专利名称：光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序的制作方法
技术领域：
本发明涉及对来自分散或溶解于溶液中的原子、分子或团聚体(在下文中，这些均称作“粒 子”)的光进行检测以用于分析溶液中的粒子的状态的光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序，更具体地，本发明涉及如下的光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序其能够通过使用诸如共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统等能对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统来获取对分析例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或其团聚体等生物分子以及例如病毒、细胞或非生物粒子等粒状物等等各种粒子的状态(相互作用、结合或离解状态，等等)有用的信息。
背景技术：
根据近年来光学测量技术的发展，通过使用共聚焦显微镜的光学系统和能够对光子计数(单光子检测)的超高灵敏度光检测技术，使得单光子或单荧光分子水平的微弱光的检测和/或测量成为可能。因此，提出了借助于这种微弱光检测技术对生物分子等的分子间相互作用、结合或离解反应进行检测的各种装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy :FCS,参见例如专利文献I和2以及非专利文献1-3)中，借助于激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，对样品溶液中的微小区域(显微镜的激光会聚的聚焦区域，称作“共聚焦体积”)内进出的荧光分子或荧光标记分子(荧光分子等)的荧光强度进行测量，并且基于由测得的荧光强度的自相关函数值所确定的荧光分子等在微小区域中的平均驻留时间(平移扩散时间)和驻留分子数的平均值，实现了诸如荧光分子等的运动速度、尺寸或浓度等信息的获取和/或诸如分子的结构或大小的变化、分子的结合或离解反应或者分散和团聚等各种现象的检测。此外，在荧光强度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis :FIDA,例如专利文献3)或者光子计数统计分析(Photon Counting Histogram :PCH,例如专利文献4)中，生成了通过与FCS类似的方式测得的进出共聚焦体积的荧光分子等的荧光强度的直方图，并且通过将统计模型公式与直方图的分布拟合来计算荧光分子等的特征亮度的平均值以及共聚焦体积内驻留的分子的平均数，从而，将基于这些信息估算分子的结构或尺寸变化、结合或离解状态或者分散和团聚状态。此外，在专利文献5和6中，提出了基于使用共聚焦显微镜的光学系统测得的样品溶液中荧光信号的时间演进来检测荧光物质的方法。专利文献7提出了一种信号计算处理技术，其利用光子计数技术测量来自流过流式细胞仪的荧光微粒或者来自固定在基板上的荧光微粒的微弱光，以检测荧光微粒是否存在于流体中或者基板上。特别地，根据诸如FCS和FIDA等采用了使用共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术来对微小区域进行荧光测量的技术的方法，与现有技术相比，测量所需的样品量可以极少(一次测量所使用的量最多几十μ L)且浓度极低，并且测量时间也大幅缩短(在一次测量中，反复进行若干次时间为秒量级的测量)。因此，特别是在对医学或生物学研究和开发领域中常用的稀有或昂贵的样品进行分析时，或者在诸如疾病临床诊断或生物活性物质的筛选等对大量的样本进行试验时，期望这些技术与传统的生化方法相比是使得能够以低成本和/或快速地进行实验或试验的强力的手段。现有技术文献专利文献专利文献I :日 本特开2005-098876专利文献2 :日本特开2008-292371专利文献3 日本特许第4023523号专利文献4 :国际公开2008-080417专利文献5 :日本特开2007-20565专利文献6 :日本特开2008-116440专利文献7 :日本特开平4-337446号公报非专利文献非专利文献I :金城政孝，“蛋白质，核酸,酵素”，Vol. 44，No. 9,1431 — 1438页，1999 年。非专利文献2 F. J.梅耶-阿姆兹(F. J. Meyer-Alms),荧光相关光谱学(Fluorescence Correlation Spectroscopy), R.里格尔(R. Rigler)编，施普林格(Springer)，柏林，2000 年,204 — 224 页。非专利文献3 :加藤则子外4名，遗传子医学，Vol. 6，No. 2，271 — 277页。
发明内容
发明要解决的问题在诸如FCS、FIDA和PCH等上述光学分析技术中，简要地说，通过统计处理算出测得的荧光强度的时间波动的大�。缓蠡诓ǘ拇笮∪范ㄔ谘啡芤褐械奈⑿∏蚰诮龅挠夥肿拥鹊母髦痔匦�。因此，为了在上述光学分析技术中获得显著的结果，优选的是，以如下方式准备被用作样品溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度使得在平衡状态下，在秒量级长度的一次测量时间内，有使得统计处理能够进行的数量的荧光分子等将进出微小区域，优选地，使得在微小区域中将总是存在大约一个荧光分子等(典型地，由于共聚焦体积的体积为大约lfL，所以优选的是荧光分子等的浓度为大约InM以上)。换言之，当样品溶液中被观测粒子的浓度或数密度远远低于使得统计处理能够进行的水平(例如，远远低于InM)时，会出现在测量时间内很少有被观测对象进入到微小区域内的状态，因此，荧光强度的测量结果会包括很长一段时间的在微小区域内完全不存在被观测对象的状态，并且显著的荧光强度的观测量也会减�。虼耍荒芄黄谕谌缟纤龌谟馇慷鹊耐臣撇ǘ墓庋Х治黾际踔杏邢灾幕蚓返姆治鼋峁�。在专利文献5和6中描述的使用共聚焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，在未对荧光强度波动如上所述地进行统计处理的情况下，能够根据遍及数秒的测量时间内是否产生具有显著强度的荧光信号来确定样品中是否存在被观测荧光分子等，并且公开了，已经获得具有显著强度的荧光信号的频率与样品中荧光分子等的数量之间的相关性。特别地，在专利文献6中启示，搅动样品溶液的内部的随机流动的发生改善检测敏感度。然而，即使在那些方法中，也仅仅检测到是否存在由于扩散或随机流动而随机地进出微小区域的荧光分子等，而不能掌握微小区域内的荧光分子等的粒子的行为，所以，例如没有实现粒子的计数或者粒子的浓度或数密度的定量计算。此外，专利文献7中描述的技术在于检测流式细胞仪中的流体内是否存在单个荧光微粒或者检测是否存在固定于基板上的单个荧光微粒，而不是用于对在样品溶液中在通常状态下被溶解或分散的诸如分子和胶体等粒子、即在样品溶液中随机移动的粒子进行检测的技术，因此，没有实现定量地算出样品溶液内溶解或分散的粒子的浓度或数密度。此外，由于专利文献7的技术包括诸如流式细胞仪中的测量或将荧光粒子固定于基板的处理等过程，所以与诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术的情况相比，大大地增加了试验所需的样品量，并且对于进行试验的人员可能要求复杂且先进的操作技术。因此，本发明的一个目的在于提供一种新的光学分析技术，该技术不包括诸如FCS,FIDA和PCH等光学分析技术中进行的统计处理，使得能够在包含的被观测粒子的浓度或数密度比诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术所能够处理的水平低的样品溶液中检测被观测粒子的状态或特性。
