPF2029.16尸<0.011763.17尸<0.01476.107尸<0.010.551/>0.055.231P>0.050,117P〉0.054.087K>0.054.138/^O.050.427P〉0.050.017/^0.050.011冷0.050.179/^>0.05通过验证通过验证通过验证200603012006030220060303PFPF2086.79尸<0.011646.07尸<0.011930.91<0.010.287050.827/^0.053.537/^>0.050.111/^>0.050.671Z^X).050.016/^>0.050.065/^>0.050.562/^X).0550.00305通过验证通过验证通过验证200603012006030220060303PFPF1485.07<0.01992.095p<0.01487.286;<0.010.874/^>0.050.001/^0.053.515/^>0.054.096P〉0.050.91P〉0.050.337/^0.050.233/^0.050.114/^X).050.16105通过验证通过验证通过验证第一次检测结果第一一次检测结果第三次检测结果表3同批次效力试验r值分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4体外相对效力试验与体内相对效力试验r值统计分析<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>综合22批疫苗体外相对效力待检品与参比品的相对效力比值(r值)范围0.801-1.659，平均1.083,建议体外相对效力试验的判定标准为平均r值±IS值(O.851.30)，即甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力r值应不低于0.85(r》0.85)。以r》0.85作为判定标准，将15批疫苗用本发明的体外相对效力试验与体内相对效力试验同步进行检验，结果与体内效力试验一致，15批疫苗2种方法检验全部为合格品(表5)。表52008年疫苗体外相对效力与体内相对效力试验结果对比批号体内相对效力r体外相对效力r200801011.070.87200802011.110.91200802030.870.96200804010.940.86200804020.850.85200805010.850.86200805030.820.86200807011.100.92200807031.201.11200807051.100.88200807071.200.85200807091.400.96200810010.900.93最大值1.401.11最小值0.820.85平均值1.030.90S0.1760.072cv17.06%8.02%1S+1.2080.9731S-0.8550.8282S+1.3841.0532S-0.6790.75权利要求1、一种甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于经过下列步骤A、将待检的甲型肝炎灭活疫苗及参比的甲型肝炎灭活疫苗用常规PBS稀释液进行不同稀释度的稀释；B、将稀释后的待检甲型肝炎灭活疫苗及参比甲型肝炎灭活疫苗分别按不同的稀释度加入酶标板对应的孔中，每个稀释度的疫苗分别放2孔，放入量为50～150μl/孔，同时在酶标板的孔中加入对照用阳性抗原和阴性抗原，每个抗原各加入2孔，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～2小时后，洗板3～5次；C、按50～150μl/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶500～3000的长臂生物素标记HAV抗体使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后，洗板3～5次；D、按50～150μl/孔的量，在C步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶2000～10000的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后，洗板3～5次；E、在D步骤的酶标板各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；F、按50μl/孔的量，在E步骤的酶标板的各孔中加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值。2、如权利要求l所述的甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于所述步骤A所述的不同稀释度为1:8、1:16、1:32、1:64。3、甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于所述C歩骤的长臂生物素标记HAV抗体经下列方法制备a、按长臂生物素甲型肝炎病毒抗体二l:520克分子比的比例，将市购的长臂生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.51.0小时，或28匸温度下放置13小时；b、用磷酸缓冲液于28'C温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-2(TC以下保存备用。4、甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于所述D步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品。5、甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于所述洗板用PBS洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。6、甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液PBS、PBS洗液、PBS稀释液、碳酸盐缓冲液、终止液、TMB显色液A和B、封闭液均为现有技术的常规用液。7、甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，其特征在于所述酶标板预先经过下列方法处理1)酶标板包被将纯化的HAV-IgG用碳酸盐缓冲液PBS稀释至5-20Pg/ml，按50150W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，28。C过夜，洗板35次；2)酶标板封闭按150250W/孔的量加入封闭液，28'C过夜，对酶标板进行封闭，洗板35次，晾干，冰箱保存备用。全文摘要本发明提供一种甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法。彻底取代了传统的小鼠体内相对效力测试方法，解决了使用动物所带来的影响因素多、重复性差、检定周期长达30余天的不利因素，只需约3.5小时即可完成测试，减少了疫苗库存量，间接延长了疫苗的有效期，降低了劳动强度，尤其在疫苗紧张时可多生产150-200万支疫苗，可创产值4500-6000万元。另外，本发明采用双平行线生物检定原理，提出的甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法，使HAV病毒含量与相对应A值的对数之间表现出良好的线性回归，R²均在0.97以上；检测结果表现出较好的稳定性及重复性，因此，是一种方便、快捷、可靠的测试方法。文档编号G01N33/531GK101556285SQ200910094509公开日2009年10月14日申请日期2009年5月22日优先权日2009年5月22日发明者霞宋,华李,蓉杨,超洪,白惠珠,谢忠平,陈洪波,铠黄,龙润乡申请人:中国医学科学院医学生物学研究所