专利名称：基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法及器件的制作方法
技术领域：
本发明涉及微流器件领域，特别是涉及一种基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法及器件。
背景技术：
近年来，微流器件，又称之为芯片实验室(Lab-on-a-Chip)及微全分析系统(MicroTotal Analysis Systems),由于具有样品用量少、检测速度快、实验成本低、易于自动化、检测重复率高、和数据质量好等优势，得到了各个行业的关注。
传统的液体操作所需的样品量大、步骤多且繁琐，而以介质上的电润湿(Electrowetting-on-dielectric)为基础的数字化微流器件不仅可以对液体以独立液滴为控制单位来进行操作，由此来大大增加对多个样品进行平行处理以及并行检测的能力；而且，通过对器件包含的电极的控制，还可以对极其微量的液体进行自动化操作，例如液滴的移动、合并、拆分、孵育(incubation)、混合、反应、废液收集等。由于数字化微流器件上没有(也不需要)可动部件，因而大大提高了器件及操控的稳定性和可靠性。本申请的发明人在专利号WO 2008/147568的文献中提出一种多层控制电极结构的微流器件，不仅使得通用型微流器件成为可能，而且，在制作低成本、高质量的微流器件方面，也是一个飞跃；此外，也大大简化了微流控制过程。然而，该专利文献(W02008/147568)主要涉及液滴的操作，而对液滴中所含粒子的控制却未提及，而对液体中的粒子的控制，尤其是带电粒子的控制，对于样品制备及生化分析十分重要。电泳是生化分析中的重要手段，它是指液体(或胶状物)中的带电粒子在均匀电场的作用下运动的效应。由于液体(或胶体)中悬浮体中不同成分物质的在电场作用下迁移速度的不同，电泳效应可以有效地用于包括DNA、蛋白质、细胞等在内的物质分离，它也可用于对物质分子结构的分析。例如，在正常PH值的溶液里，细胞通常带负电，因而向正电极移动；通�：煜赴趌V/cm (每厘米I伏)电场的作用下的移动速度大约为lum/sec (每秒I微米)。电泳在管道微流可以很自然地实现，专利号为WO 2007/032789的文献描述了在管道微流中利用电泳进行免疫分析的方式。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种可以实现对液体中的带电粒子进行操作和检测的方法及微流器件。为达上述目的及其他目的，本发明提供的基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法，所述方法用于具有至少两个电极的微流器件，其至少包括步骤a.在所述两个电极上分别施加电压以形成第一电压差，并在第一持续时间后，改变所述两个电极上的电压以形成第二电压差，并持续第二持续时间，使所述待测液滴中的带电粒子产生不同位移，以便粒子的分离；其中，第一电压差与第二电压差中至少一者的幅度能使待测液滴中至少部分带电粒子移动。
优选地，多次重复步骤a，则至少一种带电粒子在液滴中持续向一个电极方向移动，最终滞留在该液滴中临近该电极的位置处。优选地，所述第一电压差与第二电压差的极性相反。优选地，所述第一持续时间与第二持续时间中的一者长于另一者。本发明提供的基于电泳来操控液体中的带电粒子的微流器件，至少包括第一基底及第二基底；设置于所述第一基底的第一电极结构层及设于所述第一电极结构层表面的第二电极结构层、设置于所述第二基底的第三电极结构层，且第一基底上的电极结构层与第二基底上的电极结构层相对设置，以便两者之间具有容置液体的空间；其中，在所述第二电极结构层中，两个电泳电极的宽度范围在I微米至I毫米之 间、间距范围在10微米至20毫米之间，其他电极的宽度范围和间距范围在100微米至20毫米之间。本发明提供的基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法，其至少包括步骤在前述的微流器件的两个电泳电极上分别施加极性相反且幅度能使得带电粒子移动的电压，使待测液滴中的带电粒子向极性与自身电荷极性相反的电泳电极方向移动。由上可见，本发明提出了一种基于电泳效应来操控液滴中的带电粒子(尤其是带同种电荷的不同粒子)的方法；还提出了一种利用与专利WO 2008/147568所提出的多层控制电极的结构类似的数字化微流器件。在不受理论限制的基础上，主要利用电泳来对液体介质中的带电粒子进行操控，可以实现对液体介质中的带电粒子进行重新分布或分离。与本发明人之前的专利(W0 2008/147568, WO 2009/003184, and PCT/CN2012/070594)结合起来，本发明的数字化微流器件的功能更加完善，很多液体样品的操作都可以实现，例如液滴产生、移动、合并、混合、分离、位置及大小测量、孵化、和热处理等，而为了方便于更进一步的分析处理，液体样品中的带电粒子也可以被重新分布或分离。本发明使得使用数字化微流系统在复杂液体样品(如血液、血清、血浆、汗液、唾液、尿液等)中分离和鉴定生物标志物(如抗体或其他蛋白质、DNA或RNA等)、病毒、细菌和细胞等成为可能。
图I为本发明的基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法的流程图；图2A为本发明的基于电泳来操控液体中的带电粒子的数字化微流器件的截面示意图；图2B是图2A所示的微流器件的三维图；图2C至图2G展示了一个液滴中的两种带不同电荷的粒子在电泳效应下重新分布，以及利用电润湿效应将液滴一分为二的流程图；图3是一个在本发明的数字化微流器件上实现从全血样品中提取DNA，并在器件上对其进行实时PCR反应的流程图。其中所有的步骤，包括样品制备、样品操作(如加热、混合及移动)，以及信号测量等，全部在器件上实现。