另外，本发明的另一目的在于提供一种实现上述新的光学分析技术的光学分析装置、方法或用于光学分析的计算机程序，其中，能够在与诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术相似的短的测量时间内利用少量样品(例如，数十μ L的水平)完成测量，还能够定量地确定被观测粒子的诸如浓度或数密度等特性。用于解决问题的方案总的来说，在本发明中，提出了一种新型光学分析技术，该技术借助于诸如共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统等能够对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统对分散在样品溶液中且在样品溶液中随机地移动的发光的粒子(以下称为“发光粒子”)发出的光进行检测，该技术在使微小区域的位置在样品溶液中移动的同时(即，在利用微小区域扫描样品溶液的内部的同时)对来自微小区域、即光检测区域的光进行检测，由此单个地检测横穿微小区域的内部的发光粒子，并且使得能够对发光粒子计数和能够获取关于样品溶液内的发光粒子的浓度或数密度的信息。根据本发明的一个方面，提供了一种光学分析装置，其通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述光学分析装置包括光检测区域移动部，其使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；光检测部，其对来自所述光检测区域的光进行检测；和信号处理部，其产生在所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的过程中利用所述光检测部检测的来自所述光检测区域的光的时间序列光强度数据，对所述时间序列光强度数据进行平滑处理，并且随后在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个所述发光粒子的光信号。在该结构中，“分散在样品溶液中且在样品溶液中随机地移动的发光粒子”是能发光且分散或溶解在样品溶液中的诸如原子、分子或其团聚体等粒子，并且可以是在溶液中自由地进行布朗运动而未固定于基板的任意微粒物质等。该发光粒子典型地为荧光粒子，但是也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发光的粒子。共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是那些显微镜中的检测光的微小区域，该区域与当照明光从物镜发出时将照明光会聚到的区域对应(该区域根据共聚焦显微镜中的、特别是物镜和针孔之间的空间关系来确定。对于在没有照明光的情况下发光的发光粒子，例如根据化学发光或生物发光的粒子，在显微镜中不需要照明光。)。在这方面，在本说明书中，“光信号”是指“表示光的信号”。如从以上可以理解到的，在本发明的装置的基本结构中，首先，在使光检测区域的位置在样品溶液中移动的同时，即在利用光检测区域扫描样品溶液的内部的同时，顺次地进行光的检测。因此，当移动的光检测区域包括随机地移动的发光粒子时，通过光检测部检测来自发光粒子的光，由此，通过捕获该光，将检测到存在一个发光粒子。在那种情况下，当一个发光粒子是单个或多个荧光分子时，光从发光粒子随机地发出，并且会在微小时间内产生光信号值的落差。并且当产生这样的落差时，指明与一个发光粒子的存在对应的信号变得困难。因此，将该装置的信号处理部设计成根据光检测部检测到的信号顺次地产生时间序列光强度数据；并有对该时间序列光强度数据应用平滑处理，以使得光信号值的落差可以被忽略的方式处理数据，并且随后在经过平滑处理的时间序列光强度数据中单个地检测来自每个发光粒子的光信号。在该方面，典型地，光检测部通过光子计数检测来自光检测区域的光，因此，在那种情况下，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。当在溶液中随机移动的发光粒子如上所述变得可被单个地检测时，将获取关于溶 液中的发光粒子的状态的各种信息。具体地，例如，在本发明的装置中，信号处理部可以被设计成通过对单个地检测到的发光粒子的光信号的数量计数(发光粒子的计数)，对在光检测区域的位置移动的过程中检测到的发光粒子的数量计数。根据该结构，通过将发光粒子数与光检测区域的位置的移动量相关联，将获取关于样品溶液内的发光粒子的数密度或浓度的信息。特别地，通过用任意方法确定光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，例如通过使光检测区域以预定的速度移动，能够具体地计算出发光粒子的数密度或浓度。当然，代替直接确定绝对的数密度值或浓度值，可以计算出数密度或浓度相对于多个样品溶液或者相对于作为浓度或数密度的基准的标准溶液的相对比率。在本发明的装置的信号处理部的处理中，可以基于经过平滑处理的时间序列光强度数据中的光信号的形状判定是否有一个发光粒子已经进入光检测区域。在实施方式中，典型地，当检测到具有比预定阈值大的强度的光信号时，可以检测出一个发光粒子已经进入到光检测区域内。此外，在上述本发明的装置中，基于发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度来适当地改变光检测区域的位置在样品溶液中的移动速度。如本领域普通技术人员所理解的，来自发光粒子的检测到的光的状态可以根据发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度而改变。特别地，当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子获得的光量将减�。裕叛〉氖悄芄皇实钡馗谋涔饧觳馇虻囊贫俣龋沟媚芄灰跃返幕蜃愎坏牧槊舳炔饬坷醋砸桓龇⒐饬Ｗ拥墓�。此外，在本发明的装置中，优选地，将光检测区域的位置在样品溶液中的移动速度设定为高于作为待检测对象的发光粒子的扩散移动速度(粒子由于布朗运动而移动的平均移动速度)。如上所述，当光检测区域通过存在发光粒子的位置时，本发明的装置检测到从发光粒子发出的光，由此单个地检测发光粒子。然而，当发光粒子由于布朗运动而随机地移动以致多次进出光检测区域时，将多次检测到来自一个发光粒子的光信号(表明存在发光粒子)，所以，使存在一个发光粒子与检测到的光信号相关联变得困难。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定为高于发光粒子的扩散移动速度，由此，变成能够使一个发光粒子与一个光信号(表明存在发光粒子)相对应。在这方面，由于扩散移动速度取决于发光粒子而不同，所以，优选地，如上所述可以将本发明的装置设计成能够根据发光粒子的特性(特别是扩散常数)来适当地改变光检测区域的移动速度。可以以任意方式来完成用于使光检测区域的位置移动的光学系统的光路的改变。例如，可以通过使用激光扫描型光显微镜中采用的电流镜改变光路来改变光检测区域的位置，或者在不移动光检测区域时，可以通过移动样品溶液的位置(移动显微镜的载物台)来移动样品溶液中的光检测区域的位置。光检测区域的位置移动轨�？梢匀我獾厣瓒ǎ纾靡贫旒？梢源釉残巍⑼衷残�、矩形、直线和曲线中选择。在实施方式中，可以将使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自样品溶液中的发光粒子的光进行检测的本发明的光学分析装置设计成在使光学系统的光检测区域以比样品溶液内发光粒子的扩散移动速度快的速度在样品溶液中移动的同时，对进入到光检测区域内部的各个发光粒子发出的光信号单个地进行检测，并且通过对光信号计数来对进入到光检测区域的发光粒子数进行检测。在上述本发明的装置中与使光检测区域的位置在样品溶液中移动一起进行光检测、并且对来自各个发光粒子的光信号单个地进行检测的光学分析技术的处理也可以通过通用计算机来实现。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种用于光学分析的计算机程序，其用于通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述计算机程序使计算机执行如下进程使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；在使所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的同时对来自所述光检测区域的光进行检测，并且产生时间序列光强度数据；对所述时间序列光强度数据进行平滑处理；和在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个发光粒子的光信号。