专利名称：一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术：
促卵泡生成激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)是由垂体前叶分泌的糖蛋白激素，其分子量大约为30，000，由两条多肽链(B卩α和β亚单位组成)，FSH的α亚单位由92个氨基酸残基组成，并与LH、TSH和hCG的α亚单位的结构相同，β亚单位在上述激素之间是不同的，从而赋予各激素各自的生物及免疫学特性。其主要功能是促进卵巢的卵泡发育和成熟，主要为促进卵泡颗粒层细胞增生分化，促进整个卵巢长大。其作用于睾丸曲细精管时可促进精子形成。FSH与LH协同作用促进排卵等作用。在女性中，LH在卵泡期与FSH—起促进卵泡的成熟、雌性激素的合成和分泌；促进排卵和使排卵后的卵泡转变为黄体，促进间质的生长；并促进黄体合成和孕激素与雌性激素的分泌。因此女性的FSH分泌具有明显的周期性，月经周期FSH呈有规律的升高和降低，血中FSH浓度及每日由尿液排泄的FSH的量随周期变化而变化。因此FSH可用于预测排卵时间、绝经期检查、不孕症诊断和内分泌治疗的监测
坐寸ο
男性体内FSH可刺激睾丸支持细胞发育，并促进产生一种能结合雄性激素的蛋白质，通过这种蛋白质，可使发育的生殖细胞获得稳定的高浓度的雄性激素，促进生殖细胞发育，并分化成为成熟的精子。男性体内FSH分泌无明显周期性，但在50岁以后略有升高。男性体内高水平的FSH会在睾丸衰退和克兰费尔特氏综合症的初期出现。此外，FSH的浓度在饥饿、肾衰竭、甲状腺机能亢进和肝硬化时也会有所提高。目前用于促卵泡生成激素(FSH)的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的促卵泡生成激素的定量检测方法，该方法不仅准确性好、灵敏度高，且精密度特别是分析间精密度高，此外该方法成本低。本发明同时还要提供一种促卵泡生成激素的定量检测所用的试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现促卵泡生成激素准确和高精确地定量测定。此外，本发明还提供一种促卵泡生成激素的定量检测所用的试剂盒的简便和低成本的制备方法。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案一种促卵泡生成激素化学发光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，特别是，所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中第一试剂含荧光素标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7-9的缓冲液，所述荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5"! μ g/mL ；第二试剂含碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7-9的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL ；磁分离试剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。根据本发明，所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体由碱性磷酸酶与促卵泡生成激素抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。
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根据本发明，所述的第一试剂中的含有荧光素标记的促卵泡生成激素抗体是能够通过成熟和稳定的工艺容易地制备的。根据本发明，所述包被有荧光素抗体的磁微粒的制备也是较为容易的，且现有技术已有成熟的制备工艺可以参照。例如可以通过常规的物理吸附或化学偶联包被方式制备，没有特别限制。作为本发明的一种优选实施方案该包被有荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。本领域技术人员应知晓，本发明的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本发明试剂盒来说并非必不可少。本发明采取的又一技术方案是一种所述的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及所述磁分离试剂的步骤，其中，所述第二试剂的制备过程如下( I)使促卵泡生成激素抗体与交联剂2-亚氨基四氢噻吩在甘氨酸溶液中，室温静置反应，生成促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物，于2-8°C下保存备用；(2)使碱性磷酸酶溶液与交联剂琥珀酰亚胺基-4_[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物溶液混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，将收集到的碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4- [N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物于2-8°C下保存备用;(3)将步骤(I)所得溶液与步骤(2)所得溶液按照促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4_[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:1 2混合，在2_8°C下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体，反应结束，将反应液通过Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择合适的PH缓冲液调整浓度和pH值即得所述的第二试剂。进一步地，所述的促卵泡生成激素抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%,且所述碱性磷酸酶的比活性超过lOOOu/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度大于等于 5mg/mlο根据一个具体方面，所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为9^10的缓冲液，然后按照荧光素与促卵泡生成激素抗体的分子比为2(Γ200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9 10的缓冲液与促卵泡生成激素抗体混合,混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的溶液，接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述第一试剂。根据又一具体方面，所述的磁分离试剂的制备方法如下使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应2 18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。优选地，所述的磁微粒具有超顺磁性，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于O. 4毫摩尔，其直径为O. 5 2微米；所述的荧光素抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，其纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万，所述偶联剂为碳二亚胺。