专利名称：检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体。
背景技术：
近年研究提示炎症与免疫在动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的发生、发展中起重要作用，提示动脉粥样硬化可能是一种慢性炎症性疾病。研究发现，白细胞分化抗原40(CD40)信号通路参与了动脉粥样硬化斑块内主要细胞成分(血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及巨噬细胞)的炎症反应的调节，参与了动脉粥样硬化的发生和发展。存在于动脉粥样硬化斑块内的细胞通过⑶40-⑶40配体相互作用，导致自身活化,表达和分泌有利于免疫 应答发生、炎症反应、血凝和血栓形成的蛋白质细胞因子，而最终导致粥样硬化斑块病变的恶化。CD40配体(CD40L)可激活在动脉粥样硬化斑块中的关键性细胞成分，如黏附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs)、组织因子等的产生，导致斑块的不稳定和破裂。在AS的免疫反应调节中CD40-CD40配体的相互作用非常重要，它们的相互作用显著影响AS相关细胞的功能，并且与斑块的发生发展密切相关。⑶40L也称Pg39、⑶154，由261个氨基酸组成的II型跨膜蛋白，其三维结构类似于肿瘤坏死因子α (TNF-α )，属于TNF家族细胞因子。主要表达于活化的⑶4+T细胞表面。近年发现，除了 T细胞，⑶40L还表达于B细胞、自然杀伤细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞以及非造血系统起源的内皮细胞等。血小板在激活中表达⑶40L，并在激活后数分钟至数小时降解为可溶性白细胞分化抗原40配体(s⑶40L)。s⑶40L可通过促进血小板-单核细胞聚集和产生活性氧自由基维持炎症反应，其在动脉粥样斑块形成过程中的作用目前已经在研究中证实，急性冠状动脉综合症(ACS)病人的SCD40L值较正常人又明显升高，这预示着SCD40L水平对ACS临床诊断及病情监测具有一定意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种多肽配体。本发明所提供的多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列I所示。本发明的另一个目的是提供一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒。本发明所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含所述的多肽配体。所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的s⑶40L单克隆抗体。所述试剂盒还包括已知浓度的重组全长⑶40L抗原稀释液作为标准品。所述试剂盒还包括鲁米诺作为化学发光体系的底物，对碘苯酚作为发光增强剂。本发明的又一个目的是提供一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的制备方法。本发明所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤将所述多肽配体按终浓度O. 5 μ g/ml、l. O μ g/ml或2. 0 μ g/ml加入到2OmmoIpH4. O醋酸盐缓冲液或20mmol pH7. 4磷酸盐缓冲液或50mmol pH9. 6碳酸盐缓冲液中混勻后,加入化学发光板内，每孔100 μ 1，4°C温浴16-22小时，弃去孔内液体后加入含有牛血清白蛋白或胎牛血清的20mmol pH7. 4的磷酸盐缓冲液120 μ 1，37°C下静置2小时后，弃去孔内液体，干燥发光板，得到包被多肽配体的板条。所述方法还包括以下步骤将s⑶40L单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。所述方法还包括以下步骤将重组全长⑶40L抗原用蛋白稳定剂稀释成6个梯度浓度，分别为 Ong/ml、I. 0ng/ml、2. 5ng/ml、5. Ong/ml、10. Ong/ml 和 20. Ong/ml。 所述方法还包括以下步骤制备化学发光底物液A液和B液用超纯水中配制O. lmol/L pH8. 2-8. 7的Tris-HCl缓冲液，加入终浓度为3mmol/L的鲁米诺、O. 3mmol/L的Tween20和碘苯酹混合溶液,作为A液；用超纯水配制的O. lmol/L pH4. 4-4. 8的柠檬酸缓冲液，加入终浓度为30%的H2O2溶液，作为B液。所述多肽配体在制备检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的检测方法如下(I)自2-8°C冰箱中取出所述试剂盒，室温平衡30分钟。(2)取出包被板条，插入发光板架上。(3)将 6 个标准品(浓度分另Ij 为 Ong/ml、l. 0ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. Ong/ml和20. Ong/ml)及待检测样本加入发光板中，每孔100 μ I。振荡混匀后贴上封板膜，置于37°C温育30分种。(4)甩去反应液，每孔加满稀释后的磷酸盐洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。(5)加入HRP标记的s⑶40L抗体试剂，每孔100 μ LI。振荡混匀后贴上封板膜，置于37°C温育20分种。