另外，该计算机程序可以包括通过对单个地检测出的来自发光粒子的光信号的数量计数来对在光检测区域的位置移动的过程中检测到的发光粒子的数量进行计数的进程；和/或基于检测到的发光粒子数来确定样品溶液内的发光粒子的数密度或浓度的进程。典型地，在检测来自光检测区域的光以产生时间序列光强度数据的进程中，通过光子计数来检测来自光检测区域的光，并且在那种情况下，时间序列光强度数据为时间序列光子数数据。在使光检测区域的位置移动的过程中，可以使光检测区域的位置以预定的速度或者比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动，并且可以基于发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。此外，在信号处理过程中， 可以基于经过平滑处理的时间序列光强度数据中的光信号的形状来判定一个发光粒子是否进入到光检测区域中，例如，基于具有比预定阈值大的强度的光信号的检测来判定。光检测区域的位置的移动轨�？梢源釉残�、椭圆形、矩形、直线和曲线中选择。此外，根据上述本发明的装置或计算机程序，实现了新的光学分析方法，该方法通过与使光检测区域的位置在样品溶液中移动一起对光进行检测，来单个地检测来自各个发光粒子的光信号。因此，本发明的光学分析方法，其通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述方法包括如下步骤使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；在使所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的同时对来自所述光检测区域的光进行检测，并且产生时间序列光强度数据；对所述时间序列光强度数据进行平滑处理；和在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个发光粒子的光信号。该方法也可以包括通过对单个地检测出的来自发光粒子的光信号的数量计数来对在光检测区域的位置移动的过程中检测到的发光粒子的数量进行计数的步骤；和/或基于检测到的发光粒子数来确定样品溶液内的发光粒子的数密度或浓度的步骤。此外，在使光检测区域的位置移动的步骤中，可以使光检测区域的位置以预定的速度或比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动，并且可以基于发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。此外，在信号处理步骤中，可以基于经过平滑处理的时间序列光强度数据中的光信号的形状来判定一个发光粒子是否进入到光检测区域中，例如基于对具有比预定阈值大的强度的光信号的检测来判定。发明的效果通过上述本发明的装置、方法或计算机程序实现的光学分析技术为自身的光检测 机构采用了如下结构与诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术的情况类似，对来自共聚焦显微镜的或多光子显微镜中的光检测区域的光进行检测，因此，样品溶液的量可以同样地少。然而，由于在本发明中未进行计算荧光强度波动的统计处理，所以本发明的光学分析技术适用于发光粒子的数密度或浓度大大地低于诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术所需的水平的样品溶液。此外，由于在本发明中对分散或溶解在溶液中的各个发光粒子单个地进行检测，所以通过使用关于粒子的信息能够定量地进行发光粒子的计数、样品溶液中发光粒子的浓度或数密度的计算或者获取关于浓度或数密度的信息。例如，虽然专利文献5和6能够获取在预定时间内强度超过预定阈值的荧光信号的频率的总数与样品溶液中荧光分子等的粒子数之间的相关性，但是不能掌握通过测量区域的粒子的动态行为(粒子是径直通过测量区域或是驻留在测量区域内)，因此，强度比预定阈值高的荧光信号与通过测量区域的粒子之间的对应关系不清楚，从而发光粒子的计数从理论上讲是不可能的，从而难以精确地确定样品溶液内粒子的浓度。然而，根据本发明，由于使得通过光检测区域的发光粒子与检测到的光信号以I对I的方式相关联，使得一次将检测一个发光粒子，所以对分散在溶液中且在溶液中随机地移动的发光粒子的计数成为可能，并且与传统技术相比能够精确地确定样品溶液中粒子的浓度或数密度。本发明的光学分析技术典型地用于生物微粒对象的溶液的状态分析，其中生物微粒对象为例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或者其团聚体等生物分子，以及病毒和细胞等，但是也可以用于溶液中非生物粒子(例如原子、分子、胶束、金属胶体等)的状态分析，并且应当理解的是，这些情况也都包含在本发明的范围内。在该方面，在本发明中，根据在对光检测部中检测的来自光检测区域的光的时间序列光强度数据进行平滑处理之后、在经过平滑处理的时间序列光强度数据中单个地检测每个发光粒子的光信号的方式，即使在微小时间内的落差因为光从一个发光粒子随机地发出并且粒子数小而出现在来自一个发光粒子的光信号的值中的情况下(例如当发光粒子时单个荧光分子时)，可以使光强度数据上出现的光信号与发光粒子精确地对应，因此，发光粒子数的更精确的计数、进而在良好的状况下对发光粒子的浓度或数密度的测量变得可能。[在专利文献5和6的情况下，时间序列光强度数据上出现的光信号与发光粒子不关联。另外，在利用传统的流式细胞仪中的荧光测量来检测发光粒子的技术的情况下，由于观测到的发光粒子是携带多个荧光分子的粒子，所以在来自一个发光粒子的光信号的值中不会产生微小时间内的极大的落差，因此不对光强度数据进行平滑处理。]本发明的其他目的和优点将通过以下对本发明的优选实施方式的说明变得清楚。
[图I]图I的(A)是根据本发明的光学分析装置的内部结构的示意图。图I的(B)是共聚焦体积(共聚焦显微镜的观测区域)的示意图。图I的(C)是用于改变镜7的方向以使光检测区域的位置在样品溶液中移动的机构的示意图。图I的(D)是用于移动显微感光板的水平位置以使光检测区域的位置在样品溶液中移动的机构的示意图。[图2]图2的(A)和图2的(B)分别是说明根据本发明的光学分析技术来检测光的原理的示意图和测得的光强度随时间变化的示意图。图2的(C)是对光子数数据进行平 滑处理和拟合处理的示意图。[图3]图3的(A)和图3的(B)分别是发光粒子由于布朗运动而横穿光检测区域的情况下的模型图和示出在该情况下光子数(光强度)随时间的变化的示例的图。[图4]图4的(A)和图4的(B)分别是使得光检测区域的位置以比发光粒子的扩散移动速度快的速度在样品溶液内移动时发光粒子横穿光检测区域的情况下的模型图和示出在该情况下光子数(光强度)随时间的变化的示例的图。[图5]图5是说明包括检测出的信号的二值化处理的、根据通过本发明的光学分析技术测得的光子数(光强度)的时间变化执行发光粒子的计数的信号处理步骤的一个示例的图。[图6]图6是说明包括检测出的信号的微分处理的、根据通过本发明的光学分析技术测得的光子数(光强度)的时间变化执行发光粒子数的计数的信号处理步骤的一个示例的图。[图7]图7是对通过本发明的光学分析技术来检测发光粒子以及对发光粒子计数的计算实验用模型进行说明的图。[图8]图8的(A)示出通过本发明的光学分析技术测得的时间序列光子数数据的示例；图8的(B)示出经过平滑处理的时间序列光子数数据(通过对时间序列光子数数据实施平滑处理而获取的数据);图8的(C)示出对经过平滑处理的时间序列光子数数据进行拟合的高斯函数曲线。图8的(D)示出用于确定经过平滑处理的时间序列光子数数据中脉冲存在区域的处理。[图9]图9示出通过本发明的光学分析技术测得的光子数数据(棒状线)、通过对数据进行平滑处理而获得的曲线(虚线)和对存在峰值的区域拟合的高斯函数(实线)的示例。图中，附有“噪声”的信号作为由噪声或杂质产生的信号而被忽视。[图10]图10的(A)示出根据本发明的发光粒子数检测实验的结果；图10的(B)示出利用平板读取器进行的发光粒子的荧光强度测量实验的结果。图中，纵向条均表示三次测量的平均值，而误差条示出三次测量的SD值。图10的(C)是标出与发光粒子对应的脉冲信号的数量(脉冲数)以及与各样品溶液中的发光粒子浓度相关的光子总数(光子数)的图表，其中，在根据本发明进行发光粒子数检测实验而获得的时间序列光子数数据中检测所述脉冲信号的数量，并且在同一时间序列光子数数据中检测所述光子总数。[图11]图11的(A)是关于含有100fM、lpM和IOpM的发光粒子的样品溶液，以图表的形式示出在未应用平滑处理的时间序列光子数数据中被检测为与发光粒子对应的脉冲信号的信号数量的图，以及图11的(B)是关于相同的样品溶液，以图表的形式示出在应用了平滑处理的时间序列光子数数据中被检测为与发光粒子对应的脉冲信号的信号数量的图。[图12]图12示出在计算荧光强度波动的传统光学分析技术中获得的光子数(光强度)的时间变化的示例，其中，图12的(A)示出粒子浓度处于在测量中提供足够精度的水平的情况，图12的(B)示出样品中的粒子浓度显著地低于情况(A)时的情况。附图标记说明 I...光学分析装置(共聚焦显微镜)2...光源3···单模光纤4...准直透镜5···分色镜6,7,11...反射镜8...物镜9...显微感光板10...井(样品溶液容器)12...聚光透镜13···针孔14···阻断滤片15...多模光纤16···光电检测器17...镜偏转器17a...载物台位置改变装置18···计算机
