专利名称：免疫测定法及其使用的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫测定法，该方法通过使用两种类型的特征抗体使之能够精确测定样品中的靶物质，本发明还涉及所述方法中使用的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种免疫测定法，其中使用两种类型的抗体，即对靶物质比对竞争物质具有更高亲和性的第一抗体，和对竞争物质比对靶物质具有更高亲和性的第二抗体，用这两种抗体处理样品，于是样品中的竞争物质首先与第二抗体结合，这样样品中靶物质与竞争物质的比例扩大，使得靶物质变得易于与第一抗体结合，结果，与仅使用第一抗体的情况相比靶物质的反应性提高，因此靶物质可被精确测定；本发明还涉及在这种方法中使用的试剂盒。
背景技术：
多种类型的物质存在于含有待测定的靶物质的样品中，并且在某些情况下待测定的靶物质和竞争物质同时存在于特定样品中。例如，认为血清中大部分的酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP)衍生自破骨细胞的酸性磷酸酶，并且认为测定TRACP可用作评估成骨细胞功能的指征。因此，TRACP是作为骨吸收标记引起人们兴趣的物质(Norio Fukunaga，Toshitaka Nakamura和Toshio Matsumoto，“Osseous MetabolismMarker”，Medical Review Co.Ltd.，1995)，并且人们发现这种酶除具酶促活性外，该酶的降解产物片段也存在于血清中(J Bone MinerRes.151337-1345，2000；和Clin Chem.4774-80.2001)。
此外，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将血清中的酸性磷酸酶分成从起点开始的0-5六个带。这其中，对应于第五带的酸性磷酸酶是酒石酸抗性的，被称为5带酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP5酒石酸抗性酸性磷酸酶5)。该酸性磷酸酶进一步通过电泳分成具有高含量的与糖链结合的唾液酸的5a，和几乎不含与糖链结合的唾液酸的5b。另外，5a是衍生自血小板等的酶且其血液水平不变，而只有5b的血液水平随骨吸收的变化而变化。因此，人们认为5b是衍生自破骨细胞的酒石酸抗性酸性磷酸酶的主要部分。在“临床化学”(Clin.Chem.471497.2001)中，还推荐衍生自破骨细胞的ACP可缩写为TRACP 5b。因此，在本说明书中，涉及衍生自破骨细胞并用做骨吸收指征的ACP的磷酸酶表达为术语“TRACP 5b”，并认为衍生自破骨细胞的酒石酸抗性酸性磷酸酶和酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)是同义的。因此，它们都以术语“TRACP 5b”表达。
除TRACP 5b外，衍生自红细胞或衍生自血小板的酸性磷酸酶作为ACP存在于样品中。即，当通过收集样品引起溶血作用时，衍生自红细胞的酸性磷酸酶包含于样品中。当血清用作样品时，在血清制品血液凝固过程中血小板被破坏，致使衍生自血小板的酸性磷酸酶包含于样品中。因此，测定TRACP活性的常规方法不能测定破骨细胞特异性TRACP5b。作为这些测定方法的改进，已知一种方法，其中经包括5倍稀释的血清在37℃培育1小时的预处理后，在酒石酸存在的情况下通过使用对硝基苯基磷酸(pNPP)作为底物，测定剩余的TRACP的活性(“Nichidai-Ishi”，49904-911.1990；和Clin.Chem.33458-462.1987)。该方法使之能够避免衍生自红细胞的酸性磷酸酶的影响，但不能排除衍生自血小板的酸性磷酸酶的影响。此外，作为更加特定的活性测定方法，有一种利用TRACP 5b和衍生自红细胞或血小板的酒石酸抗性酸性磷酸酶之间对氟的敏感性差异之TRACP 5b测定方法(JP-A-10-37198)。然而，尽管该方法能够避免衍生自红细胞或血小板的酒石酸抗性酸性磷酸酶的影响，但它不能排除TRACP 5a的影响。此外，该方法需要在精密度上进一步改进，因为在这种方法中通过从总的酒石酸抗性酸性磷酸酶活性减去在氟存在的情况下未被抑制的活性测定TRACP 5b活性。