(6)甩去反应液，每孔加满稀释后的磷酸盐洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。(7)使用前将化学发光底物液A和B等体积混合，每孔加入100 μ I的化学发光底物混合液，振荡混合均匀，置于室温避光反应5分钟。(8)将化学发光板在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。(9)根据标准品的浓度与发光强度(RLU)建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标，发光强度(RLU)值为纵坐标，在坐标系中标出6个标准品的散点图，采用回归方式建立标准曲线(要求相关系数R2 > O. 99)和曲线方程。根据待测样品的发光强度(RLU)反推计算出样品的s⑶40L浓度。(10)以样品中SCD40L浓度5. 00ng/ml为临界值，判定ACS临床诊断及病情监测的
预警提示。本发明通过构建可溶性白细胞分化抗原40配体(s⑶40L)的多肽配体库，采用酶联免疫法(ELISA)筛�。徊饺范ň哂薪细咝Ъ鄣亩嚯呐涮�。SCD40L的多肽配体的应用主要表现在可用于检测血清中S⑶40L的含量，包括化学发光法等。本发明所提供的试剂盒较Bender MedSystems sQ)40L ELISA试剂盒具有更好的灵敏度和特异性，其对ACS的临床诊断及病情监测具有重要的应用价值。本发明的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床心脑血管病特别是ACS临床诊断及病情监测提供了一种新的检测产品。
图I为化学发光免疫试剂盒对不同对象的检测结果。
具体实施例方式实施例I、⑶40L多肽配体库的建立采用生物信息学分析，结合TOB中CD40L数据进行分析，进一步确定了能够与CD40L结合的潜在的多肽配体所具有的元件序列主要包括Glu\Tyr\Gln\Leu-Tyr\Ser-Glu\Leu-Glu\Thr-Ser-Glu-Glu\Lys\Tyr-Glu\Tyr\Gln\Leu-Asp\Glu-Glu\Lys\Tyr-Tyr\Ser-Glu\Leu进行兼并分析后，提交上海生工生物技术有限公司辅助合成多肽片段Glu-Tyr-Glu-Glu-Ser-Glu-Lys-Glu-Asp-Glu-Tyr-Glu (序列表中序列 I)要求合成的多肽纯度> 90%。实施例2、⑶40L多肽配体库的筛选多肽配体库的筛选采用ELISA法进行，具体方法如下①s⑶40L的标记。采用改良的过碘酸钠氧化法将s⑶40L (s⑶40L购自美国Peprotech公司，lmg/ml)分子进行辣根过氧化物酶(HRP)标记(HRP购自sigma公司)。②以多肽库片段(序列表中序列I)进行包被(包被液选择pH7. 4PB缓冲液，包被浓度I. O μ g/ml),封闭液为含有BSA或胎牛血清的磷酸盐缓冲液。③将HRP标记的SCD40L用PBS制备成1:1000、1:5000、1:10000三个浓度，分别加100 μ I至多肽片段包被板中，37°C反应60min后，PBST洗板5次后，加入TMB底物液(其中A液为含有过氧化脲的朽1檬酸溶液，B液为含有TMB的朽1檬酸溶液),避光反应15min后,于450nm下读取吸光值，吸光值与多肽配体效价成正比。结果如表I所示。表I多肽配体效价检测结果
HRP-CD40L
多肽+K体 ___1:10001:50001:10000
(IΛ4-4-4-,,,ι,,,,ι；,4~
.十十 -1-I' "ΓT根据表I结果显示本发明的⑶40L多肽配体(序列表中序列I所示)具有较高效价，具有潜在的检查应用价值。实施例3、基于CD40L多肽配体制备的化学发光免疫试剂盒及其检测方法一、基于⑶40L多肽配体制备的化学发光免疫试剂盒的制备方法如下( I)化学发光板的包被
将包被用CD40L多肽配体按终浓度O. 5 μ g/ml、I. O μ g/ml或2. 0 μ g/ml加入到2OmmoI pH4. O醋酸盐缓冲液或20mmol pH7. 4磷酸盐缓冲液或50mmol pH9. 6碳酸盐缓冲液中混匀后,加入化学发光板内，每孔100 μ 1，4°C温浴16-22小时，弃去孔内液体后加入含有牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清的20mmol pH7. 4的磷酸盐缓冲液120 μ 1，37°C下静置2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，干铝钼袋真空包装，置于2-8°C保存。(2) HRP标记抗体的制备采用改良的过碘酸钠氧化法将SCD40L单克隆抗体(sCD40L单克隆抗体购自美国Peprotech公司)进行HRP (HRP购自sigma公司)标记。标记抗体采用HRP稀释稳定剂稀释，该稀释稳定剂是含O. l%Proclin300 (非叠氮化钠)的O. 1%氨基比林、安替比林或异丙安替比林的PH7. 4的磷酸盐缓冲液。(3)标准品的制备 将重组全长⑶40L抗原(购自美国Peprotech公司)用蛋白稳定剂(购自北京科跃中偕生物技术有限公司)稀释成6个梯度浓度，分别为Ong/ml、I. 0ng/ml、2. 5ng/ml、5. Ong/ml、10.Ong/ml 和 20. Ong/ml。(4)化学发光底物液的制备A液用超纯水中配制O. IM pH8. 2-8. 7的Tris-HCl缓冲液(上海生工，500g/瓶)，加入终浓度为3mmol/L的鲁米诺(Luminol)(购自杰韦弗、Ig/瓶)、0· 3mmol/L的Tween20(上海生工，500ml/瓶)和碘苯酚(上海生工，500ml/瓶)混合溶液。B液用超纯水配制的O. IM pH4. 4-4. 