具体实施例方式
在下文中，详细地描述本发明的优选实施方式。光学分析装置的结构实现本发明的光学分析技术的光学分析装置的基本结构可以是如图I的(A)中示意性地示出的那样通过将能够被用来进行FSC、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统与光电检测器组合而形成的装置。参照附图，光学分析装置I由光学系统2-17和计算机18构成，该计算机18用于获取和分析数据并且控制光学系统的各部件的操作。光学分析装置I的光学系统可以与通常的共聚焦显微镜的光学系统相同，其中，从光源2发出并通过单模光纤3的内部传输的激光(Ex)在光纤的发射端形成以固有NA所决定的角度放射的发散光；并且在利用准直透镜4形成平行光束之后，光在分色镜5和反射镜6、7上反射，从而进入到物镜8中。典型地，在物镜8的上方放置被分注了一至数十yL的样品溶液的样品容器或者其上配置有井10的显微感光板9，并且从物镜8发出的激光在样品容器或井10中的样品溶液内聚焦，从而形成具有强的光强度的区域(激发区域)。荧光粒子或者附有诸如荧光染料等发光标记的粒子等作为被观测对象的发光粒子在样品溶液中分散或溶解，并且当发光粒子进入到激发区域时，发光粒子在驻留于激发区域中的过程中被激发，从而发出光。在通过物镜8和分色镜5之后，发出的光(Em)在镜11上反射并且被聚光透镜12会聚，然后该光通过针孔13、透过阻断滤片14 (在这里仅选择处于特定波长带区域的光分量)并被导入多模光纤15中，从而到达光电检测器16，并且在转换为时间序列电信号之后，该信号被输入到计算机18中，在计算机18中以稍后说明的方式执行用于光学分析的处理。在这方面，如本领域技术人员所知道的，在上述结构中，针孔13位于物镜8的聚焦位置的共轭位置处，因此，仅从如图I的(B)中示意性地示出的激光的聚焦区域、即激发区域发出的光通过针孔13，而来自激发区域之外的其他区域的光被阻挡。图I的(B)中示出的激光的聚焦区域是该光学分析装置中的有效体积通常为大约I-IOfL的光检测区域(典型地，光强度与在区域的中央具有峰值的高斯分布一致地展开。有效体积是以光强度减小至峰值强度的Ι/e2的表面为边界 的近似椭球的体积)，该有效体积称作“共聚焦体积”。此外，由于在本发明中对来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光染料分子的微弱光进行检测，所以，优选地，光电检测器16使用能够用于光子计数的超高灵敏度光电检测器。当通过光子计数来进行光的检测时，以对预定时间内的每个预定单位时间(BIN时间)测量到达光电检测器的光子的数量的方式，连续地进行光强度的测量。因此，在这种情况下，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。此外，可以在显微镜的载物台(未示出)上设置用于使显微感光板9的水平位置移动的载物台位置改变机构17a，以改变被观测的井10。载物台位置改变装置17a的操作可以由计算机18控制。根据该结构，即使存在两个以上的样本也能够实现快速的测量。此外，在上述光学分析装置的光学系统中，设置有用于利用光检测区域、即聚焦区域扫描样品溶液的内部，也就是用于使光检测区域在样品溶液内移动的机构。对于用于使光检测区域的位置移动的该机构，例如，如图I的(C)中示意性地示出的那样，可以采用改变反射镜7的方向的镜偏转器17 (使光检测区域的绝对位置移动的类型)。该镜偏转器17可以与配备在通常的激光扫描型显微镜上的电流镜装置中的镜偏转器相同。或者，可替代地，如图I的(D)所示，可以采用载物台位置改变装置17a来移动分注了样品容液的容器10(显微感光板9)的水平位置，以使光检测区域的相对位置在样品溶液中移动(使样品溶液的绝对位置移动的类型)。无论在哪一种类型中，为了得到光检测区域的位置期望的移动图形，在计算机18的控制下与光电检测器16的光检测协调一致地驱动镜偏转器17或者载物台位置改变装置17a。光检测区域的位置的移动轨�？梢源釉残�、椭圆形、矩形、直线和曲线中以单个或组合的形式任意地选择(在计算机18中的程序中，可以设计成能够选择多种移动图形。)。在这方面，虽然未示出，但是可以通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置在上下方向上移动。在用作被观测对象的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在那种情况下，由于光仅从激发光的聚焦区域(光检测区域)发出，所以可以移除针孔13。此外，在用作被观测对象的发光粒子不是由于激发光而是由于化学发光或生物发光现象而发光的情况下，可以省略用于产生激发光的光学系统2-5。当发光粒子由于磷光或散射光而发光时，照原样使用上述共聚焦显微镜的光学系统。此外，如图所示，在光学分析装置I中，可以设置两个以上的激发光源2，使得能够根据发光粒子的激发波长适当地选择激发光的波长。类似地，也可以设置两个以上的光电检测器16，使得当样品包含波长彼此不同的两种以上的发光粒子时，能够根据波长对分别从这些发光粒子发出的光分开地进行检测。本发明的光学分析技术的原理诸如FCS和FIDA等光谱分析技术的优点在于，与传统的生化分析技术相比，需要的样品量极少并且能够迅速地进行试验。然而，在诸如FCS和FIDA等这些光谱分析技术中，从原理上讲是基于荧光强度波动来计算被观测粒子的浓度和特性，所以，为了获得精确的测量结果，样品溶液中的被观测粒子的浓度或数密度应当处于如图12的(A)所示意性地绘出的那样在测量荧光强度的过程中光检测区域CV内总是存在大约一个被观测粒子的水平，使得如图中右手侧所示出的那样在测量时间内总是能够检测到显著的光强度(光子数)。当被观测粒子的浓度或数密度低于上述水平、例如处于如图12的(B)所绘出的那样被观测粒子很少进入到光检测区域CV内的水平时，如图中右手侧所示，在一部分测量时间·中将不会出现显著的光强度(光子数)，因此，精确地计算光强度波动会变得困难。另外，当被观测粒子的浓度显著地低于在测量过程中光检测区域的内部总是存在大约一个被观测粒子的水平时，光强度波动的计算会受到背景的影响，为了获得足够用于计算的显著数量的光强度数据(光子数)，应当延长测量时间。为此，在本发明中，提出了一种基于新的原理的光学分析技术，即使当被观测粒子的浓度低于诸如FCS和FIDA等上述光谱分析技术中所要求的水平时，该光学分析技术也能够检测被观测粒子的诸如数密度或浓度等特性。在本发明的光学分析技术中，简要地说，在进行处理时，与通过驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(镜偏转器17或载物台位置改变装置17a)从而如图2中所示意性地绘出的那样使得光检测区域CV的位置在样品溶液中移动、即利用光检测区域CV扫描样品溶液的内部一起进行光检测。因此，例如，如在图2的(A)中，在使光检测区域CV移动的过程中(图中，时间t0至t2)，当光检测区域CV通过存在一个发光粒子(图中为荧光染料)的区域时(tl)，如图2的(B)所示显著的光强度(Em)将被检测为脉冲状的信号。