本发明以上所述的缓冲液可以是本领域常用的那些，例如碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液。实际实施过程中，可选择最适合的缓冲液。例如，在第一试剂、第二试剂以及磁分离试剂的制备的最后阶段，通常采取含O. 5%牛血清蛋白(BSA)、pH8.0的O. lmol/L 的 TRIS 缓冲液。本发明所述的荧光素可以是已知的各种荧光素，常用的有例如异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明等。本发明采取的又一技术方案是一种促卵泡生成激素的检测方法，该方法是基于磁微粒分离技术的化学发光免疫检测法，所述检测方法包括依次进行的免疫反应步骤、使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤，其特征在于所述的免疫反应步骤采用权利要求广3中任一项权利要求所述的试剂盒，且具体实施如下在检测管中加入待测样本原液，然后依次第一试剂、第二试剂，混匀，在25-40°C条件下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，25-40°C条件下进行第二次温育；所述的底物溶液为碱性磷酸酶化学发光底物溶液。进一步地，所述第一次温育的时间为10-30min ;第二次温育的时间为2_15min。上述的使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检 测仪检测发光强度的步骤均可参照常规方法实施，所用的设备以及装置也是常规的。其中，碱性磷酸酶化学发光底物溶液为含一定浓度二氧杂环乙烷类化合物的浓度O. 6mmol/L, pH9. 35的Tris缓冲液。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点
1、采用本发明的试剂盒以及结合传统的化学发光免疫检测方法和设备就可以实现促卵泡生成激素准确，精密的检测；2、本发明的试剂盒中的第一试剂、磁分离试剂可以通过成熟、稳定的制备工艺制备得到，生产成本低，且由于制备工艺的稳定性，试剂盒分析批间差�。觳獾姆治黾渚芏忍岣撸�3、本发明的试剂盒中的第二试剂的制备方法，能够有效将促卵泡生成激素抗体与碱性磷酸酶偶联，偶联效率高，进一步降低试剂盒的成本低和确保试剂盒的检测效果。4、本发明的检测方法检测的准确度好，精密度高，灵敏度高，检测范围宽，样品无序预稀释，操作简单省时。与采用进口试剂盒进行检测的方法相比，本发明的检测方法在成本上具有显著的优势。
·图1为采用本发明促卵泡生成激素化学发光定量检测试剂盒的测试校准品检测相对发光值的标准曲线，横坐标为浓度，单位为ng/mL，纵坐标为发光值。图2为为本发明灵敏度测试中A，B点连点拟合曲线。图3为本发明的促卵泡生成激素化学发光定量检测试剂盒的血清检测结果与贝克曼公司试剂盒检测结果的相关性，横坐标X为实施例1制备得的试剂盒样本测值，浓度单位为mIU/mL，纵坐标y为贝克曼公司试剂盒样本测值，浓度单位为ml U/mL。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的具体实施方式
进行详细说明。实施例1磁分离试剂的制备。材料与仪器磁微粒的悬浮液磁微�：�5wt%，含羧基(COOH)活性基团，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩尔(mmol)，具有超顺磁性，直径在O. 5-2 μ m之间。抗FITC抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，纯度应超过90%，稀释效价应超过1:100万。2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、TRIS和其他试剂应达到化学纯。操作步骤1、取IOOmg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用O. 05mol/L, pH4. 5-5MES缓冲液IOml重悬；2、加入2-4mg的抗FITC抗体，室温混悬30_60min ；3、加入O. 5-lml,新鲜配制的10mg/ml, EDC水溶液,室温混悬2_12h ；4、磁分离，去上清，用含质量百分比为O. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH8. O的O.1mol/L的TRIS缓冲液重悬到lmg/ml，pH8. 0，完成磁分离试剂的制备。实施例2第一试剂的制备。材料与仪器抗FSH单克隆抗体,纯度超过95wt%,浓度超过2mg/ml,以磷酸盐缓冲液保存；异硫氰酸荧光素(FITC)，碳酸钠等试剂应达到化学纯，
G-25凝胶纯化柱采购自GE公司。操作步骤1、用 O. 1-0. 2mol/LpH9. 0-10. O 的碳酸盐缓冲液配制 O. 5mg/ml 的 FITC 溶液；2、按照抗FSH抗体与FITC分子摩尔数比1:20比例在抗体溶液中加入FITC溶液，混合均匀，室温静置超过12h ；3、用G-25凝胶柱将抗体FITC连接物与游离FITC分离，获得偶联有FITC分子的抗体浓溶液，将该溶液用含质量百分比为O. 5%牛血清白蛋白(BSA) pH8. O的O. lmol/L的TRIS缓冲液稀释到O. 5-1 μ g/ml, pH为7-9，即为第一试剂。实施例3第二试剂的制备。材料与仪器抗FSH单克隆抗体，纯度超过95%，浓度超过lmg/ml，以磷酸盐缓冲液保存；碱性磷酸酶纯度约为99%，比活性约为1500U/mg，浓度为10mg/ml ；偶联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物(SMCC)，2_亚氨基四氢噻吩(2-1T)购自THERMO公司，TRIS等化学试剂应达到化学纯；AKTA-purifier蛋白纯化仪和Supperdex200凝胶纯化柱为GE公司产品。操作步骤
1、取Img抗FSH抗体，加入10mg/ml的偶联剂2-1T溶液2-4 μ 1，室温静置20min，加入O. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ 1，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，
2-8 °C保存备用；2、取1. 5mg的ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液10-20 μ 1，室温静置30min,用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8°C保存备用；3、将上述活化的抗FSH抗体与活化的ALP混合，2-8 °C条件下静置12_24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，2_8°C保存备用。4、将抗体-ALP连接物浓溶液用含0. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH8. O的0. lmol/L的TRIS缓冲液稀释到0. 5-1 μ g/ml,，pH7_9，即为第二试剂。实施例4用于促卵泡生成激素定量检测的试剂盒该试剂盒包括按照实施例1方法制备的磁力分离试剂50ml ；按照实施例2方法制备的第一试剂(浓度为0. 75 μ g/ml), 50ml ；按照实施例3方法制备的第二试剂(浓度为0. 75 μ g/ml), 50ml。实施例5用于促卵泡生成激素定量检测的试剂盒该试剂盒包括按照实施例1方法制备的磁力分离试剂50ml ；按照实施例2方法制备的第一试剂(浓度为0. 5 μ g/ml), 50ml ；按照实施例3方法制备的第二试剂(浓度为0. 5 μ g/ml), 50ml。实施例6采取实施例4的试剂盒进行促卵泡生成激素的定量检测(一)检测实施下述检测步骤由全自动化学发光分析仪自动完成，也可手工操作完成。1、在检测管中加入20 μ I待测样本(血清)原液，然后加入50 μ I第一试剂和50 μ I第二试剂混匀，37 ± I °C条件下温育15min ；2、加入50 μ I磁分离试剂，混匀，37 ± I °C条件下温育5min ；3、使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入300 μ I的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬。重复此操作，共操作3次。4、将磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入100 μ I的碱性磷酸酶化学发光底物溶液(北京阿匹斯生物技术有限公司APCL-1 )，去除磁�。�5分钟内用发光检测仪进行检测。(二)绘制校准品标准曲线校准品标准曲线参见图1.(三)灵敏度评价检测“O”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度不大于O. 3mIU/mL。其中A点的发光值参见表1:表I