具体实施例方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式
加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。请参阅图I至图3。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。以下先对一些术语予以说明在本发明中，术语“粒子”被用来指微米或纳米量级的实体，这些实体可以是天然的，也可以是人工制作的，例如细胞、亚细胞成分、病毒、脂质体(liposome)、纳米球、和微米球，或更小的如生物大分子、蛋白质、DNA、及RNA等实体，它也可指与悬浮介质不相融合的液珠，它还可指液体中的小气泡等。“粒子”的(线性)大小可以从几纳米到几百微米。 术语“电润湿(electrowetting)”用来指液体与固体表面接触角随所加电场而变化的效应。应当指出，当所加电压或电场为交流时，“电润湿”效应和“介电泳”效应同时存在，当电压或电场的频率增大时，“介电泳”效应的相对比重也会相应的增强。本发明中不对“电润湿”效应和“介电泳”效应进行严格区分。本发明的主要目的是实现可以对液体试剂中的带电粒子进行操作和检测的方法及器件。术语“操作(manipulation)”可以包含以下步骤的一个或多个组合I.选择(selection)-对包含多种粒子的样品中的某一种粒子进行分离(isolation)。2.重新排序(reordering)-对粒子的空间位置进行重新安排。3.合并(union)-将两个或更多粒子在空间上移到相近或相同的位置(有时某个粒子可以包含另一个粒子)。4.分离(separation)-将本来相互接触、分开一定距离、或在介质中均匀分布的粒子分离开来。5.捕获(trapping)或聚焦(focusing)-将粒子移动到一个指定的位置,并在某一段时间里将这些粒子控制在那个位置。作为本发明的另一个具体实现方式，电泳利用均匀电场对粒子产生的力，将带电粒子(一个、几个、或几组)移动到电势能最低的位置。在本发明的设计中，带正电的粒子向负电位电极移动，带负电的粒子向正电位电极移动。出于本公开的目的，术语“微流(miciOfluidic)”指的是可以对至少在一个维度(dimension)的尺度为几至几百微米的液体进行操作的器件或系统。出于本公开的目的，术语“液滴(droplet)”指的是和其他部分由空气或其他气体、其他(通常指相互不融合的)液体、或固体表面(例如数字化微流器件的内表面)等分离开来的一定量的液体(一种或几种的混合)。“液滴”的体积范围很大一般从几飞升(femtoliter,毫微微升)到几百微升(microliters)。“液滴”可以有任意的形状，如球形、半球形、扁状的圆形、不规则形等。本发明提出了对样品溶液中的待分析物进行检测的器件、方法、及系统。熟悉此领域的人都知道，非限制的样品溶液的例子有体液(包括，但不受限于，血液、血清、血浆、唾液、尿液等);试样纯化液(purified samples)(例如净化的DNA、RNA、蛋白质等);环境样品(包括，但不受限于，水、空气、与农业有关的样品等)；生物战剂样本(biological warfareagent sample)等。其中体液可以是任何生物体的体液,但本发明对哺乳动物尤其是人的体液更有兴趣。出于本公开的目的，术语“分析物(analyte)”指的是分析或测试中的待测物质或化学成分。“分析物”可以是有机或无机物质。它可以指生物分子(如蛋白质、脂质、细胞因子、激素、碳水化合物等)，病毒(如疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒、慢病毒)，完整细胞(包括原核和真核细胞)、环境污染物(包括毒素、杀虫剂等)、药物分子(如抗生素、治效药物和药物滥用、及毒品)，细胞核，孢子，等等。出于本公开的目的，术语“试剂(reagent)”指的是用于与样品材料反应、稀释样品材料、使样品材料媒合、悬浮样品材料、乳化样品材料、包封样品材料、与样品材料相互作用、或添加到样品材料中的任何材料。出于本公开的目的，术语“生物标志物(biomarker)”指的是可用于对于疾病状态、 生物体的生理状态、及机体对某种疗法的反应等进行标志的物质。非限制的，生物标志物可以是血液中(但不限于)某种蛋白质(其浓度反映生物体是否有某种疾病，及该疾病的的严重程度)，DNA序列，引入生物体的用于检查该生物体的某器官功能或某些健康指标的可跟踪测量的物质。出于本公开的目的，“扩增(amplification)”指的是可以增加待测分析物的数量或浓度的过程。非限制的例子包括聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction或PCR)及其变种(如定量竞争PCR、免疫PCR、逆转录PCR等)，链置换扩增(Strand DisplacementAmplification 或 SDA),基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Basedamplification 或 NASBA),环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification或 LAMP),解链酶扩增(Helicase-dependent amplification 或 HAD)等。