因此，通过在如上所述执行使光检测区域CV的位置移动和光检测的过程中逐个地检测如图2的(B)所示的那样出现的各显著的光强度、即各脉冲状的信号，而单个地检测发光粒子，并且通过对发光粒子数计数，能够获取关于测量区域内存在的发光粒子的数量、浓度或数密度的信息。应当理解的是，在本发明的光学分析技术的原理中，没有执行诸如计算荧光强度波动等统计计算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此，即使在发光粒子(被观测粒子)的浓度处于在FCS和FIDA中不能够进行足够精确的分析的低的水平的样品溶液中，也能够获取关于发光粒子的浓度或数密度的信息。在这方面，如“发明内容”部分已经指出的，在发光粒子是单分子水平或多分子水平的荧光染料等的情况下，从发光粒子发出的光子的数量少并且光子是随机发出的。因此，在实际的光强度数据(光子数数据)中，光子数(光强度)的值(PC)如图2的(C)所示会在微小时间内具有落差，因此，如果试图从原始光子数数据检测发光粒子的光信号，来自一个发光粒子的光可能偶然被错误地检测为来自两个或多个发光粒子的光。例如，在示出的示例中，尽管光子数PC的组被认作来自一个发光粒子的光，但由于微小时间内落差的存在，例如可能将三个信号组和(iii)错误识别为对应于不同的发光粒子的信号。因此，在本发明中，使用移动平均法等对原始光子数数据应用平滑处理。当应用平滑处理时，如图中实线所绘出的，光子数的值变为近似的钟形脉冲信号，由此与来自一个发光粒子的光对应的信号检测变得容易，从而减少将来自一个发光粒子的光信号错误识别为来自两个或多个发光粒子的光信号的可能性。此外，通过将诸如图中虚线所绘出的高斯函数等钟形函数与经过平滑处理的光子数数据中出现的各个脉冲状信号拟合，并且基于拟合结果来判定各个脉冲状信号是否是与来自发光粒子的光对应的信号，可以实现与经过平滑处理的光子数数据中来自发光粒子的光对应的信号的检测。本发明的光分析装置的操作和操作过程 具体地，在利用如图I的(A)所示的本发明的光学分析装置I的光学分析中，执行(I)测量包含发光粒子(被观测粒子)的样品溶液的光强度的过程和(2)分析测得的光强度的过程。( I)样品溶液的光强度的测量在本发明的光学分析技术中用作被观测对象的粒子可以是任意粒子，只要该粒子分散在样品溶液中并且在样品溶液中随机地移动即可、诸如溶解的分子等，例如，粒子可以是生物分子，即蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸等或者这些生物分子的团聚体，也可以是病毒、细胞、金属胶体或其他非生物分子。当用作被观测对象的粒子不是发光粒子时，使用以任意方式将发光标记(突光分子、磷光分子、化学发光分子或生物发光分子)贴附于被观测粒子而制备的粒子。样品溶液典型地为水溶液，然而不限于此，也可以使用有机溶剂和其他任意液体。除了在测量过程中驱动镜偏转器17或载物台位置改变装置17a以使光检测区域的位置在样品溶液内移动(以扫描样品溶液的内部)之外，可以以与FCS或FIDA中的光强度测量过程相同的方式在本发明的光学分析中进行光强度的测量。在操作过程中，典型地，在将样品溶液分注到显微感光板9的井10内并且将其放在显微镜的载物台上之后，当使用者向计算机18输入测量开始的命令时，计算机18执行存储在存储装置(未示出)中的程序(使光检测区域的位置在样品溶液中移动的进程，和在使光检测区域的位置移动的过程中从光检测区域检测光并且产生时间序列光强度数据的进程)，因此将启动利用激发光对样品溶液中的光检测区域照明和测量光强度。在该测量过程中，根据程序在计算机18的操作过程的控制下，镜偏转器17或载物台位置改变装置17a驱动镜7 (电流镜)或显微镜的载物台上的显微感光板9以使光检测区域的位置在井10内移动，与此同时，光电检测器16顺次地将检测到的光转换成电信号并将该电信号传输至计算机18，计算机18将传输的光信号生成时间序列光强度数据并且以任意方式将该时间序列光强度数据存储起来。在这方面，光电检测器I6典型地为能够检测单个光子的到达的超高灵密度光电检测器，因此，时间序列光强度可以是时间序列光子数数据。在测量光强度的过程中光检测区域的位置的移动速度可以是例如通过实验或者为了满足分析的目的而任意设定的预定速度。在基于检测到的发光粒子数来获取关于数密度和浓度的信息的情况下，需要知道光检测区域通过的区域的尺寸或体积，因此，以使得能够掌握移动距离的方式进行光检测区域的位置的移动。在这方面，因为如果经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例，则测量结果的解释将变得容易，所以，基本上优选的是移动速度恒定，然而不限于此。顺便提一句，关于光检测区域的位置的移动速度，为了根据测得的时间序列光强度数据或者对发光粒子数的计数来定量地、精确地、单个地检测发光粒子，优选的是，将移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动中的移动速度快的值。由于本发明的光学分析技术中的被观测粒子是分散或溶解到溶液中并且自由地随机移动的粒子，所以其位置由于布朗运动而随时间移动。因此，当光检测区域的位置的移动速度比粒子的由于布朗运动而移动的速度慢时，粒子将如图3的(A)中所示意性地绘出的那样在区域中随机地移动，从而如图3的(B)所示，光强度随机地变化(如已经指出的，光检测区域中的激发光强度从区域的中央处的峰值朝向外侧降低)，使得确定与各发光粒子对应的显著的光强度变化变得困难。因此，优选地，如图4的(A)所绘出的那样，光检测区域的位置的移动速度被设定为比粒子的由于布朗运动而移动的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得粒子将近似直线地横穿光检测区域，并且如图4的(B)所示，与各个发光粒子对应的光强度的变化的轮廓
在时间序列光强度数据中变得几乎一致(当发光粒子近似直线地通过光检测区域时，光强度变化的轮廓与激发光强度分布类似)，并且能够容易地确定各发光粒子与光强度之间的对应关系。具体地，扩散系数为D的发光粒子由于布朗运动而通过半径为Wo的光检测区域(共聚焦体积)所需的时间At由均方位移关系的表达式(2ffo)2=6D · At(I)给出，为Δ t= (2ffo) 2/6D —(2)，因此，发光粒子由于布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif近似为Vdif=2ffo/At=3D/ffo —(3)因此，参照该公式，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为比Vdif足够快的值。例如，假设Wo为大约O. 62 μ m,当被观测粒子的扩散系数预计大约为D=2. OX 10_1(lm2/S时，Vdif将为I. OX 10_3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为Vdif的10倍以上，例如15mm/s。在这方面，当被观测粒子的扩散系数未知时，可以通过设定光检测区域的位置的各种移动速度而反复地执行预备试验以找出光强度变化的轮廓变成期望的轮廓(典型地，与激发光强度分布类似)的条件，以此来确定光检测区域的位置的适当的移动速度。(2)光强度的分析当通过上述处理获得了样品溶液的时间序列光强度数据时，通过根据存储在存储装置中的程序的进程(对时间序列光强度数据进行平滑化处理的进程，以及在经过平滑处理的时间序列光强度数据中单个地检测各发光粒子的光信号的进程)，可以在计算机18中进行如下所述的光强度的分析。(i) 一个发光粒子的检测当一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的(A)中所示近似为直线时，在时间序列光强度数据中与该发光粒子对应的光强度变化具有如图5的(A)中所示意性地绘出的、反映光检测区域(由光学系统确定)中的光强度分布的轮廓(通常近似为钟形)。因此，在用于检测发光粒子的一个方法中，为光强度设定阈值Ιο，当光强度超过阈值持续的时间宽度△ τ在预定范围内时，可以判定光强度的曲线对应于通过光检测区域的一个发光粒子，因而检测到一个发光粒子。基于从相对于光检测区域以预定的速度移动的发光粒子发出的光的强度的期望的轮廓来确定光强度的阈值Io和时间宽度△ τ的预定范围，具体数值可以任意地或通过实验来确定，也可以根据被观测粒子的特性选择性地确定。此外，在检测发光粒子的另一个方法中，当光检测区域内的光强度分布可以假设为高斯分布时I=A · exp (_2t2/a2) ---(4),并且，当通过将表达式(4)与显著的光强度的轮廓(能够清楚地判定为不是背景的轮廓)拟合而算出的强度A和宽度a均在预定的范围内时，判定光强度轮廓与通过光检测区域的一个发光粒子对应，由此完成一个发光粒子的检测(强度A和宽度a在预定范围之外的轮廓在分析中可以作为噪声或杂质而忽略)。