权利要求
1.一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，其特征在于所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中第一试剂含荧光素标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7-9的缓冲液,所述荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL ；第二试剂含碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体、PH为7-9的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL ；磁分离试剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
2.根据权利要求1所述的一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体由碱性磷酸酶与促卵泡生成激素抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。
3.根据权利要求1所述的一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述包被有荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。
4.一种如权利要求1-3中任一项权利要求所述的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及所述磁分离试剂的步骤，其特征在于所述第二试剂的制备过程如下(I)使促卵泡生成激素抗体与交联剂2-亚氨基四氢噻吩在甘氨酸溶液中，室温静置反应，生成促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物，于2-8°C下保存备用；(2 )使碱性磷酸酶溶液与交联剂琥珀酰亚胺基-4- [N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物溶液混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，将收集到的碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4_[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物于2-8°C下保存备用；(3 )将步骤(I)所得溶液与步骤(2 )所得溶液按照促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:广2混合，在2-8°C下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体，反应结束，将反应液通过Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择合适的pH 缓冲液调整浓度和PH值即得所述的第二试剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的促卵泡生成激素抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过lOOOu/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度大于等于5mg/ml。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为9 10的缓冲液,然后按照荧光素与促卵泡生成激素抗体的分子比为 20^200:1的比例,将所述含有荧光素的pH为9 10的缓冲液与促卵泡生成激素抗体混合,混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的溶液，接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和 PH，即得所述第一试剂。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的磁分离试剂的制备方法如下 使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应疒18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的磁微粒具有超顺磁性，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0. 4毫摩尔，其直径为0. 5 2微米；所述的荧光素抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，其纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万，所述偶联剂为碳二亚胺。
9.一种促卵泡生成激素的检测方法，该方法是基于磁微粒分离技术的化学发光免疫检测法，所述检测方法包括依次进行的免疫反应步骤、使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤，其特征在于所述的免疫反应步骤采用权利要求Γ3中任一项权利要求所述的试剂盒，且具体实施如下在检测管中加入待测样本原液，然后依次第一试剂、第二试剂，混匀，在25-40°C条件下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，25-40°C条件下进行第二次温育；所述的底物溶液为碱性磷酸酶化学发光底物溶液。
10.根据权利要求9所述的一种促卵泡生成激素的检测方法，其特征在于所述第一次温育的时间为10-30min ;第二次温育的时间为2_15min。
全文摘要
本发明涉及一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒包括第一试剂含异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体的溶液；磁分离试剂含包被着异硫氰酸荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法和采用该试剂进行促卵泡生成激素的检测方法。相对于现有技术，本发明准确性更好、精密度更高、灵敏度更高，而且待测样本无需预稀释，操作简单省时，检测范围宽，并且成本低。
文档编号G01N33/74GK103048473SQ20121054984
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者于大为, 程晓蕾 申请人:苏州浩欧博生物医药有限公司
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