出于本公开的目的，术语“层(layer)”和“膜(film)”可以互换使用用来指主体的结构，该结构通常但不必须是平面或基本上平面的，而且通常沉积、形成、涂覆或其他方式放置在另一结构上。出于本公开的目的，“电极选择单元(electronic selector)”指的是能够设置输出电信号或将其改变到不同电压(或电流)水平的任何电子器件，具有或不具有中间电子器件均可。作为非限制性示例，微处理器与某些驱动器芯片一起可以用来在不同时间将不同的电极设置于不同的电势。出于本公开的目的，术语“接地(ground)”(如用于“接地电极”或“接地电压”)指的是相应的电极的电压是零或足够接近于零。所有其他电压值，尽管幅度通常小于300伏，应当足够高，以使得能够充分观察到电泳、介电泳、及电润湿效应。应当指出，当布置覆盖的电介质层时，同一层中相邻电极之间的空间通常填充有该介电材料。这些空间也可以空着，或填充有诸如空气、氮气、氦气和氩气等气体。同一层中的所有电极和不同层处的电极优选的进行电隔离。出于本公开的目的，术语“连通(communicate)”(例如，第一组件与第二组件“连通”或第一组件“连通至”第二组件)是指在两个或更多组件或元件之间的结构、功能、机械、电、光、或流体关系或其任意组合。如此，一个组件被说成与第二组件连通的事实并不意图排除在第一或第二组件之间存在额外的组件和/或额外的组件可操作地关联或接合于第一或第二组件的可能性。出于本公开的目的，可以理解，当任何形式(如液滴或连续体，可能是在运动或静止的)的液体被描述为在电极、阵列、矩阵或表面“上”、“处”或“之上”时，该液体可能与电极/阵列/矩阵/表面直接接触，或可能与插入液体和电极/阵列/矩阵/表面之间的一个或多个层或膜相接触。出于本公开的目的，可以理解，当诸如层、区域或基底的给定组件被称为置于或形成在另一组件“上”、“中”、或“处”时，该给定组件可以直接位于该另一组件上，或备选地，也可以存在中间组件(例如，一个或更多个缓冲层、夹层、电极或接触)。还可用理解，术语“置于...上”和“形成在...上”可以互换使用用来描述给定组件如何相对于另一组件进行定位或安置。因此，术语“置于...上”和“形成在...上”并不意在对材料传输、沉积或制造的特定方法引入任何限制。
出于本公开的目的，术语“探测(detection)”和“测量(measurement)”可以互换使用用来获取物理量(例如，位置、带电量、温度、浓度、PH值、亮度、荧光等)的过程。在通常情况下，至少一个传感器(或探测器)会被用来获取物理量并将其转换成人或仪器可以识别的信号或信息。待测物体和传感器之间可以有其他元器件，比如光学测量中使用的透镜、反光镜、滤光片等，和电学测量中的电阻、电容、三极管等。而且，为了使得测量成为可能或容易些，测量中常会用到其他的辅助装置或器件。例如，诸如激光或激光二极管等光源被用来将粒子从电子基态激发到电子激发态，激发态粒子回到基态时有时会发射的荧光，而测量这里的荧光强度就可以用来测量液体样品中某种粒子的浓度。传感器在光学方面有CCD，光电二极管、光电倍增管等，在电学方面有运算放大器、模数转换器、热电偶、热敏电阻等。测量可以对多个样品的多个参量同时或按一定的顺序进行。例如，在用光电二极管测量液滴中某种粒子荧光的同时，其液滴的位置也可以由电容测量来同时获得。传感器或探测器通常会跟电脑(computer)连接起来，电脑上通常装有相应的软件对所测量的信号进行分析，并通常将其转化成人或其他仪器可以读懂的信息。例如，利用对液体中某粒子荧光强度的测量和分析可以用来推断该粒子的浓度。出于本公开的目的，术语“延长电极”的长度至少是其宽度的3倍；优选地，长度至少是其宽度的5倍；更为优选地，长度至少是其宽度的10倍。作为非限制性示例，光学测量包括激光诱导的荧光测量(laser inducedfluorescence measurement)、红夕卜光谱(infrared spectroscopy)、拉曼光谱(Ramanspectroscopy)、化学发光测量(chemiluminescence measurement)> 表面等离子共振测量(surface plasmon resonance measurement)、吸收光谱(absorption spectroscopy)等；电学测量包括电流分析法(amperometry )、伏安测量法(voItammetry )、光电化学测量法(photoelectrochemistry)、库仑分析法(coulometry)、电容测量法(capacitancemeasurement)、以及交流阻抗测量法(and AC impedance measurement)等。下面是对本发明的操控方法及微流器件的具体描述，为了方便于说明，相应的附图(图I至图3)会在需要的时候提到。应该说明的是，这些例子的目的是为了帮助说明，而不是为了限制发明的意愿和精神。请参阅图I，其为本发明的基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法的流程图。其中，本发明所述的方法可用于包含至少两个电极的微流器件。优选地，该两个电极的宽度范围在I微米至I毫米之间、间距范围在10微米至20毫米之间。在步骤SlOl中，在所述两个电极上分别施加电压以形成第一电压差，并在第一持续时间后，改变所述两个电极上的电压以形成第二电压差，并持续第二持续时间，使待测液滴中的带电粒子产生不同位移，以便粒子的分离；其中，第一电压差与第二电压差中至少一者的幅度能使待测液滴中至少部分带电粒子移动。其中，待测液滴可能包含的粒子的种类可包括以下几种情形