8的柠檬酸缓冲液(上海生工，500g/瓶)，加入终浓度为30%的H2O2 (国药，500ml/瓶)溶液。使用时将A液与B液等体积混合。二、化学发光免疫试剂盒的检测方法(I)自2_8°C冰箱中取出上述制备得到的试剂盒，室温平衡30分钟。(2)取出包被板条，插入发光板架上。(3)将 6 个标准品(浓度分另Ij 为 Ong/ml、l. 0ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. Ong/ml和20. Ong/ml)及待检测样本加入发光板中，每孔100 μ I。振荡混匀后贴上封板膜，置于37°C温育30分种。(4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。(5)加入HRP标记的s⑶40L抗体试剂，每孔100 μ I。振荡混匀后贴上封板膜，置于37°C温育20分种。(6)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。(7)使用前将化学发光底物液A和B等体积混合，每孔加入100 μ I的化学发光底物混合液，振荡混合均匀，置于室温避光反应5分钟。(8)将化学发光板在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。(9)根据标准品的浓度与发光强度(RLU)建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标，发光强度(RLU)值为纵坐标，在坐标系中标出6个标准品的散点图，采用回归方式建立标准曲线(要求相关系数R2 > O. 99)和曲线方程。根据待测样品的发光强度(RLU)反推计算出样品的s⑶40L浓度。(10)以样品中s⑶40L浓度5. 00ng/ml为临界值，判定ACS临床诊断及病情监测的预警提示。实施例4、化学发光免疫试剂盒的检测精密性、稳定性、特异性及灵敏度(I)空白对照及标准品的检测精密性按照本发明所述检测方法，对空白对照和6个标准品进行了 3个批次，每批次8个重复的精密度检测，结果如表2所示。表2空白对照及标准品的检测精密性结果
权利要求
1.一种多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列I所示。
2.一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含权利要求I所述的多肽配体。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的s⑶40L单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括已知浓度的重组全长CD40L抗原稀释液作为标准品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括鲁米诺作为化学发光体系的底物，对碘苯酚作为发光增强剂。
6.一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤 将权利要求I所述的多肽配体加入到醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液中混匀后，加入化学发光板内，4°C温浴16-22小时，弃去孔内液体后加入含有牛血清白蛋白或胎牛血清的磷酸盐缓冲液，37°C下静置2小时后，弃去孔内液体，干燥发光板，得到包被多肽配体的板条。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤 将SCD40L单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤 将重组全长⑶40L抗原用蛋白稳定剂稀释成6个梯度浓度，分别为0ng/ml、l. Ong/ml、2.5ng/ml、5. 0ng/ml>10. Ong/ml 和 20. 0ng/mlo
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤 制备化学发光底物液A液和B液 用超纯水中配制O. lmol/L pH8. 2-8. 7的Tris-HCl缓冲液，加入终浓度为3mmol/L的鲁米诺、O. 3mmol/L的Tween20和碘苯酹混合溶液,作为A液； 用超纯水配制的O. lmol/L pH4. 4-4. 8的柠檬酸缓冲液，加入终浓度为30%的H2O2溶液，作为B液。
10.权利要求I所述的多肽配体在制备检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体。本发明所提供的多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。本发明所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含序列表中序列1所示的多肽配体。本发明所提供的试剂盒较Bender MedSystems sCD40L ELISA试剂盒具有更好的灵敏度和特异性，其对ACS的临床诊断及病情监测具有重要的应用价值。本发明的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床心脑血管病特别是ACS临床诊断及病情监测提供了一种新的检测产品。
文档编号G01N33/68GK102964428SQ20121048329
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者段旭, 焦守恕, 李全 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
