专利名称：快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备的制作方法
技术领域：
本方法属于生物检测技术，特别是一种快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备，适用于食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法。
背景技术：
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes，简称单增李斯特菌)是一种人畜共患的食源性病原菌，简称单增李斯特氏菌。单增李斯特氏菌是一种革兰氏阳性短杆菌，不产芽孢，临床主要表现为败血症、脑膜炎等，尤其易感染孕妇、新生儿、老年人等免疫力低下的人群和免疫缺陷病人，孕妇感染后可引发菌血症导致早产、死婴等，因而在食品安全领域受到重视。单增李斯特菌广泛地存在于环境中，且该菌传染途径繁多。人能够通过自身传播李斯特菌�。绕涫窃谝皆夯蛉丝诿芗牡胤剑萦泄匮芯勘ǖ溃笤加�5 %-10 %的健康人群携带有李斯特菌。通过直接或间接接触动物，人也可能感染李斯特菌病。食物在生产销售链中任何一个环节都可能受到单增李斯特菌的污染，包括从原产地到工厂的加工过程， 进入分销环节，直至到消费者手中。近年来，在奶和奶制品、肉制品、水产品、蔬菜、水果、沙拉等多种食品中曾多次发现单增李斯特氏菌感染案例。频频爆发的大规模李斯特菌病感染事件已经引起了世界各国的重视。WHO将其列为20世纪90年代四大食源性致病菌之一， 并在2000年建立了全球监测网，在世界范围内开展与食源性致病菌相关疾病的监测。世界
各国也纷纷制订了一些新的食品安全法规，并把单核细胞增生性李斯特菌纳入法定强检项目。目前，食品中单增李斯特菌的检测主要有三大技术手段，分别是传统的富集分离和纯化鉴定技术、分子生物学检测技术和免疫学检测技术。传统检验方法首先对样品进行前增菌处理后，分离纯化出可疑微生物，进一步对可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAMP)、动物实验及典型运动等鉴定，被确定为李斯特菌后进一步进行血清分型。传统检验方法中，前增菌处理是不可或缺的实验步骤，目前国际常用的增菌法主要有国际乳业联盟(IDF)、美国食品药品管理局(FDA)及美国农业部(USDA)的增菌法。我国检测单增李斯特菌方法主要有国标GB/T4789. 30-2008和行业标准SN-TO184. 1-2005。这些增菌方法耗时不一，但至少都需要20h，且后续鉴定程序复杂，不能够适应当今社会快速、准确、 灵敏、特异检测微生物的要求。分子生物学检测方法主要包括PCR法和DNA探针法，与传统方法相比，分子生物学检测技术能大大减少工作量，具有灵敏度度高、特异性强等特点，因此在一定程度上满足了灵敏、快速、特异的检测需求。但是分子生物学法仍需对样品进行前处理，且样品前处理的好坏很大程度上会影响PCR检测结果。此外，PCR和探针杂交等方法都无法排除死菌。尽管通过增菌可使死菌比例减少，相对地减少了假阳性，但并不能完全杜绝死菌的检测，因此存在假阳性反应。
免疫学方法是基于抗原抗体特异性反应而建立的一种检测方法，具有快速，敏感， 特异，简便，结果易于判断等特点。目前，单增李斯特菌的免疫学检测法有ELISA、酶联荧光免疫检测系统等，通�？稍贛小时内得到检测结果。其中应用最为广泛的是ELISA法， 该法曾被国标GB/T4789. 30-2008列为可供选择的检测方法之一，具有操作简便、通量高等特点，但其操作过程需要专用的实验室和专业人员进行检测，操作步骤复杂，且检测时间较长，一般需18 Mh。LFIA技术是ELISA技术原理的扩展应用，一般使用乳胶颗粒、胶体硒、 胶体金、脂质体及上转磷等作为着色标记物。在层析时，标记物与待测物之间形成的复合物可被相应的配体所捕获而聚集于硝化纤维膜上的检测线并呈现出标记物所带有的颜色，因此可以通过纤维膜上显色条的有无、颜色深浅和反射光线等从而实现检测目的，由于一般不需要特殊大型设备，从而具有操作简便、快速灵敏的优点。是一种适用于现场的快速检测方法，在目前公开的报道中，大都以胶体金颗粒作为标记物，因此又被称为胶体金免疫层析法。磁性免疫层析技术以超顺磁性颗粒代替传统的标记物来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米颗粒上的目标物来提供对生物样本的定量检测数据，再利用被磁颗粒标记抗体所捕获的免疫复合物与磁信号之间的线性关系即可实现对生物样本的快速定量检测目的，磁性免疫层析技术具有灵敏度高、稳定性强、线性范围宽、操作简便、快速等优
