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专利名称：一种鉴别不同转基因水稻的方法
技术领域：
本发明属于转基因植物的检测领域，尤其涉及一种鉴别不同转基因水稻的方法。
背景技术：
转基因技术是指将外源基因通过生物、物理或化学手段导入其它生物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的遗传改良体。水稻是我国第一大粮食作物，年产量约占粮食总产量的38%，其生产关系着国家的粮食安全。转基因技术突破了水稻传统育种的限制，为保障我国的粮食安全提供了新的途径。随着水稻基因工程技术的飞速发展，转基因水 稻的研究成果斐然。近20年来，利用转基因技术已成功研发出了多种转基因水稻，获得了大量目标性状遗传和表达稳定、农艺性状优良的转基因水稻株系。与此同时，转基因成分的检测方法也越来越受到重视。目前，转基因成分检测方法，可分为定性检测法和定量检测法。目前常用的转基因作物检测方法有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、外源基因整合鉴定法、Westren杂交法、生物测定检测法等。常规的一些转基因植物的检测方法已经不能满足目前快速、准确检测的需要，这些方法有的需要转膜、杂交，操作繁琐、费用高，有的不适合批量样本的检测，严重限制了其应用。转基因检测技术的发展趋势是操作简便、费用较低、适用性强。授权公告号为CN 101343665的发明专利公开了一种转基因抗虫水稻的快速检测方法，其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63 65°C对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增出大量产物。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否；此方法涉及特异引物以及DNA的扩增，成本高，操作复杂，费时费力。

发明内容
本发明提供了一种鉴别不同转基因水稻的方法，该方法能够快速、无损、简便的实现不同转基因水稻的鉴别。一种鉴别不同转基因水稻的方法，包括以下步骤(I)向水稻种子样本发射波数范围为4000 lOOOOcnT1的近红外光谱，并采集所有水稻种子样本的漫反射光谱信息；(2)分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱信息进行预处理，利用主成分分析法提取预处理后特征光谱区段的光谱特征信息，选取主成分，并获取各个主成分的得分；(3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的转基因类型设定值作为输出，建立模型；(4)根据步骤(I) (2)获取待测水稻种子光谱的各个主成分得分，将其带入(3)中所述模型，获得待测水稻种子的转基因类型；水稻为转蛋白基因水稻和转调控基因水稻。
水稻转入不同基因后，会引起水稻种子内部结构和组成的变化。水稻转入蛋白基因后，会引起水稻种子主要引起蛋白质结构的变化；而转入调控基因后，根据其调控的细胞代谢网络，会导致水稻种子蛋白质和淀粉等组分结构发生变化；因此，转蛋白基因水稻种子与转调控基因水稻种子的内部结构和组成方面存在着差别。近红外光谱可记录物质中含氢基团C-H、0-H、N-H、S_H、P-H等振动的倍频和合频吸收，因而近红外光谱具有丰富的物质内部结构和组成信息。向不同转基因水稻种子发射近红外光谱后，会引起近红外吸收波长与强度的差别，但这种差别无法通过近红外光谱图进行肉眼识别，通过主成分分析减少光谱信息变量数目，建立水稻种子光谱信息与水稻转基因类型的关系模型，从而将两种转基因 水稻图像信息间的细小差异进一步突出显示，转变为可识别的信号，最终实现水稻转基因的类型的快速鉴别。步骤(I)中，所述水稻种子样本为转蛋白基因水稻种子样本和转调控基因水稻种子样本。步骤(2)中，由于通过仪器采集的原始光谱中除包含有效信息外，还包含来自各方面因素所产生的噪声信号，这些噪声信号会对光谱信息产生干扰，从而影响模型的建立和对待测水稻转基因类型的预测；为了实现光谱噪音的滤除、数据的筛选以及消除其他因素对数据信息的影响，需要对光谱进行预处理。通过比较分析，预处理方法优选为常用的标准正态变换法。选取不同波数范围的光谱数据具有不同的分类效果，确定具有较优分类效果的特征光谱区段就显得很重要(特征光谱区段的选择方法可参见邓波，沈才洪，敖宗华，卢中明.2011. “基于主成分分析与近红外光谱技术的窖泥聚类研究”酿酒科技8 :36-38.)，所述特征光谱区段的波数最小值为4000CI!!—1，最大值为8000 lOOOOcnT1，优选为波数范围为4000 lOOOOcnT1 或 4000 8000CHT1 光谱区段。主成分分析(PCA)的目的是将光谱数据降维，把原变量转换成一组彼此正交的新变量的线性组合，消除了多变量共存中相互重叠的信息，同时，新变量能最大限度地表征原变量的数据结构特征。由于主成分分析法的新变量数量少、彼此不相关，更有利于对光谱信息的分析。主成分分析方法可在Unscrambler软件(由美国CAMO制造)上实现。主成分的选取与原始信息的有效提取密切相关，在选择主成分时，取累计贡献率^ 85%，但主成分选取不宜过多，否则会引入不必要的噪声并造成过拟合；通过比较分析，主成分数优选为4 8，更优选为5。步骤(3)中，水稻种子样本对应的转基因类型为转蛋白基因和转调控基因，在模型中可设置转蛋白基因和转调控基因的设定值分别为-I和I。基于多元回归算法建立模型，所述模型优选为偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型，PLS-DA法是基于PLS回归的一种判别分析方法，在构造因素时因考虑到了辅助矩阵以代码形式提供的类成员信息，因此具有高效的鉴别能力，可提高水稻转基因类型鉴别的精确度。相对于现有技术，本发明的有益效果为(I)本发明操作简单、省时省力，仅需获取水稻种子的近红外光谱，即可进行转蛋白基因与转调控基因水稻的鉴别；(2)本发明鉴别精度高、结果可靠，可实现转蛋白基因与转调控基因水稻的快速、无损鉴别。