在免疫测定方法中，例如使用Marius E、Sari L等人的多克隆抗体的方法(J Clin Endocrinol Metab.71442-451.1990；和Clin Chem.461751-1754.2000)和使用Jussi M.Halleen、Heather Bull等人的单克隆抗体的方法(J Bone Miner Res.13683-687.1998；ImmunolLett.70143-149.1999；J Bone Miner Res.14464-469.1999；Clin Chem.452150-2157.1999；和Clin Chem.461751-1754.2000)，测定对应于整个第5带的活性，因此TRACP 5a的影响不可忽略。此外，Halleen等人的方法(设计该方法以专门测定TRACP 5b)对衍生自破骨细胞的TRACP 5b的活性更有特异性，但在健康人样品与患有恶化的骨吸收疾病的患者样品之间仅显示微小的差异。因此，作为骨吸收标记的TRACP 5b的敏感性不足。人们认为对以前制备的多克隆抗体和单克隆抗体的TRACP 5b的低专一性是上述缺陷的原因。既然报道血清中TRACP含有10倍于活性酶量的大量无酶促活性的片段，还假设血清中这些片段与完整酶竞争，因此由于不利的反应系统其专一性很低。
即使在这种情况下，迄今为止通过免疫测定等方法利用对酶促活性的竞争物质、完整酶和酶降解产物共有的抗原进行定量。然而，结果，当在单克隆抗体的情况下表位有限时，由于降解作用出现了可测量片段和不可测量片段。因此，可推测具有例如如下问题即使在测定同一种靶物质时，使用多种试剂盒获得的测定结果中没有相关性。此外，还报道在TRACP的情况下(以前给出的例子)，其片段的量不能在临床上反应骨吸收(J.Bone Miner.Res.，151337-1345，2000；和Clin.Chem.4774-80，2001)。这被视为仅用于测定酶活形式所必需的适当的例子。在这种情况下，仅酶的水平将通过除去片段测定。通常假设，通过活性测定方法测定TRACP不精确，因为失活片段与酶竞争。而且，没有用于纯化分离蛋白质片段的片段特异性抗体，因此，实质上没有给出用于分离的方法。
发明公开本说明书中阐明的TRACP精确测定长期以来都是不可能的，尽管人们认为它具有临床意义。因此，考虑了下面两种原因。第一种原因是没有对指示破骨细胞活性的TRACP 5b具有高度特异性的抗体。第二种原因是通过TRACP酶降解形成的蛋白片段在血清中以超过活性酶的量存在。
因此，本发明中，通过开发对TRACP活性酶具有高度结合常数值的第一抗体以及几乎不与酶反应但与酶的失活降解片段结合的第二抗体，并将它们用于同一个反应系统中，仅酶活水平被精确测定，而避免降解产物的影响。
考虑到这一问题，本发明提供了一种免疫测定方法，其中首先联合使用与待测靶物质高度反应的第一抗体以及与竞争物质(例如失活片段)高度反应的第二抗体，以排除反应系统中竞争物质的影响，籍此，特异并精确地测定靶物质，例如活性酶。
也就是说，本发明提供了一种免疫测定方法，其中通过使用两种类型的抗体测定样品中的靶物质，该方法包括使用两种类型的抗体，即具有如下特性的第一抗体和第二抗体(i)第一抗体具有对靶物质和竞争物质的亲和性，(ii)第一抗体对靶物质的亲和性高于对竞争物质的亲和性，(iii)第二抗体对竞争物质的亲和性高于对靶物质的亲和性，和(iv)第二抗体对竞争物质的亲和性高于第一抗体对靶物质的亲和性，使样品中的靶物质和竞争物质与吸附在载体上的第一抗体和第二抗体结合，然后测量结合的靶物质的水平以测定所述样品中的靶物质。
此外，本发明提供了使用两种类型的抗体免疫测定样品中靶物质的试剂盒，其中包括两种类型的抗体，即具有如下特性的第一抗体和第二抗体(i)第一抗体具有对靶物质和竞争物质的亲和性，(ii)第一抗体对靶物质的亲和性高于对竞争物质的亲和性，(iii)第二抗体对竞争物质的亲和性高于对靶物质的亲和性，和(iv)第二抗体对竞争物质的亲和性高于第一抗体对靶物质的亲和性。
附图简述
图1是显示使用Cyphergen Biosystems.Inc.的Protein ChipSystem分析结果的简单图表。从图表(1)和(2)发现就抗体Trk49来说，在婴儿血清中有4种片段与之特异性反应。另一方面，从图表(3)和(4)发现就抗体Trk62来说，几乎没有片段与之特异性反应。
图2显示测定激素治疗前、后的骨质疏松患者血清的结果。该治疗前观察到的两个峰值于治疗后消失。从这一事实还推测相应于这两个峰值的片段对骨吸收是特异性的。