点ο
发明内容
本发明的目的针对现有检测技术不能快速、简便地检测单增李斯特菌的不足和缺陷，提供一种以免疫磁珠为标记物的快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法及磁珠标记层析试纸条的制备。从而实现快速、简便检测单增李斯特菌目的。1、本发明提出的快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法，其特征在于用杂交瘤技术制备筛选所得的单增李斯特菌的特异性反应鼠系单克隆抗体作为磁珠标记抗体， 通过化学结合方式将筛选所得单克隆抗体偶联到磁性纳米材料的表面制备成免疫磁珠；将由样品垫、经免疫磁珠标记的结合垫、预包被有选自新西兰大白兔的抗血清的单增李斯特菌兔抗血清的检测线τ和山羊抗小鼠IgG的控制线C的层析膜、吸水垫组建成一种基于双抗夹心检测原理的单增李斯特菌的磁性免疫层析试纸条；检测时在样品垫上加入样品液， 室温下放置20min，依据免疫磁珠磁性纳米材料的颜色在检测线T区域和控制线C区域处形成的肉眼可见的显色条带的判读，从而实现单增李斯特菌的快速定性检测；或将已使用试纸条放入磁信号检测仪上，对免疫层析后形成的检测线T区域和控制线C区域进行检测获取定量反应数据，从而实现单增李斯特菌的定量检测。其中所述的抗单增李斯特菌特异性单抗是采用杂交瘤技术制备筛选所得，所述的抗单增李斯特菌特异性多抗是通过免疫新西兰大白兔制备所得，两种抗体对单增李斯特菌具有特异性反应。本发明所述的磁性免疫层析方法所用检测试纸条的制备步骤如下A.抗体的制备与纯化以紫外灭活处理的单增李斯特菌体作为抗原免疫BALB/C小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单抗细胞株，然后将抗单增李斯特菌的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到BALB/C小鼠中制备腹水，制备所得腹水经50 %重量/体积比的硫铵浓缩后， 采用商业化的Protein-G亲和层析柱进行抗体的纯化；具体进行亲和层析纯化处理时，按照所附产品操作说明书进行。以紫外灭活处理的单增李斯特菌体作为抗原免疫新西兰白兔，所得抗血清经50% 重量/体积比的硫铵浓缩后，采用商业化的脱盐柱按照产品操作说明书进行脱盐处理，所得溶液保存于-80度待用。B.免疫磁珠的制备选用直径为50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺和琥珀酰亚胺共价交联的方式将抗单增李斯特菌单抗标记在磁珠上形成免疫磁珠；C.结合垫的处理将制备好的免疫磁珠悬浮液喷点在结合垫上以形成免疫磁珠标记结合垫；喷点时也可以采用人工手动喷液或定量喷液装置来进行。D.层析膜的包被用自动喷膜仪，以0. 8 μ L/cm的速度，将选定浓度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0. 5-1. Ocm ；包被后的层析膜于37°C的干燥箱中烘干4-6小时，置于干燥器中保存备用；E.试纸条的组装与制备将样品垫、结合了免疫磁珠的结合垫、包被膜、吸水垫依次相互交错约Imm粘贴在衬板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜；根据要求宽度切割即可得到磁性免疫层析试纸
^^ ο免疫磁珠的制备方法如下1)吸取 2mg 羧基磁珠于离心管中，用 500 μ L 0. OlM 含 0. 5% (v/v) Tween-20, pH 为5. 0的MES溶液作为活化缓冲溶液清洗磁珠，将离心管置于磁分离架上使得磁珠与活化溶液分离，重复清洗几次，最后重悬磁珠；2)将新鲜配制的EDC和NHS加入磁珠悬液中活化羧基30min，反应结束后先用 MEST缓冲液洗涤磁珠，再用0. 005M硼酸盐吐温溶液(简称BST)作为偶联缓冲液洗涤磁珠 2遍；3)加入150 μ g单增李斯特菌的特异性鼠系单克隆抗体，在旋转混合器上反应3小时；4)加入1 % (w/v) BSA溶液室温下反应30min ；5)用BST溶液洗涤免疫磁珠4次，将磁珠重悬，4°C保存备用。本发明与现有技术相比具有如下优点将超顺磁性纳米材料、免疫层析技术和磁性检测仪相结合，通过构建以免疫磁珠为标记物的免疫层析试纸条，既可满足定性检测需求，又能实现定量检测目的，具有灵敏度高、耗时短、方便易用等特点。