第一种情形待测液滴可能包含两种粒子，其中一种粒子带正电荷、另一种粒子带负电荷；第二种情形待测液滴可能包含两种或两种以上的粒子，且每一种粒子所带电荷的类型均相同，例如，均带正电荷或均带负电荷；第三种情形待测液滴可能包含三种或三种以上的粒子，且至少有一种粒子带正电荷、一种粒子带负电荷、剩余种类的粒子或带正电荷或带负电荷。当待测液滴可能包含的粒子为第一种情形时，若第一电压差与第二电压差的极性相同，例如，均为正值或均为负值，则待测液滴中带正电荷的粒子的位移方向与两电极间的电场方向相同而带负电荷的粒子的位移方向与电场方向相反，故待测液滴中的粒子产生不同方向的位移；若第一电压差与第二电压差大小相同但极性相反，则第一持续时间与第二持续时间中的长者所对应的两电极间的电场方向决定了待测液滴中的粒子的位移方向，例如，若第一持续时间长于第二持续时间，贝1J第一持续时间所对应的两电极的电场方向为带正电荷粒子的位移方向、该电场的反方向为带负电荷粒子的位移方向，故待测液滴中的粒子也产生不同方向的位移。当待测液滴可能包含的粒子为第三种情形时，可先按照前述第一种情形所述的方式在两电极上施加相应电压使带正电荷的粒子移动并滞留在待测液滴中临近一个电极的位置处、带负电荷的粒子移动并滞留在待测液滴中临近另一个电极的位置处；随后再在两电极上施加相应电压使待测液滴基于电湿润效应分离为两个子液滴，则子液滴中若包含多种粒子，则该多种粒子所带电荷的类型均相同，即属于前述第二种情形。以下将对待测液滴可能包含的粒子为第二种情形进行详细说明当待测液滴中包含带同种电荷的不同粒子时，在第一持续时间及第二持续时间后，待测液滴中的各带同种电荷的不同粒子总的位移方向基于第一持续时间、第二持续时间、第一电压差及第二电压差来确定。例如，当待测液滴Dl中可能含有均带正电荷的粒子all和粒子bll,在第一持续时间til内在电极Ell、E12上分别施加电压以形成第一电压差U11，在第二持续时间tl2内改变电极Ell、E12上电压以形成第二电压差U12，其中，第一电压差Ull与第二电压差U12均能使带电粒子移动，且两者大小相同而极性相反，第一持续时间til小于第二持续时间tl2，则经过第一持续时间til与第二持续时间tl2后，带正电荷的粒子all、bll各自总的位移方向均为朝向在第二持续时间tl2内电压极性与带正电荷的粒子all、bll的极性相反的电极方向，而由于粒子al I、bl I各自的质荷比不同，故粒子al I、bl I中质荷比小者的位移大于质荷比大者的位移。
由此，基于上述说明，本领域技术人员应该理解，选择合适的第一持续时间长度、第二持续时间长度、第一电压差以及第二电压差，则在第二持续时间后，待测液滴中至少一种粒子的位移应大于(优选是远大于)待测液滴中其他与该种粒子所带电荷类型相同的粒子的位移；更为优选地，在该第二持续时间后，待测液滴中至少一种粒子具有明显位移，而待测液滴中其他种粒子基本保持在原地，或位移可以忽略不计。其中，两电极上所施加的电压的频率通常低于10000赫兹，优选地，频率小于100赫兹；更为优选地，频率小于I赫兹。基于上述说明，若多次重复步骤S101，则待测液滴中至少一种带电粒子在每一次步骤SlOl执行之后均朝向一个电极方向移动，最终会滞留在该待测液滴中临近该电极的位置处，由此可改变液滴中的粒子的分布，方便对粒子进行后续处理或测量等。例如，继前述待测液滴D1，在每一次步骤SlOl执行之后，粒子all、bll中质荷比小者均具有较大朝向电极Ell方向、而粒子all、bll中质荷比大者则基本保持在原地或位 移可以忽略不计，则步骤SlOl多次执行之后，粒子all、bll中质荷比小者移动并滞留在待测液滴Dl中临近电极Ell的位置处，则该待测液滴Dl中，临近电极Ell的位置处的质荷比小的粒子的浓度会显著增加。随后，若在电极Ell、E12上施加电压，使得待测液滴Dl基于电湿润效应而分离为两个子液滴，则质荷比小的粒子集中在临近电极Ell的子液滴中。优选地，若在步骤SlOl执行之前，先在一电极上施加正电压、在另一电极上施加负电压，使待测液滴中的带电粒子移动并最终滞留在液滴中临近电压极性与自身所带电荷极性相反的电极的位置处；随后，再开始步骤SlOl的操作，使待测液滴中的至少一种粒子远离自身所滞留处，而朝向液滴中临近另一电极的位置处移动并最终滞留在该位置处。例如，继前述待测液滴D1，若在步骤SlOl执行之前，先在电极Ell上施加正电压、在电极E12上施加负电压，则待测液滴Dl中的带正电荷的粒子al I、bl I均向液滴Dl中临近电极E12的位置处移动并最终滞留在该位置处；随后再进行步骤SlOl的操作，则粒子all、bll中质荷比小的粒子移动并最终滞留在待测液滴Dl中临近电极Ell的位置处、而质荷比大的粒子仍滞留在待测液滴Dl中临近电极E12的位置处，由此可实现同一液滴中同种电荷的粒子的分离。随后再在电极E11、E12上施加电压，使得待测液滴Dl基于电湿润效应而分离为两个子液滴，以便分别对粒子all与bll进行检测等。此外，通过在微流器件所包含的电极上施加电压来移动待测液滴至所期望的位置处(例如，液体出口处、与进行前述步骤SlOl操作的一个电极交叠的位置处等)、在两个电极上施加同相位电压使待测液滴基于电湿润效应而改变形状等，均已为本领域技术人员知悉，故在此不再详述。图2A是本发明的基于电泳来操控液体中的带电粒子的数字化微流器件的截面示意图。在这个实施例中，液滴D被夹在下层板202和上层板204当中。本上下文中使用的术语“上”和“下”仅用于区分下层板202和上层板204，而不作为下层板202和上层板204相对于地平面的方向的限制。下层板202上设置有第一电极结构层及第二电极结构层，上层板204上设置有第三电极结构层。其中，设置在第一基底201上的第一电极结构层包括电极El及介电层203B ;设置在第一电极结构层表面的第二电极结构层包括两个长条形电泳电极E2E_1、E2E_2、电极E2、以及介电层203B。设置在第二基底205上的第三电极结构层包括电极L及介电层207。