图3显示使用相同浓度的抗体Trk49和Trk62进行ELISA的结果。抗体Trk49仅显示低反应性。然而，与仅使用抗体Trk62的情况相比，在同时使用抗体Trk49和Trk62的平板上显示了提高的反应性。
图4显示通过吸附抗体Trk62到平板上和吸附抗体Trk62或抗体Trk49到乳胶颗粒上进行ELISA的结果。在获得的Trk62抗体敏化的乳胶反应物可与平板竞争的情况下，随着加入的乳胶反应物浓度的提高着色减少。但是，通过对比，就Trk49敏化的乳胶反应物来说，酶的着色值在0.1％～0.15％的实验组中增加。于是，发现当与吸附在平板上的抗体Trk62联合使用时，Trk49抗体敏化的乳胶反应物是有效的。
实施本发明的方式本发明的免疫测定方法中，两种类型的抗体，即第一抗体和第二抗体用于测定样品中待测靶物质。所述第一抗体和第二抗体具有如下特性(i)第一抗体具有对靶物质和竞争物质的亲和性，(ii)第一抗体对靶物质的亲和性高于对竞争物质的亲和性，(iii)第二抗体对竞争物质的亲和性高于对靶物质的亲和性，和(iv)第二抗体对竞争物质的亲和性高于第一抗体对靶物质的亲和性。本文中，术语“竞争物质”是指与待测靶物质具有相似的抗原性的物质，并且具有这样的特性，即当制备靶物质的抗体时，所述竞争物质与靶物质竞争与该抗体结合。例如，当靶物质是蛋白质或酶时，竞争物质包括，例如蛋白质或酶的片段、具有在构成蛋白质或酶的氨基酸序列中通过取代、缺失或添加氨基酸残基形成的氨基酸序列的变体、和通过向蛋白质或酶中添加磷酸酯基或改变蛋白质或酶的糖链部分获得的修饰产物。
本发明中，待测靶物质的典型例子是完整酶。当靶物质是完整酶时，竞争物质的典型例子是不具有酶促活性的物质，例如通过酶降解获得的产物，即酶降解产物。
本发明中各个第一抗体和第二抗体可以是抗血清、多克隆抗体和单克隆抗体中的任何一种。
可制备用于本发明的第一抗体和第二抗体，方法是例如通过用待测靶物质免疫动物，作为抗原，将动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤，然后选择具有如下性质的两种类型的单克隆抗体，作为两种类型的抗体，即来自由杂交瘤制备各种单克隆抗体的第一抗体和第二抗体(i)第一抗体具有对靶物质和竞争物质的亲和性，(ii)第一抗体对靶物质的亲和性高于对竞争物质的亲和性，(iii)第二抗体对竞争物质的亲和性高于对靶物质的亲和性，和(iv)第二抗体对竞争物质的亲和性高于第一抗体对靶物质的亲和性。本发明中，第二抗体可以是对靶物质和竞争物质都具有亲和性的抗体。为了获得满足上述关于靶物质和竞争物质的四个条件的两种类型的单克隆抗体，例如，下列各项须满足通过ELISA等测量各种单克隆抗体之靶物质和竞争物质的结合特性，并在测量结果的基础上，选择满足上述四个条件的两种类型的单克隆抗体。另外，也可根据公知的方法测定各种单克隆抗体的靶物质和竞争物质的结合常数(“Protein·Enzyme Fundamental ExperimentalMethods”，Nankohdo Co.，Ltd.)并根据测量结果选择两种类型的单克隆抗体。此外，还可通过使用各种不同的单克隆抗体制备亲和层析柱并测定吸附在柱上的靶物质和竞争物质，选择两种类型的单克隆抗体。
当两种类型的抗体中的每一个，即第一抗体和第二抗体是抗血清或多克隆抗体时，例如下列各项是可行的在通过改变佐剂或改变免疫条件建立的各种条件下，用待测靶物质免疫动物，这样获得的抗血清或多克隆抗体的靶物质和竞争物质的结合特性通过与上述单克隆抗体存在的情况下相同的方法测定，并选择满足上述四个条件的两种类型的抗体。
本发明中使用的两种类型抗体的典型例子是可用于测定衍生自破骨细胞的TRACP 5b的两种类型的单克隆抗体。与TRACP 5b有关并根据本发明获得的两种类型的单克隆抗体一个是第一单克隆抗体，该抗体与TRACP 5b的反应性高于此前报道的单克隆抗体，并几乎不与TRACP 5b的片段反应，另一个是与失活的酶片段反应并几乎不与活性酶反应的第二单克隆抗体。利用这两种类型的抗体使对衍生自破骨细胞的TRACP 5b具有特异性的免疫测定方法成为可能，该方法几乎不受TRACP 5b失活片段和血液中其它同工酶(衍生自红细胞、血小板、中性白细胞或巨噬细胞)的影响。
通过这些单克隆抗体的例子，下面进一步详细地阐述用于本发明的两种类型的抗体。
上述单克隆抗体可通过使用衍生自人破骨细胞的纯化的TRACP 5b作为免疫原获得。尽管在下文描述的方法中，使用从正常破骨细胞中获得的抗原进行免疫，不仅该抗原而且破骨细胞瘤的TRACP 5b等都可用做抗原。
