专利名称：一种利用菲律宾蛤仔检测海洋环境中三丁基氧化锡的方法
技术领域：
本发明涉及一种在环境保护、生态监测以及水产品养殖、出口和加工等领域中使用的检测方法，即利用海洋底栖无脊椎动物—菲律宾蛤仔对海洋环境中存在的内分泌干扰物—三丁基氧化锡的富集作用，采用气相色谱仪与电子俘获检测器来检测海洋环境中微量或痕量的三丁基氧化锡。
背景技术：
随着社会科技进步和工农业的发展，人类制造的各种化学品在为人类带来方便的同时也随人类的活动而大量进入周围环境。其中许多化学物质具有干扰内分泌系统的作用，从而影响生物的正常生命活动，它们被称为环境内分泌扰乱化学物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)或内分泌干扰物、环境激素，包括三丁基氧化锡在内的有机锡化合物就是一类典型的内分泌干扰物。
有机锡化合物的大规模使用始于20世纪中期，主要用作塑料工业生产的稳定剂和催化剂。随着使用范围的不断扩大，大量有机锡化合物被用于工业、各种杀虫剂、除草剂、纺织品防霉以及海洋船只防污(antifouling)涂料中。但到上世纪70年代中期，有机锡的强毒性便显现出来，被认为是迄今为止由人为因素大量进人海水环境的最毒的化学品之一，因此已有许多个国家制定了相关法规对这类化合物的使用加以限制。但由于这种化合物可以在环境中长期滞留，而且有机锡作为更新换代迅速的精细化工产品，是优良的塑料稳定剂及纺织品防霉剂，用途十分广泛，其世界年消耗量与日俱增，造成的环境污染也日益严重。
据统计，我国年有机锡消耗量已达7500吨左右。目前我国港口水域有机锡污染问题相当严重，特别是近海、港湾和内河港口，有机锡的污染是造成鱼类、甲壳类和软体类、水生生物以及藻类污染的主要因素之一。但是，目前对于三丁基氧化锡等环境激素的筛选和测试研究多集中于化学领域，而由于许多内分泌干扰物在海洋环境中存在的浓度很�。枰⒄刮⒘炕蚝哿炕镏始觳饧际鹾透呔纫瞧魃璞福裨蚰岩约觳獾�。
软体动物对有机锡化合物的敏感性已经被众多学者所证实，基于有机锡长期低剂量的生态效应主要是通过生物积累或食物链放大产生，即软体动物体内污染物含量往往较周围海水中高得多，从而引起其内分泌扰乱的现象，世界许多国家和地区正在研究如何利用软体动物建立一种生物监测及快速检测系统。菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum Adams et Reeve)又称蛤仔，隶属于软体动物门，广泛分布于我国南北沿海，资源蕴藏量很大，栖息密度高，是自然海区底栖生物群落常见优势种，具有分布广泛、易获得、易饲养等特点，而且基础研究比较深入，易于取得其不同部位的组织，是用于环境激素生物检测的较为理想的模式动物。但是，目前尚无利用菲律宾蛤仔检测海洋环境中微量或痕量三丁基氧化锡的方法，所以开发建立这种灵敏、实用的生物检测技术非常必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用海洋底栖无脊椎动物菲律宾蛤仔(RuditapesPhilippinarum，以下简称蛤仔)来检测海洋环境中内分泌干扰物三丁基氧化锡(TBTO)的方法，它能弥补现有技术的上述不足。
一种利用菲律宾蛤仔检测海洋环境中三丁基氧化锡的方法，其特征是首先取样，样品为菲律宾蛤仔的器官—肝脏、鳃或外套膜；先将样品匀浆，加水，再加入氯化钠、浓盐酸，反应后再加入乙酸乙酯和正己烷混合液，振荡，离心，取上清液，再加入硼氢化钠乙醇溶液。对样品做前处理后利用气相色谱仪和电子俘获检测器检测样品中TBTO的含量。
本检测方法的优点是快速、简便和灵敏，这是由于海洋底栖无脊椎动物菲律宾蛤仔的肝脏等器官对三丁基氧化锡有较强的富集能力、气相色谱仪优越的分离性能和微型电子俘获检测器良好的灵敏度。
附图1为本发明方法测得的蛤仔器官中三丁基氧化锡含量随取样时间的变化。
附图中的数值经t检验，除肝脏第4周与第5周间差异较小外(p＝0.08)，其余各周数值间差异均显著(p＜0.05)；对照组因均未检出TBTO，故未在图中标出。
具体实施例方式