优选地，下层板202和上层板204之间的间隔小于I毫米；更为优选地，小于O. 3毫米。其中，电泳电极E2E_1、E2E_2的宽度范围在I微米至I毫米之间，两者之间间距范围在10微米至20毫米之间，各电极E2的宽度范围和相邻电极间的间距范围在100微米至20毫米之间；优选地，电泳电极E2E_1、E2E_2的宽度范围在5微米至500微米之间、间距范围在100微米至5毫米之间，各电极E2的宽度范围和相邻电极间距范围在200微米至2毫米之间。其中，第一电极结构层中的各电极El的宽度范围和相邻电极间的间距范围在I微米至10毫米之间。优选地，各电极E1、E2、E2E_1和E2E_2均采用延长电极。其中，电极E2E_1和E2E_2可以用来(在它们之间)产生电场而对对液滴中的悬浮 带电粒子进行操作。当然，控制电极El及E2的主要用途是用来产生电润湿效应以对在液滴中的带电粒子进行控制。应当理解，在构建受益于本发明的器件时，控制电极E1、E2、E2E_1、或E2E_2通常是一起形成二维电极阵列或网格的大量控制电极的一部分。优选地，控制电极E2E_1和E2E_2至少部分表面未被介电层203C覆盖，由此可与液滴直接接触，如图2A所示。图2B是图2A所示的微流器件的上层板204中的电极L和嵌入在下层板202中的控制电极的一个三维图。图2C是一个显示嵌入在下层板202的控制电极的俯视图。除了放置电极的区域不可以导电以外，用于制作第一基底或第二基底的材料并不重要。材料应当有一定的硬度，以便基底的基本形状及两者间的间距可以基本保持不变。第一基底或第二基底可以由(但不局限于)石英、玻璃、或聚合物(如聚碳酸酯(polycarbonate)或环烯共聚物(cyclic olefin copolymer)等制作而成。控制电极El及E2的数量在I至10000之间，但是优选的是从2到1000个，更优选的是从2到200个。上层板204中的电极L的数量在I至10000之间，优选地，在2至1000之间，更为优选地，在2至200之间，相邻电极L的间距范围在0. I微米至20毫米之间，优选地，在I微米至2毫米之间。控制电极El、E2、E2E_1、及E2E_2可以通过传统的导电引线和直流或交流电源连接。每个电源可以独立控制，也可以利用转换开关而用一个电源来控制多个电极。典型的电压幅度通常小于300伏。用于产生电润湿效应的交流电压的频率通常小于I万赫兹。当希望产生电泳效应时，电极E2E_1、及E2E_2可以通过传统的导电引线和直流或交流电源连接，交流电的频率通常低于10000赫兹，但是优选的是小于100赫兹，更优选的是小于I赫兹。制作电极的可以是任何的导电材料，例如铜、铬、铟锑氧化物(ITO)等。为了画图和显示方便，图2A至图2C中的电极形状被画成长方形，不过，它们可以是很多其他任何形状。事实上，各电极的形状、宽度、及间距可以基于器件上的不同位置而不同，从而可以在器件上不同的位置对不同大小及形状的粒子更有效的进行操作。用于制作介电层203B、203C、及207的材料包括但不限于铁氟龙(Teflon)、Cytop,聚氯代对二甲苯(Parylene C)、氮化娃、氧化娃等。介电层203B及207优选地为疏水性，这可以通过在介电层203C及207上涂一层铁氟龙、Cytop、或其他疏水物质来实现。
控制电极E1、E2、E2E_1、及E2E_2嵌入或形成在第一基底201上。介电层203A涂覆在各电极El上，以将各电极El电隔离，同时也将各电极El (属于第一电极结构层)与各电极E2、E2E_1、及E2E_2 (属于第二电极结构层)电隔离。另一介电层203C覆盖至少部分控制电极E2，也可由此将电极E2、E2E_1、及E2E_2电隔离。上层板204中包括嵌入在第二基底205中或形成在其上的控制电极L。优选地，疏水绝缘薄层207覆盖各电极L，并由此将各电极L电隔离。标准的IC或IXD生产工艺可以用于制作与生物分析相容的数字化微流器件。例如，用于制作薄层的技术有(但不局限于)淀积(deposition)，例如等离子体增强化学气相沉积法(PECVD)、#i射(sputtering)、或旋涂(spinning coating)等；用于去除薄层的技术有(但不局限于)蚀刻(etching),如湿法腐蚀(wet etching)、等离子蚀刻(plasmaetching)等；薄膜布图布线技术(patterning technique)有(但不局限于)紫外光刻(UVlithography)、电子束光刻(electron beam lithography)等。上述所示的微流器件作为一种数字化微流器件，其还可以包括其他微流体组件和/或微电子组件。例如，器件还可以包括电阻式加热(resistive heating)区域、微通道 (microchannels)、微泵(micropumps)、压力传感器(pressure sensors)、光波导(opticalwaveguides)、和/或与金属氧化物半导体(Metal Oxide Semiconductor,或M0S)电路连接的生物传感(biosensing)或化学传感(chemosensing)元件。作为一种优�。痉⒚鞯奈⒘髌骷拱ǖ缂≡竦ピ�。该电极选择单元分别与处于第一基底的第一电极结构层、第二电极结构层及第二基底的第三电极结构层中的可选址电极相连接，用于由可选址电极中选择待施加电压的电极，来施加相应电压。作为又一种优�。