(ii)发光粒子的计数可以通过以任意方式对由上述发光粒子的检测方法检测到的发光粒子数进行计数来完成发光粒子的计数。然而，对于大量的发光粒子，例如可以以下面示出的方式完成该过程。参照图5的(B)，在根据时间序列光强度(光子数)数据对发光粒子数进行计数的方法的一个示例中，首先，对检测出的时间序列光强度数据(上栏)进行平滑处理(中栏)。由于光从发光粒子随机地发出，因而在微小时间内的数据值中产生落差，通过平滑处理可以忽视数据值中的该落差。例如可以通过移动平均法来完成平滑处理。随后，通过在平滑处理后的时间序列光子数数据中对强度在预定阈值以上的数据点(时间)分配I并且对强度小于阈值的数据点分配0，来对时间序列光子数数据进行二值化处理(下栏)。因此，在所有数据中，通过对那些数值从I变为O或从O变为I的部分计数来对测量过程中横穿光检测区域的发光粒子的数量计数。在根据时间序列光强度(光子数)数据对发光粒子数计数的方法的又一个示例中，对如图5的(B)的情况那样应用了平滑处理的时间序列光子数数据(图6的(A))应用微分处理(图6的(B))。在应用了微分处理的该数据中，因为在强度峰值点处，其值沿时间增加的方向减小并且值为O或者其二次微分值为0，所以将通过对这些点计数来对测量过程中横穿光检测区域的发光粒子数进行计数。(iii)发光粒子的数密度或浓度的确定当已经完成了发光粒子的计数时，可以使用光检测区域通过的总区域的体积来确定发光粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的有效体积取决于激发光的或检测出的光的波长、透镜的数值孔径以及光学系统的调整状态而变化，因此，难以根据设计参数值来计算光检测区域的有效体积。因此，在本实施方式中，在与测量待试验样品溶液的条件相同的条件下、利用发光粒子浓度已知的溶液(对照溶液)按照上述说明来进行光强度测量、发光粒子的检测以及发光粒子的计数，然后，根据检测出的发光粒子的数量和对照溶液中发光粒子的浓度，可以确定光检测区域通过的总区域的体积、即检测出的发光粒子的数量与发光粒子的浓度之间的关系。优选地，对照溶液的发光粒子可以是波长特征与被观测粒子相同的发光标记(荧光染料等)。具体地，例如，假设在发光粒子浓度为C的对照溶液中检测出的发光粒子的数量为N，那么光检测区域通过的总区域的体积Vt由下式给出Vt = N/C —(5)可替代地，制备发光粒子浓度不同的多种溶液作为对照溶液，并且对各溶液进行测量，然后，将计算出的Vt的平均值确定为光检测区域通过的总区域的体积vt。因此，当给定Vt时，发光粒子的计数结果为η的样品溶液的发光粒子的数密度C由下式给出
c=n/Vt ---(6)在这方面，光检测区域的体积和光检测区域通过的总区域的体积可以通过任意方法给出，例如代替上述方法而采用FCS和FIDA。此外，在本实施方式的光学分析装置中，对于假设的光检测区域的移动图形，可以将与各种标准发光粒子的浓度C与发光粒子数N之间的关系(表达式(5))有关的信息预先存储在计算机18的存储装置中，使得装置的使用者在进行光学分析时能够适当地使用与该关系有关的存储信息。计算实验为了确认根据本发明的光学分析技术的原理获得了与样品溶液中的发光粒子的数密度对应的发光粒子的计数结果，进行如下计算实验。图7示出对计算实验中假设的模型进行说明的图。参照该图，在计算实验中，首先设想如下模型在该模型中，边长为L的正方体以正方体的中心成为坐标系的原点的方式放置在X-Y-Z坐标系中，并且正如发光粒子在样品溶液中自由地随机移动那样，使得扩散系数为D的8个粒子的位置在正方体内每隔时间宽度At=IOy秒沿随机的方向发生移位。正方体的边长L根据粒子浓度来设定例如，当粒子浓度设定为IOpM时，正方体的边长被设定为L=Il. Oym0在这方面，为了使得正方体中总是存在8个粒子从而维持初始设定的浓度，进行如下设计当粒子移动超过正方体的界面(X，Y，Z=±L/2的平面)时，使粒子从相对的界面再次进入到正方体中(例如，当某粒子超过X=L/2的平面时，使该粒子从X=_L/2的平面进入到正方体中)。此外，典型地，期望的是，从样品溶液中实际的发光粒子获得的光强度根据高斯分布从光检测区域的中央处的峰值沿径向变化，因此，在正方体中，以原点为中心的光强度分布被设定为I=A · exp [_2 (X2+Y2+Z2) /Wo2] — (7)，从而假设在正方体中位于坐标点(Χ，Υ，Ζ)的粒子发出由表达式(7)给定的光。在表达式(7)中，A是中心处的强度，其中设定A=I，而Wo是光束束腰，其被设定为Wo=620nm。半径为Wo的球体与有效光检测区域对应，该有效光检测区域的体积被设定为近似lfL。此夕卜，在本发明的光学分析技术中，使得光检测区域的位置在样品溶液中移动。即，也可以说成样品溶液的空间相对于光检测区域移动。因此，在模型中，为了对光检测区域以移动速度V在空间(样品溶液)内沿-X方向移动进行建模，设计成将V · Λ t沿X方向加到正方体内的各粒子的每隔At=IOy秒的位移。图5的(B)的上栏是在粒子浓度为IOpM的正方体中的粒子根据上述模型以光检测区域的15mm/s的移动速度移位了 2ms的情况下获得的光强度数据，并且从该图可以直观地理解，确认两个粒子通过了光检测区域并且各强度变化的轮廓几乎形成高斯分布。此外，在假设具有各种浓度的正方体中的粒子根据上述模型的设定对于任意的时间产生位移并发光的情况下,通过依次计算该时间内从空间发出的光强度的总量,产生了时间序列光强度数据，并且根据上述发光粒子的计数方法在获取的时间序列光强度数据中对发光粒子数进行计数。在上述模型中，在粒子浓度设定为IOpM或O. ΙρΜ、光检测区域的移动速度设定为15mm/s并且测量时间(粒子的位移执行的时间)为10秒的条件下，在重复进行的5次发光粒子的计算实验中，粒子的计数值的平均值和CV值(标准偏差/平均值)如下浓度IOpMO. IpM计数值3668个粒子 35. 6个粒子CV 值 1.7%13. 3%如从该结果可以理解到的，获得了几乎与设定的粒子浓度成比例的粒子的计数值。即，该结果表明，通过在给定的测量时间、给定的光检测区域的移动速度、利用给定强度的激发光对发光粒子进行激发的条件下对诸如染料等具有特定的特性的发光粒子进行计 数，能够获得与发光粒子的浓度在数量上对应的计数值，并且能够确定发光粒子的浓度。此夕卜，除了光检测区域的移动速度设定为60mm/s之外，当以与上述方法相同的方法进行实验时，粒子的计数值的平均值或CV值(标准偏差/平均值)如下浓度IOpMO. IpM计数值11499个粒子 126个粒子CV 值 1.1%9. 4%根据该结果，表明了，如果增大光检测区域的移动速度，则CV值减�。佣芄患跣《苑⒐饬Ｗ蛹剖钡睦肷⒍�。此外，在粒子浓度为IfM并且光检测区域的移动速度为100mm/s时进行的类似实验中，粒子的计数值的平均值和CV值(标准偏差/平均值)分别变成11. 6个粒子和7. 7%。根据该结果，启示了，在本发明中，即使被观测粒子的浓度显著地低于在FCS和FIDA中通常使用的浓度，也能够进行发光粒子的计数。因此，根据不包括FCS、FIDA等中进行的诸如荧光强度波动的计算等统计处理的上述本发明的光学分析技术，通过使微小区域、即光检测区域的位置在样品溶液中移动，也就是扫描样品溶液的内部，并且对横穿光检测区域的发光粒子单个地进行检测或者对发光粒子进行计数，能够对被观测粒子的浓度或数密度比FCS、FIDA等中使用的水平低的样品溶液中的被观测粒子的状态和特性进行检测。在这方面，由于本发明的光学分析技术基本上使用与FCS、FIDA等相同的光学系统，所以可以与FCS、FIDA等一起进行。例如，在检测包含两种以上的物质的溶液中的这些物质之间的相互作用等的情况下，当物质之间的浓度差异大时，例如当一种物质的浓度是nM数量级而另一物质的浓度是pM数量级时，能够以如下方式进行测量和分析对于高浓度的物质采用FCS或FIDA来进行测量和分析，而对于低浓度的物质采用本发明的光学分析技术来进行测量和分析。