图I为实施例I转翻译控制肿瘤蛋白基因水稻种子和转Osmi 166水稻种子预测值和实际值回归图。
具体实施例方式实施例II、建立模型 (I)分别选取40粒转翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因水稻种子和40粒转Osmi 166基因水稻种子作为水稻种子样本，利用Nicolet Nexus870 (Thermo Corporation USA)傅里叶变换近红外光谱仪向水稻种子样本发射波数范围为4000 lOOOOcnT1光谱区段的近红外光谱，利用OMNIC 6. 0软件采集所有水稻种子样本的漫反射光谱信息；设置近红外光谱仪扫描次数32次，分辨率4CHT1。采集时室温控制在25°C左右，湿度保持稳定。以上转TCTP基因水稻和转Osmi 166基因水稻的获取方法为转基因材料分别采用水稻的成熟胚为外植体诱导、培养愈伤组织，挑选胚性愈伤组织作为转化受体，通过包含植物表达载体P1301-TCTP和pl301-mil66的根癌农杆菌EHA105转化到水稻愈伤组织中，经一系列筛选分化得到转基因水稻。(2)利用标准正态变换法分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱信息进行预处理，得到预处理后的光谱图；利用Unscrambler软件中的主成分分析法提取各个预处理后的光谱图中的光谱特征信息，选取主成分数为5，获取各个主成分的得分(如表I所示)；(3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的转基因类型设定值作为输出，建立PLS-DA模型；水稻种子样本对应的转基因类型设定值设置如下转TCTP基因设定为-1，转0smil66基因设定为I。限与篇幅，仅将其中20个水稻种子样本数据列于此，见表I。表I用于模型建立的部分数据库
no FY1 FY2 FY3 FYi FY5
~I1.62300.82000.6130-0.08500.4930I
20.87600. 7010-0.28601.66700.0733I
30. 3390-0.84900.02751.99300.0373I~0.50801.87600. 31700.47400. 1760I
5-0. 5420 0. 7380 0. 3500 0.5940 0. 3760 I
权利要求
1.一种鉴别不同转基因水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)向水稻种子样本发射波数范围为4000 lOOOOcnT1的近红外光谱，并采集所有水稻种子样本的漫反射光谱信息； (2)分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱信息进行预处理，利用主成分分析法提取预处理后特征光谱区段的光谱特征信息，选取主成分，并获取各个主成分的得分； (3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的转基因类型设定值作为输出，建立模型； (4)根据步骤(I) (2)获取待测水稻种子光谱的各个主成分得分，将其带入(3)中所述模型，获得待测水稻种子的转基因类型； 水稻为转蛋白基因水稻和转调控基因水稻。
2.如权利要求I所述的鉴别不同转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，预处理方法为标准正态变换法。
3.如权利要求I所述的鉴别不同转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述特征光谱区段是波数范围为4000 lOOOOcnT1的光谱区段。
4.如权利要求I所述的鉴别不同转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述特征光谱区段是波数范围为4000 SOOOcnT1的光谱区段。
5.如权利要求I所述的鉴别不同转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，主成分数为4 8。
6.如权利要求3或4所述的鉴别不同转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，主成分数为5。
7.如权利要求I所述的鉴别不同转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述模型为偏最小ニ乘判别分析模型。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别转基因水稻的方法，包括以下步骤(1)向水稻种子样本发射近红外光谱，并采集所有水稻种子样本的漫反射光谱信息；(2)分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱信息进行预处理，利用主成分分析法提取预处理后的特征光谱区段的光谱特征信息，选取主成分，并获取各个主成分的得分；(3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的转基因类型设定值作为输出，建立模型；(4)获取待测水稻种子光谱的各个主成分得分，将其带入(3)中所述模型，获得待测水稻种子转基因类型；水稻为转蛋白基因水稻和转调控基因水稻。本发明操作简单、鉴别精度高，可实现不同转基因水稻的快速、无损鉴别。
文档编号G01N21/35GK102768196SQ201210285629
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者丁艳菲, 张龙, 朱诚, 王珊珊 申请人:中国计量学院