图1为本发明的检测试纸条的组成结构的侧面示意图；图2为采用所述磁性免疫层析试纸条对单增李斯特菌阴性样品的检测结果示意图；图3为采用所述磁性免疫层析试纸条对单增李斯特菌的阳性检测结果示意图；图4为采用所述磁性免疫层析试纸条对单增李斯特菌的检测无效的结果示意图；图5为采用所述磁性免疫层析试纸条检测单增李斯特菌的定性检测结果示意图。图中1-样品垫2-结合垫3-T线4-C线5_衬板6_吸收垫7_层析膜(硝酸纤维素膜)8-免疫磁珠(纳米探针)9-样品。
具体实施例方式本发明提出的这种快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法如下用杂交瘤技术制备筛选所得的单增李斯特菌的特异性反应鼠系单克隆抗体作为磁珠标记抗体，通过化学结合方式将筛选所得单克隆抗体偶联到磁性纳米材料的表面制备成免疫磁珠；将由样品垫、经免疫磁珠标记的结合垫、预包被有选自新西兰大白兔的抗血清的单增李斯特菌兔抗血清的检测线T和山羊抗小鼠IgG的控制线C的层析膜、吸水垫组建成一种基于双抗夹心检测原理的单增李斯特菌的磁性免疫层析试纸条；检测时在样品垫上加入样品液，室温下放置20min，依据免疫磁珠磁性纳米材料的颜色在检测线T区域和控制线C区域处形成的肉眼可见的显色条带的判读，从而实现单增李斯特菌的快速定性检测； 或将已使用试纸条放入磁信号检测仪上，对免疫层析后形成的检测线T区域和控制线C区域进行检测获取定量反应数据，从而实现单增李斯特菌的定量检测。其中所述的抗单增李斯特菌特异性单抗是采用杂交瘤技术制备筛选所得，所述的抗单增李斯特菌特异性多抗是通过免疫新西兰大白兔制备所得，两种抗体对单增李斯特菌具有特异性反应。本发明所述的磁性免疫层析方法所用检测试纸条的制备步骤如下A.抗体的制备与纯化以紫外灭活处理的单增李斯特菌体作为抗原免疫BALB/C小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单抗细胞株，然后将抗单增李斯特菌的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到BALB/C小鼠中制备腹水，制备所得腹水经50 %重量/体积比的硫铵浓缩后， 采用商业化的Protein-G亲和层析柱进行抗体的纯化；具体进行亲和层析纯化处理时，按照所附产品操作说明书进行。以紫外灭活处理的单增李斯特菌体作为抗原免疫新西兰白兔，所得抗血清经50% 重量/体积比的硫铵浓缩后，采用商业化的脱盐柱按照产品操作说明书进行脱盐处理，所得溶液保存于-80度待用。B.免疫磁珠的制备选用直径为50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺和琥珀酰亚胺共价交联的方式将抗单增李斯特菌单抗标记在磁珠上形成免疫磁珠；C.结合垫的处理将制备好的免疫磁珠悬浮液喷点在结合垫上以形成免疫磁珠标记结合垫；喷点时也可以采用人工手动喷液或定量喷液装置来进行。D.层析膜的包被用自动喷膜仪，以0. 8 μ L/cm的速度，将选定浓度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0. 5-1. Ocm ；包被后的层析膜于37°C的干燥箱中烘干4-6小时，置于干燥器中保存备用；E.试纸条的组装与制备将样品垫、结合了免疫磁珠的结合垫、包被膜、吸水垫依次相互交错约Imm粘贴在衬板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜；根据要求宽度切割即可得到磁性免疫层析试纸免疫磁珠的制备方法如下1)吸取 2mg 羧基磁珠于离心管中，用 500 μ L 0. OlM 含 0. 5% (v/v) Tween-20, pH 为5. 0的MES溶液作为活化缓冲溶液清洗磁珠，将离心管置于磁分离架上使得磁珠与活化溶液分离，重复清洗几次，最后重悬磁珠；2)将新鲜配制的EDC和NHS加入磁珠悬液中活化羧基30min，反应结束后先用 MEST缓冲液洗涤磁珠，再用0. 005M硼酸盐吐温溶液(简称BST)作为偶联缓冲液洗涤磁珠 2遍；3)加入150 μ g单增李斯特菌的特异性鼠系单克隆抗体，在旋转混合器上反应3小时；4)加入1 % (w/v) BSA溶液室温下反应30min ；5)用BST溶液洗涤免疫磁珠4次，将磁珠重悬，4°C保存备用。