在这样的情况下，如图I的(A)所示，准备两个以上的光电检测器是有利的。为了验证上述本发明的有效性，进行下述实验。在这方面，应当理解的是，以下实施例仅说明本发明的有效性，并非试图限定本发明的范围。实施例I使用荧光染料ATTO 633 (西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)公司Cat. No. 18620)作为发光粒子来检验能够利用本发明测量的样品溶液中的发光粒子的浓度范围。在这方面，作为对照实验，也测量发光粒子浓度的范围，该发光粒子浓度的范围能够根据荧光强度来测量，而荧光强度利用平板读取器测得。对于样品溶液，制备ATT0633的浓度分别为OfM (不含染料)、10fM、100fM、ΙρΜ、10pM、100pM和InM的包含ATT0633的磷酸盐缓冲液(包含O. 05%的吐温20)。在这方面，还为对照实验制备了包含浓度为IOnM和IOOnM的ATT0633的溶液。在根据本发明的光学分析技术的测量中，使用配备有共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF-20 (奥林巴斯公司)作为光学分析装置，并且根据上述“(I)样品溶液的光强度的测量”中说明的方式来获取上述各样品溶液的时间序列光强度数据。对于物镜，使用浸水式物镜(40X，NA=L 15，WD=O. 26)。为此，光电检测器16使用能够检测单个光子的到达的超高灵敏度光电检测器，因此光检测是以对在每个预定的单位时间(BIN TIME)内到达光电检测器的光子数进 行测量的方式在预定时间内顺次地对光子进行计数。因此，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。此外，激发光使用633nm的激光，并且利用带通滤波器将检测到的光波长设定为从660nm到710nm。进行3次每次2秒的测量，其中光检测区域的位置在样品溶液中的移动速度设定为15mm/秒并且BIN TIME设定为10μ秒。图8的(A)中示出通过2秒的测量而获得的时间序列光子数数据的示例。在上述光强度测量之后，对于各样品溶液根据以下处理过程对在获取的时间序列光子数数据中检测出的光信号进行计数(a)时间序列光子数数据的平滑处理一通过移动平均法对时间序列光子数数据进行平滑处理。一次平均的数据点为9个点，并且重复进行5次移动平均处理。图8的(B)示出对图8的(A)中的数据进行平滑处理的结果。(b)时间序列光子数数据中的脉冲状信号存在区域的检测——确定出在通过(a)处理获得平滑处理之后在时间序列光子数数据中各脉冲状信号的起始点和终止点，并且限定脉冲状信号存在的区域。具体地，首先，对平滑处理之后的全部时间序列光子数数据，计算出相对于时间的一次微分值，以制备时间序列光子数数据的微分值数据。然后，参照时间序列光子数数据的微分值数据的数值，如图8的(D)中所示意性地示出的那样，将脉冲状信号的微分值的变化变大时的点选作脉冲状信号的起始点，而将脉冲状信号的微分值的变化变小时的点选作脉冲状信号的终止点，从而将起始点和终止点之间的区域限定为脉冲状信号存在区域。对全部时间序列光子数数据进行脉冲状信号存在区域的限定。(C)钟形函数的拟合一作为钟形函数，将高斯函数的表达式(4)与过程(b)中限定的各脉冲状信号存在区域拟合。通过最小二乘法进行拟合，其中确定峰值强度A、峰值宽度(最大值的一半时的全宽度)a以及(高斯函数中的)相关系数。图8的(C)示出与图8的(B)的数据拟合了的函数。(d)发光粒子的计数——参照拟合的函数的峰值强度、峰值宽度和相关系数，仅将满足以下条件20 μ秒<峰值宽度<40(^秒峰值强度> I (光子/10 μ秒)(A)相关系数>0.95的脉冲状信号判定为与发光粒子对应的光信号，而不满足上述条件的脉冲状信号作为噪声而被忽视，对被判定为与发光粒子对应的光信号的信号的数量作为“脉冲数”进行计数。图9示出被判定为发光粒子的光信号的信号的示例和被判定为噪声的信号的示例。
在对照实验中，利用平板读取器SH_80001ab (Corona公司)对上述各样品溶液测量荧光强度。激发光波长设定为633nm ;检测光的波长为657nm ;激发侧和检测侧的带宽均设定为12nm。在测量荧光强度时，进行3次测量，每次测量应用50次激发光激发，并且将3次测量的平均值作为最终的荧光强度值。图10的(A)和(B)分别示出在各个浓度的样品溶液中检测出的上述本发明的光学分析技术的测量结果(脉冲数)和对照实验中的测量结果(荧光强度)(各值分别为三次测量的平均值。)。首先参照图10的(A)，根据本发明测得的脉冲数(被算作发光粒子的光信号的信号数)在发光粒子浓度为IOOfM以上的范围内几乎与发光粒子浓度成比例地增大。根据该结果，发现本发明的光学分析技术使得能够逐个地检测发光粒子，并且发现，通过根据本发明的光学分析技术对单个发光粒子进行计数，能够定量地确定发光粒子的浓度。
此外，虽然在图10的(B)的对照实验中不能辨别出在发光粒子浓度为OM情况下的荧光强度和发光粒子浓度为IOOpM情况下的荧光强度之间存在显著差异，但是，在图10的
(A)的本发明的光学分析技术中，可以看出发光粒子浓度为OM情况下的脉冲数和发光粒子浓度为IOOfM情况下的脉冲数之间存在着显著的差异。这些结果的原因被认为如下在利用平板读取器测量的荧光强度中，由于噪声或杂质而产生的光信号重叠，因此，在噪声或杂质对荧光强度的贡献相对大的低浓度范围内，S/N比变差。另一方面，在本发明的情况下，判定时间序列光信号数据中的各脉冲状信号是否与发光粒子相对应，并且忽视被判定为噪声或杂质的信号(见图9)，因此，即使在噪声或杂质对荧光强度的贡献相对大的低浓度区域中，S/N比也维持得比较良好。实际上，如图10的(C)所示，关于根据本发明的光学分析技术对各样品溶液测量2秒而测得的时间序列光子数数据中的总光子数，在发光粒子浓度小于IOOpM的范围内，未观测到与发光粒子浓度为OM的情况相比有显著差异。即，已经表明，根据本发明，代替对时间序列光子数数据中的光子数进行计数，通过从时间序列光子数数据检测发光粒子的光信号并且对其数量进行计数，显著地改善了浓度检测的灵敏度(在本实施例的情况下，能够测量两位数的低浓度。)。此外，对于上述时间序列光子数数据的信号处理，验证平滑处理对时间序列光子数数据的效果。图11的(A)和(B)均是示出关于含有100fM、lpM和IOpM的发光粒子的各样品溶液的光信号的数量的图表，分别为通过对未应用平滑处理的时间序列光子数数据和对应用了平滑处理并满足条件(A)的时间序列光子数数据进行上述处理(b)_ (d)而检测的光信号。如图中清晰示出的，在应用了平滑处理并满足条件(A)的时间序列光子数数据中检测出的光信号数量、即发光粒子的检测数量与已经描述的低至IOOfM的发光粒子浓度一起减�。谖从τ闷交聿⒙闾跫�(A)的时间序列光子数数据中检测出的光信号数量与IOpM以下的发光粒子浓度不对应。这启示了，根据本发明的技术，通过对原始时间序列光子数数据进行平滑处理，与发光粒子对应的光信号变得可检测，并且能够更精确地确定发光粒子浓度。因此，已经表明，根据本发明的光学分析技术，对于比利用荧光强度的传统方法所能够测量的数密度或浓度的极限低的浓度范围，能够确定发光粒子的数密度或浓度。此外，虽然诸如FCS、FIDA和PCH等包括例如荧光强度波动的计算等统计处理的光学分析技术中能够测量的粒子浓度的下限为大约InM，但是本实施例中能够测量的粒子浓度的下限为 IOOfM,因此也表明，根据本发明，也能够对浓度比诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术的情况的浓度显著低的范围内的粒子进 行测量。
权利要求
1.一种光学分析装置，其通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述光学分析装置包括 光检测区域移动部，其使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动； 光检测部，其对来自所述光检测区域的光进行检测；和 信号处理部，其产生在所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的过程中利用所述光检测部检测的来自所述光检测区域的光的时间序列光强度数据，对所述时间序列光强度数据进行平滑处理，并且随后在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个所述发光粒子的光信号。