痉⒚鞯钠骷箍砂ㄖ辽僖桓鑫露瓤刂圃钥刂谱陨聿糠智虻奈露鹊取Ｎ露瓤刂圃绨氲继逯评淦�(Peltier)，可以设置在器件所属的集成芯片外，其与微流器件I00所属芯片的至少一个区域接触；或集成在器件所属的集成芯片上，如直接制作在器件外表面上的薄膜电阻加热器；此外，器件也可既包括设置在自身所属的集成芯片外的温度控制元件，还可包括集成在自身所属的集成芯片上的温度控制元件。所述温度控制元件可以将其接触的区域的温度稳定的控制在O摄氏度到大约100摄氏度。此外，本发明的微流器件还包括与容置液体的空间连通的液体入口、液体出口等。图2D显示了通过对电极E2E_1加正电Vl，对电极E2E_2加负电V2，液滴D中的带电粒子被重新分布，即带正电的粒子在电极E2E_2附近，带负电的粒子在电极E2E_1附近。其中，电压VI、V2的幅度应足够大以使带电粒子移动。图2E和图2F显示了在带电粒子被重新分布后，再在电极E2_l和E2_2加合适的电压(例如，分别为V3和V4)，则液滴D基于电润湿效应被分成了两个较小的子液滴。图2G显示了两个子液滴在电极E2_l和E2_2上的电压取消后，变成了自然的扁圆形。由此可见，基于本发明的微流器件的两电泳电极，可操控液滴中带电粒子，尤其可使带正电荷的粒子与带负电荷的粒子分离。此外，基于上述微流器件的两电泳电极来进行前述步骤SlOl的操作，则还可实现液滴中带同种电荷的不同粒子的分离。由于其高亲和性和特异性，免疫分析是用于定量检测的灵敏且常用手段，其分析物多种多样，如病毒、肽(peptides)、多核苷酸(polynucleotides)、蛋白质(如抗体、毒素、细胞因子等)及其他小分子。在临床实验室里，免疫分析仍被用来检测心脏病标志物、月中瘤标志物、激素、药物、传染源(infectious agent)、及免疫反应(immune response)等；而且新的检测物也不断的被加进来。在不同的免疫分析格式中，非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)具有更高的灵敏度，因而也是最常用的。异相免疫分析有三个典型的步骤第一，捕获-产生有标记的抗原抗体复合物的反应；第二，分离-将结合的抗原抗体复合物和游离抗原分开的过程；第三，检测-测量从结合的抗原抗体复合物发出的信号。在常见的异相免疫分析中，抗原抗体复合物通常会被固定在固体的表面(酶标板或微磁珠)，然后未结合分子被冲洗掉。利用本发明，参与结合和未结合分子可以用电泳在数字化微流器件上实现，这样就不需要使用固体表面来固定待分析物。这可以降低整个系统的复杂程度和实验花费。利用本发明的数字化微流器件可以实现对液体中带电粒子的操作，通过对器件中电极的控制，所需要的粒子分离就可以实现，因此就不需要用诸如多孔板(well-plates)或 微珠(microbeads)等来固定抗原抗体复合物了。这带来的好处很大包括可靠的测量、更经济的检测、易使用的系统等等。至今，微流器件上所分析的样品在放入器件之前都需要预处理，即样品制备(sample preparation).对于大多数的分析手段来说，样品制备都是重要的一个环节，因为该分析手段可能对于原位状态的待分析物不敏感，也可能分析结果易受其他与待分析物并存的其他物质的干扰。传统意义上的样品制备通常是指在分析前对待分析物进行浓缩、溶剂交换(the exchange of solvent)、去除干扰物质等。在生化分析中，样品制备通常是一个耗时耗力并需要很多步骤的过程，例如从原始样品(如全血、唾液、尿液、汗液、脑脊液、粪便等)收集所需要的DNA、RNA、或蛋白质等。总体说来，样品制备可以分为两大步第一，细胞或组织裂解(cell or tissuelysis)-裂解细胞但不使其中的敏感大分子变形或降解(denature or degrade),如DNA或蛋白质；第二，提取或分离(extraction or separation)-将待测物从裂解后的细胞里提取。在微流系统中，细胞分解方法有以下几大类a.机械法-利用对细胞直接接触的机械力来挤碎细胞。b.加热法-利用高温来破坏细胞膜。c.化学法-利用化学缓冲剂或酶来打开细胞。d.电学法-利用低强度电场在细胞膜产生多孔，或利用较强电场分解细胞。在不受理论的约束下，利用本发明，细胞裂解可以在数字化微流器件上利用加热法、化学法、电学法等较容易的实现。而利用电泳，提取或分离也可以在器件上实现。就是说，本发明使得数字化微流器件成为一种真正意义上的集成器件-可以进行样品制备、检测、和分析。图3是一个利用本发明的数字化微流器件来从全血(whole blood)中提取DNA样品并对其进行检测分析的例子。在第S301步骤，在数字化微流器件上放入病人的血液样品和用来对特定DNA进行实时PCR测量的试剂(如DNA引物、DNA聚合酶、dNTP等)。在第S302步骤，在器件相应电极上施加电压使血液样品基于电湿润分离出一个或多个样品液滴，并通过在相应电极上施加电压来移动样品液滴至器件上可以加热的位置。在第S303步骤，在器件上通过温度控制元件将样品液滴的温度升至100摄氏度并在此温度保持一小段时间(比如30秒)，以实现对样品中细胞的热分解。在第S304步骤，通过在相应电极上施加电压来将样品液滴移至与电泳电极E21或E22对应的位置处，并通过在电泳电极E21或E22施加电压对对样品液滴进行电泳操作，以将待测的DNA分离出来。在第S305步骤，通过在在相应电极上施加电压来产生电湿润效应将样品液滴一分为二，使得待测的DNA主要在其中的一个液滴中(DNA液滴)。在第S306步骤，在器件相应电极上施加电压使试剂基于电湿润产生一个或多个试剂液滴，并通过在相应电极上施加电压来移动试剂液滴，使试剂液滴与DNA液滴合并。在第S307步骤，在器件上对合并混合后的液滴进行实时PCR测量。在第S308步骤，将测量后的液滴移至器件中的废液收集处。