实施案例1单增李斯特菌的磁性检测试纸条的制备(1)单增李斯特菌的特异性免疫磁珠的制备EDC/NHS 偶联将单增李斯特菌特异性鼠系单克隆抗体与羧基修饰的纳米磁珠(粒径为200nm) 进行偶联，制备单增李斯特菌的特异性免疫磁珠，即磁标抗体。以PH5. 0的MEST溶液 (0. 05 % Tween-20)作为活化缓冲溶液，取^iig羧基磁珠于2mL离心管中，加入500 μ L活化缓冲液，在漩涡振荡器上混合均勻，再将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，用微型台式真空泵抽提上清液；用500 μ L活化缓冲液重新洗涤磁珠两遍后，EDC与NHS溶液， 用活化缓冲液调整体积至500 μ L，在漩涡振荡器上混合均勻，室温活化30min。活化后，用活化缓冲液洗涤磁珠两遍，以除去未反应的活化剂。以PH9. 0的硼酸盐吐温缓冲液(0. 05% Tween-20)溶液作偶联缓冲液，以偶联缓冲液洗涤磁珠两遍；然后加入150 μ g已纯化的单克隆抗体，使磁珠表面活化的羧基与抗体的氨基室温反应池，将抗体偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。偶联完成后，加入500μ L的BSA(w/v)室温下封闭反应30min。最后，用偶联缓冲液洗涤封闭后的磁珠四遍后，保存于500 μ L保存液中。(2)磁性检测试纸条的制备以兔系抗血清作为检测抗体，用点膜仪以0. 8 μ L/cm的速度将2mg/mL新西兰大白兔的抗血清固定在硝酸纤维素膜上的T线区域，在距离T线0. 8cm处，靠近吸水纸端为C线， 用点膜仪将lmg/ml的山羊抗小鼠IgG固定在硝酸纤维素膜上的C线区域。参见图1，将样品垫、结合垫、包埋有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸水垫依次衔接在衬板上，各部件之让均有Imm的重叠部分，然后剪裁成0. 5cm宽的磁性免疫层析检测试纸条。然后将4°C保存的制备好的磁标抗体用磁珠悬浮液两倍体积重悬，取5μ L点于结合垫上。
实施案例2样品的定性检测在试纸条的样品垫处添加100μ L样品，室温反应20min后，肉眼观察检测结果。参见图2，阳性结果呈现两条明显的条带或者T线的条带浅于C线条带，而阴性结果仅C线处出现一条条带，T线处无条带。检测时若C线处无条带，则试纸条体系有问题，其检测结果视为无效。实施案例3样品的定量检测把试纸条装入专用的试纸条卡槽，插入磁性分析仪的专用卡槽处读取试纸条T线和C线处的磁信号，以阳线样本与阴性样本在T线处的定量信号间的比值对检测结果进行评价，值彡2的样品其结果视视为阳性，1^/1^值< 2的样品其结果视为阴性。磁性免疫层析试纸条对单增李斯特菌检测结果示意图的说明如下图2为采用所述磁性免疫层析试纸条对单增李斯特菌阴性样品的检测结果示意图；即检测线T处无显色条带，控制线C处有显色条带。图3为采用所述磁性免疫层析试纸条对单增李斯特菌的阳性检测结果示意图；即检测线T处和控制线C处均有显色条带。图4为采用所述磁性免疫层析试纸条对单增李斯特菌的检测无效的结果示意图；即检测线T处有显色条带，而控制线C处无显色条带。图5为采用所述磁性免疫层析试纸条检测单增李斯特菌的定性检测结果示意图。即检测线T和控制线C处均无显色条带。表 权利要求
1.一种快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法，其特征在于将采用杂交瘤技术制备筛选所得的单增李斯特菌的特异性反应鼠系单克隆抗体作为磁珠标记抗体，通过化学结合方式将筛选所得单克隆抗体偶联到磁性纳米材料的表面制备成免疫磁珠；将由样品垫、经免疫磁珠标记的结合垫、预包被有选自新西兰大白兔的抗血清的单增李斯特菌兔抗血清的检测线τ和山羊抗小鼠IgG的控制线C的层析膜、吸水垫组建成一种基于双抗夹心检测原理的单增李斯特菌的磁性免疫层析试纸条；检测时在样品垫上加入样品液，室温下放置20min，依据免疫磁珠表面磁性纳米材料的颜色在检测线T区域和控制线C区域处形成的肉眼可见的显色条带的判读，从而实现单增李斯特菌的快速定性检测；或将已使用试纸条放入磁信号检测仪上，对免疫层析后形成的检测线T区域和控制线C区域进行检测获取定量反应数据，从而实现单增李斯特菌的定量检测。