2.根据权利要求I所述的装置，其特征在于，所述信号处理部对单个地检测到的来自所述发光粒子的光信号的数量计数，以对在所述光检测区域的位置移动的过程中检测到的所述发光粒子的数量计数。
3.根据权利要求I或2所述的装置，其特征在于，所述光检测部通过光子计数来检测来自所述光检测区域的光，并且所述时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。
4.根据权利要求I至3中的任一项所述的装置，其特征在于，所述光检测区域移动部使所述光检测区域的位置以预定的速度移动。
5.根据权利要求I至4中的任一项所述的装置，其特征在于，所述光检测区域移动部使所述光检测区域的位置以比所述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
6.根据权利要求I至5中的任一项所述的装置，其特征在于，所述信号处理部基于经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中的光信号的形状来检测是否有一个发光粒子进入所述光检测区域。
7.根据权利要求I至6中的任一项所述的装置，其特征在于，当在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中检测到强度比预定阈值大的光信号时，所述信号处理部检测到一个发光粒子进入所述光检测区域。
8.根据权利要求I至7中的任一项所述的装置，其特征在于，所述信号处理部基于检测到的所述发光粒子的数量确定所述样品溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
9.一种光学分析方法，其通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述方法包括如下步骤 使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动； 在使所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的同时对来自所述光检测区域的光进行检测，并且产生时间序列光强度数据； 对所述时间序列光强度数据进行平滑处理；和 在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个发光粒子的光信号。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤对单个地检测到的来自所述发光粒子的光信号的数量计数，以对在所述光检测区域的位置移动的过程中检测到的所述发光粒子的数量计数。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，在检测来自所述光检测区域的光并且产生所述时间序列光强度数据的步骤中，通过光子计数来检测来自所述光检测区域的光，并且所述时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。
12.根据权利要求9至11中的任一项所述的方法，其特征在于，在使所述光检测区域的位置移动的步骤中，使所述光检测区域的位置以预定的速度移动。
13.根据权利要求9至12中的任一项所述的方法，其特征在于，在使所述光检测区域的位置移动的步骤中，使所述光检测区域的位置以比所述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
14.根据权利要求9至13中的任一项所述的方法，其特征在于，在单个地检测来自每个发光粒子的光信号的步骤中，基于经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中的光信号的形状来检测是否有一个发光粒子进入所述光检测区域。
15.根据权利要求9至14中的任一项所述的方法，其特征在于，当在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中检测到强度比预定阈值大的光信号时，检测到一个发光粒子进入所述光检测区域。
16.根据权利要求9至15中的任一项所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤基于检测到的所述发光粒子的数量确定所述样品溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
17.一种用于光学分析的计算机程序，其用于通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述计算机程序使计算机执行如下进程 使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动； 在使所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的同时对来自所述光检测区域的光进行检测，并且产生时间序列光强度数据； 对所述时间序列光强度数据进行平滑处理；和 在经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个发光粒子的光信号。
18.根据权利要求17所述的计算机程序，其特征在于，还包括如下进程对单个地检测到的来自所述发光粒子的光信号的数量计数，以对在所述光检测区域的位置移动的过程中检测到的所述发光粒子的数量计数。
19.根据权利要求17或18所述的计算机程序，其特征在于，在检测来自所述光检测区域的光并且产生所述时间序列光强度数据的进程中，通过光子计数检测来自所述光检测区域的光，并且所述时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。
20.根据权利要求17至19中的任一项所述的计算机程序，其特征在于，在使所述光学系统的光检测区域的位置移动的进程中，使所述光检测区域的位置以预定的速度移动。
21.根据权利要求17至20中的任一项所述的计算机程序，其特征在于，在使所述光学系统的光检测区域的位置移动的进程中，使所述光检测区域的位置以比所述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
22.根据权利要求17至21中的任一项所述的计算机程序，其特征在于，在单个地检测来自每个发光粒子的光信号的进程中，基于经过平滑处理的所述时间序列光强度数据中的光信号的形状来检测是否有一个发光粒子进入所述光检测区域。
23.根据权利要求17至22中的任一项所述的计算机程序，其特征在于，在单个地检测来自每个所述发光粒子的光信号的进程中，当检测到强度比预定阈值大的光信号时，检测到一个发光粒子进入所述光检测区域。
24.根据权利要求17至23中的任一项所述的计算机程序，其特征在于，还包括如下进程基于检测到的所述发光粒子的数量确定所述样品溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
全文摘要
提供一种光学分析技术，其能够对以低的浓度或数密度包含于样品溶液中的被观测粒子的状态或特性进行检测。本发明的光学分析技术使用诸如共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统等能够对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统，以在使微小区域的位置在样品溶液中移动的同时(在利用微小区域扫描样品溶液的内部的同时)对来自被观测发光粒子的光进行检测；产生时间序列光强度数据，并且随后对所述时间序列光强度数据进行平滑处理；在经过平滑处理的时间序列光强度数据中对横穿微小区域的内部的发光粒子单个地进行检测，由此使得能够对发光粒子计数或能够获取关于发光粒子的浓度或数密度的信息。
文档编号G01N21/64GK102782479SQ201180011640
公开日2012年11月14日 申请日期2011年2月18日 优先权日2010年3月1日
发明者堀邦夫, 山口光城, 田边哲也, 近藤圣二 申请人:奥林巴斯株式会社
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