1.将菲律宾蛤仔饲养子TBTO浓度为200ng/L(76.55ngSn/L)水体中，每周取出48只蛤仔用于检测分析。其中菲律宾蛤仔产于青岛近海，于实验室驯养1～2周后进行TBTO毒理实验。海水取自青岛石老人海水浴场自然海区。TBTO为美国Aldrich公司生产，纯度96％，分子式为C24H54OSn2。实验进行5周，设3个平行组、3个对照组，每组50只蛤仔，水体20L，每24小时全换水，水中TBTO浓度维持不变。实验期间饵料为新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、青岛大扁藻(Platymonashelgolandica Kylin var.tsingtaoensis)和湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)。
2.取蛤仔的三种不同器官(肝脏、鳃、外套膜)各1g(按湿重计，用滤纸将各样品表面海水及残存组织液吸净)，匀浆并对分装好后的样品以水补至10g，再向各样品中分别加入氯化钠1.5g、浓盐酸1g，反应10min；反应完成后分别向其中加入乙酸乙酯及正己烷混合液5g(乙酸乙酯与正己烷的体积比为3∶2)；剧烈振荡30min，随后倒入20ml离心管中离心(3000rpm，10min)；3.离心后分别将上清液(每管约回收2ml)移入小烧杯中，并于40℃水浴上蒸干；残余物用1ml无水乙醇溶解，并加入2.5％(重量百分浓度)的硼氢化钠乙醇溶液1.58g，反应10min；4.反应完成后分别加入氯化钠2.5g、水7.5ml，静置10min；再向其中分别加入正己烷2.5ml，先振荡后静置；30min后分离出有机层；5.将各有机层上30×10mm硅胶柱，对样品作净化处理(硅胶需事先用正己烷溶胀并将层析柱充分平衡后再进行洗脱分离)，洗脱溶剂为正己烷。
6.将经过净化处理的样品以气相色谱仪与电子俘获器联用，按已知的方法检测各样品中TBTO的含量。操作条件如下进样量1μl，进样口温度200℃，柱温箱温度100℃-240℃，10℃/min程序升温，检测器温度250℃，载气N2，流速1.5ml/min，色谱柱0.32mm×30m HP-5，运行时间10min。7.检测结果见表1、图1和表2。
表1.不同批次各组蛤仔脏器中TBTO含量(ng/g)
注1.首行各编号依次对应第1～3实验组和第1～3对照组；2.第二行中各字母分别表示D-肝脏，G-鳃，M-外套膜；3.“-”表示未检出TBTO。
表2.菲律宾蛤仔三种器官对三丁基氧化锡的富集因子
注富集因子—菲律宾蛤仔脏器内TBTO的浓度与周围水环境中TBTO浓度的比值。
本发明中所述的向样品加入水、氯化钠和浓盐酸的重量分别为样品重量的8-10、1.3-1.7、0.8-1.2倍，反应后加入的乙酸乙酯及正己烷混合液的重量为样品重量的4-6倍。所述的硼氢化钠乙醇溶液的浓度为2-3％，它的用量与蛤仔器官用量的重量比为1.5-1.7。
权利要求
1.一种利用菲律宾蛤仔检测海洋环境中三丁基氧化锡的方法，其特征是首先取样，样品为菲律宾蛤仔的器官—肝脏、鳃或外套膜；先将样品匀浆，加水，再加入氯化钠、浓盐酸，反应后再加入乙酸乙酯和正己烷混合液，振荡，离心，取上清液，再加入硼氢化钠乙醇溶液。对样品做前处理后利用气相色谱仪和电子俘获检测器检测样品中TBTO的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的向样品加入水、氯化钠和浓盐酸的重量分别为样品重量的8-10、1.3-1.7、0.8-1.2倍，反应后加入的乙酸乙酯及正己烷混合液的重量为样品重量的4-6倍。所述的硼氢化钠乙醇溶液的浓度为2-3％，它的用量与蛤仔器官用量的重量比为1.5-1.7。
全文摘要
一种利用菲律宾蛤仔检测海洋环境中三丁基氧化锡的方法，其特征是首先取样，样品为菲律宾蛤仔的器官——肝脏、鳃或外套膜；先将样品匀浆，加水，再加入氯化钠、浓盐酸，反应后再加入乙酸乙酯和正己烷混合液，振荡，离心，取上清液，再加入硼氢化钠乙醇溶液。对样品做前处理后利用气相色谱仪和电子俘获检测器检测样品中TBTO的含量。本检测方法的优点是快速、简便和灵敏，这是由于海洋底栖无脊椎动物菲律宾蛤仔的肝脏等器官对三丁基氧化锡有较强的富集能力、气相色谱仪优越的分离性能和微型电子俘获检测器良好的灵敏度。
文档编号G01N30/00GK1603816SQ200410036078
公开日2005年4月6日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者朱丽岩, 齐亚超, 刘光兴 申请人:中国海洋大学
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