2.如权利要求1所述的快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法，其特征在于所述的磁性免疫层析试纸条的制备方法如下A.抗体的制备与纯化以紫外灭活处理的单增李斯特菌体作为抗原免疫BALB/C小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单抗细胞株，然后将抗单增李斯特菌的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到BALB/C小鼠中制备腹水，制备所得腹水经50% (w/v)硫铵浓缩后，采用商业化的 Protein-G亲和层析柱进行抗体的纯化；以紫外灭活处理的单增李斯特菌体作为抗原免疫新西兰白兔，所得抗血清经50% (w/ ν)硫铵浓缩后，采用商业化的脱盐柱进行脱盐处理，所得溶液保存于-80度待用；B.免疫磁珠的制备选用直径为50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价交联的方式将抗单增李斯特菌单抗标记在磁珠上形成免疫磁珠；C.结合垫的处理将制备好的免疫磁珠悬浮液喷点在结合垫上以形成免疫磁珠标记结合垫；D.层析膜的包被用自动喷膜仪，以0. 8 μ L/cm的速度，将选定浓度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0. 5-1. Ocm ；包被后的层析膜于 37°C的干燥箱中烘干4-6小时，置于干燥器中保存备用；E.试纸条的组装与制备将样品垫、结合了免疫磁珠的结合垫、包被膜、吸水垫依次相互交错约Imm粘贴在衬板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜；根据要求宽度切割即可得到磁性免疫层析试纸条。
3.如权利要求1所述的快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法，其特征在于所述的特异性免疫磁珠的具体制备方法为1)吸取2mg羧基磁珠于离心管中，用500μ L 0. OlM含0. 5%体积比的Tween-20，PH为5. 0的MES溶液作为活化缓冲溶液清洗磁珠，将离心管置于磁分离架上使得磁珠与活化溶液分离，重复清洗几次，最后重悬磁珠；2)将新鲜配制的EDC和NHS加入磁珠悬液中活化羧基30min，反应结束后先用MEST缓冲液洗涤磁珠，再用0. 005M硼酸盐吐温溶液作为偶联缓冲液洗涤磁珠2遍；3)加入150yg单增李斯特菌的特异性鼠系单克隆抗体，在旋转混合器上反应3小时；4)加入(w/v)BSA溶液室温下反应30min ；5)用BST溶液洗涤免疫磁珠4次，将磁珠重悬，4°C保存备用。
4.如权利要求3所述的快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法，其特征在于所述的磁性纳米材料为表面修饰有羧基的超顺磁性纳米颗粒，粒径为50 200nm。
5.如权利要求1所述快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法，其特征在于所述的磁性免疫层析方法的检测试纸条包括衬板(5)、样品垫(1)、点有免疫磁珠结合垫O)、 包被有单增李斯特菌的多克隆抗体和质控抗体的硝酸纤维素膜(7)、吸收垫(6)；将样品垫 (1)、点有免疫磁珠结合垫( 、包被有单增李斯特菌的多克隆抗体和质控抗体的硝酸纤维素膜(7)、吸收垫(6)相互交错约Imm依次粘贴在衬板(6)上。
全文摘要
一种快速检测单增李斯特菌的磁性免疫层析方法，将采用杂交瘤技术制备筛选所得的单增李斯特菌的特异性反应鼠系单克隆抗体作为磁珠标记抗体，通过化学结合方式将单克隆抗体偶联到磁性纳米材料的表面制备成免疫磁珠；将由样品垫、磁珠标记的结合垫、预包被有单增李斯特菌兔抗血清的检测线T和山羊抗小鼠IgG的控制线C的层析膜、吸水垫组建成磁性免疫层析试纸条；检测时依据免疫磁珠表面磁性纳米材料的颜色在检测线T区域和控制线C区域处形成的肉眼可见的显色条带的判读，或将已使用试纸条放入磁信号检测仪上，对免疫层析后形成的检测线T区域和控制线C区域进行检测获取定量反应数据，从而实现单增李斯特菌的块速定性或定量检测。
文档编号G01N33/558GK102393462SQ20111029839
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者卢瑛, 林婷婷, 潘迎捷 申请人:上�：Ｑ蟠笱�
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