图3显示的只是许许多多个只要在本发明中数字化微流器件上放入未处理样品和相应的试剂就可以进行检测分析的例子之一。这里的数字化微流器件具有各种各样的功能，例如从未处理样品中提取待测物质、对待分析物进行测量、以及实 验分析等。非限制的例子包括对全血进行血液化学检验(blood chemistry),如血气(blood gases)、葡萄糖(glucose)、电解质类(electrolytes)、尿素(urea)等；对尿液中阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)的测量来诊断膀胱癌；对汗液中电解质(sweat electrolytes)的测量仪诊断囊肿性纤维化(cystic fibrosis)、对唾液中相应的白细胞间介素(interleukin) IL-IB和IL-8等的测量来判断口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma)等。可以看出，本发明提出了在生化分析和即时检验(point-of-care testing)等很多领域都非常有用方法，包括样品制备的自动化(例如细胞分离、细胞溶解(cell lysis)、分子提取和纯化、浓缩、与试剂的混合、或者扩增等)、测量和分析。从上面的一些例子可以看出其中的一些优势。除了继承了数字化微流的一些优势以外，本发明引入了更多的优势，例如a.有主要用于电泳的电泳电极及配合电泳电极进行电湿润操作的电极，方便使用者的使用。b.器件功能更加完整，尤其是样品制备也可以在器件上完成，而不需要在放入器件前用其他方法进行。因此，可用原材料直接进行测量。c.因为悬浮在液体中的带电粒子可以在液滴内被重新分布或浓缩，测量的灵敏度可以因此而相应的提高。d.由于通过对器件上的电极控制就可以对液滴里的带电粒子进行分离，通常用于粒子分离的磁珠及外界磁铁装置也就不需要了。这可以简化器件的使用、降低器件的使用成本。e.在器件上对液滴里的带电粒子进行重新分布或分离的功能使得检测的灵活性和多重性(multiplicity)得到提高。f.生化分析的很多步骤都可以在器件上集成化和自动化，例如取样、样品制备、液体移动、混合、稀释、浓缩、分离、孵育、反应、测量、废液收集等。g.可以对多个待分析物同时进行检测。h.可以同时进行不同类别的分析检测。i.利用器件上的电泳过程，样品和试剂之间的混合过程可以加快。j.实验定标和检测分析可以同时进行。用于定标的液滴和检测的液滴可以同时产生和运作，而实验定标的过程不需要先将实验先停下。这里应当指出，为了降低焦耳热(Joule heating)的副作用，可以对本发明的数字化微流器件(整个或局部)可以进行温度控制。尽管这里没有详细描述，应当指出，在使用电泳效应时，电极上所加电压的幅度也是可以调节的，这也是为了更有效地进行粒子操作而经常使用的。以上可见,本发明提供了一个真正意义上即时检验(point-of-care testing)的方法及器件，尤其能有效分离液滴中带同种电荷的不同粒子。基于本发明，细胞溶解(celllysis)及分析物的提取/分离都是器件功能的一部分。本发明的数字化微流器件具有颇为完整的功能，包括样品制备、测量、分析、和诊断等。通过和互联网及云计算结合，本发明可以为医疗系统(healthcare system)提供一个好的基础,包括病情诊断、网上医疗知识支持、远程医生病人互动等。这里应当指出，上述示例和上述提及的优势不是穷举性的。本发明的灵活性本质 可以用于很多应用，并且与诸如基于单层电极的数字化微流或基于管道的微流的其他技术相比，的确有很多优势。在本申请中提及的所有书面专利和出版物通过应用而在此并入全部内容。尽管说明并描述了本发明的优越实施方式，但是应当理解，在不脱离本发明精神和范围的前提下，可以对本发明做出很多改变。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
权利要求
1.一种基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法，用于具有至少两个电极的微流器件，其特征在于所述方法至少包括步骤 a.在所述两个电极上分别施加电压以形成第一电压差，并在第一持续时间后，改变所述两个电极上的电压以形成第二电压差，并持续第二持续时间，使所述待测液滴中带电粒子产生不同位移，以便粒子的分离； 其中，第一电压差与第二电压差中至少一者的幅度能使待测液滴中至少部分带电粒子移动。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于多次重复步骤a，使部分带电粒子在液滴中持续向一个电极方向移动，最终滞留在该液滴中临近该电极的位置处。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述第一电压差与第二电压差的极性相反。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述第一持续时间与第二持续时间中的一者长于另一者。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于在步骤a之前还包括步骤 在两电极上分别施加极性相反的电压，使待测液滴中的带电粒子均向电压极性与自身所带电荷极性相反的电极移动，并最终滞留在该待测液滴中临近该个电极的位置处。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于还包括步骤在所述微流器件所包含的相应电极上施加直流或低频交流电压，以便待测液滴基于电湿润效应分离为至少两个子液滴。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，在步骤a之前还包括步骤在所述微流器件包含的相应电极上施加直流或低频电压，使待测液滴被驱动至与所期望的电极对应的位置处。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤a中施加在两电极上的电压的频率低于10000赫兹。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述频率小于100赫兹。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述频率小于I赫兹。
11.一个基于电泳来操控液体中的带电粒子的微流器件，其特征在于至少包括 第一基底及第二基底； 设置于所述第一基底的第一电极结构层及设于所述第一电极结构层表面的第二电极结构层、设置于所述第二基底的第三电极结构层，且第一基底上的电极结构层与第二基底上的电极结构层相对设置，以便两者之间具有容置液体的空间； 其中，在所述第二电极结构层中，两个电泳电极的宽度范围在I微米至I毫米之间、间距范围在10微米至20毫米之间，其他电极的宽度范围和间距范围在100微米至20毫米之间。
12.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于电泳电极的宽度范围在5微米至500微米之间、间距范围在100微米至5毫米之间，所述第二电极结构层中的其他电极的宽度范围和间距范围在200微米至2毫米之间。
13.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于每一电泳电极的至少部分表面处于裸露状态以便能与液滴接触。
14.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于所述第一电极结构层中的各电极的宽度范围和间距范围在I微米至10毫米之间。
15.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于所述第一电极结构层及第二电极结构层所包含的电极包括延长电极。
16.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于还包括电极选择单元，分别与处于所述第一基底及第二基底的各电极结构层中的可选址电极相连接，用于由可选址电极中选择待施加电压的电极，来施加相应电压。
17.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于还包括与容置液体的空间连通的液体入口。
18.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于还包括与容置液体的空间连通的液体出口。
19.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于还包括至少一个温度控制元件以控制器件至少部分区域的温度。
20.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于在所述第一基底及第二基底上，处于表面的电极结构层所包含的介电层中至少部分区域具有疏水性。
21.根据权利要求11所述的微流器件，其特征在于第一基底上处于表面的电极结构层的表面与第二基底上处于表面的电极结构层的表面之间的间距小于I毫米。
22.根据权利要求21所述的微流器件，其特征在于第一基底上处于表面的电极结构层的表面与第二基底上处于表面的电极结构层的表面之间的间距小于O. 3毫米。
23.一种基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法，其特征在于至少包括步骤 a、在权利要求11至22任一项所述的微流器件的两个电泳电极上分别施加极性相反且幅度能使得带电粒子移动的电压，使待测液滴中的带电粒子向极性与自身电荷极性相反的电泳电极方向移动。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，当带电粒子已滞留在液滴中临近与自身所带电荷极性相反的电泳电极的位置处时，所述方法还包括步骤 在两电泳电极上施加直流或低频交流电压，使待测液滴基于电湿润效应分离为两个子液滴。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述待测液滴包括只带一种电荷的粒子或既包括带正电荷的粒子又包括带负电荷的粒子。
全文摘要
本发明提供一种基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法及器件。根据本发明的方法，在微流器件的两个电极上分别施加电压以形成第一电压差，并在第一持续时间后，改变所述两个电极上的电压以形成第二电压差，并持续第二持续时间，使待测液滴中的带电粒子产生不同位移，以便粒子的分离；其中，第一电压差与第二电压差中至少一者的幅度能使待测液滴中至少部分带电粒子移动。本发明利用电润湿(electrowetting)、及电泳(electrophoresis)等效应，可实现对液滴的操作以及对悬浮于液滴中的带电粒子，尤其是带同种电荷的不同粒子，进行控制。
文档编号G01N27/447GK102879453SQ201210324609
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者吴传勇 申请人:吴传勇, 上�：庑旧锟萍加邢薰�
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