上述单克隆抗体由杂交瘤生产，所述杂交瘤通过用纯化的人TRACP5b作为抗原免疫动物，并将其能够产生抗人TRACP 5b抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合获得。
上述杂交瘤可通过如下方法获得。也就是说，以上述方式获得的人TRACP 5b与公知的佐剂例如弗氏完全或不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、百日咳杆菌佐剂等混合，制备用于敏化的佐剂液体，该液体通过腹腔皮下或尾部静脉施用于动物(例如小鼠或大鼠)，以数个部分每隔1-3周免疫该动物。尽管用于敏化的抗原的量通常在1μg-100mg的范围内选择，约50μg通常是优选的。虽然免疫操作的次数通常为2-7次，各种方法是已知的。随后，衍生自脾等的抗体产生细胞在试管中与具有增殖能力的细胞(例如骨髓瘤细胞等)融合。该抗体产生细胞可从小鼠、裸鼠或大鼠获得。
关于上述融合方法，可通过已公知的Kohller和Milstein的方法(Nature.256，495.1975)使用聚(乙二醇)(PEG)进行融合。融合还可通过使用仙台病毒(Sendai virus)或通过电融合方法进行。
关于从融合细胞中选择能够生产可识别人TRACP 5b的抗体的杂交瘤的方法，可如下进行所述选择。也就是说，在有限稀释的上述融合细胞中，从在HAT培养基和HT培养基中存活的细胞形成的集落中选择杂交瘤。当人TRACP 5b的抗体包含于接种到96-孔平板等中的融合细胞形成的任何集落之培养液上清时，可通过ELISA方法选择能够生产人TRACP 5b的单克隆抗体的克�。渲薪锨逯糜诰哂泄潭ㄓ谄渖系娜薚RACP 5b的测定平板上，反应后，次级标记抗体例如抗-小鼠免疫球蛋白-HRP标记抗体与上述抗体反应。作为标记抗体的标记物质，可使用除HRP外的酶(例如碱性磷酸酶)、荧光物质、放射性物质等。筛选人TRACP5b的特异性抗体，作为对照，可通过进行仅使用BSA与之结合的测定板作为阻断剂的ELISA，同时进行上述ELISA来完成。即，选择在具有人TRACP 5b固定于其上的平板上呈阳性并在仅使用BSA的ELISA中呈阴性的克隆。
此外，可同时进行如下测定将抗-小鼠免疫球蛋白抗体接种于微量接种板中，其中加入融合细胞的培养液上清进行反应，再加入纯化的TRACP 5b与活性酶结合并形成免疫复合物，然后通过利用产色底物例如pNPP测定这样结合的酶活。
本发明中使用的第一单克隆抗体包括能特异性识别人TRACP 5b的单克隆抗体，具体地，它与完整的人TRACP 5b反应，不与衍生自红细胞、血小板、中性白细胞或前列腺和马铃薯ACP的酸性磷酸酶交叉反应，并对人TRACP 5b的失活片段具有低的反应性。其例子是通过由本发明人建立的杂交瘤Trk62生产的单克隆抗体。用于本发明的第二单克隆抗体包括能特异性识别人TRACP 5b失活片段的单克隆抗体，具体地，它几乎不与活性人TRACP 5b反应，并不与衍生自红细胞、血小板、中性白细胞或前列腺和马铃薯ACP的酸性磷酸酶交叉反应。其例子是通过由本发明人建立的杂交瘤Trk49生产的单克隆抗体。
具体地，为了与活性酶特异性结合，本发明中使用的第一抗体优选地是对活性人TRACP 5b比对失活的人TRACP 5b片段具有更高的亲和性的抗体。特别优选的例子是具有对活性人TRACP 5b的结合常数大于第二抗体的抗体。作为第二抗体，适当的是具有对失活的TRACP 5b片段的结合常数大于对第一抗体的人活性TRACP 5b的结合常数的抗体。作为第一抗体，举例说明了由本发明人建立的杂交瘤Trk62生产的单克隆抗体。作为第二抗体，举例说明了由本发明人建立的杂交瘤Trk49生产的单克隆抗体。上述杂交瘤Trk49和Trk62保藏于如下单位，即专利生物保藏中心(Patented Organism Deposition Center)(IPOD)，产业技术综合研究所(独立行政法人)，Chuo-dairoku，Higashi 1-1-1，Tsukuba City，Ibaraki Prefecture，日本305-8566杂交瘤Trk49于2002年11月27日保藏保藏号IPOD FERM BP-8249，杂交瘤Trk62于2002年2月14日保藏为保藏号IPOD FERM BP-7890。
上述各个杂交瘤在通常用于细胞培养的培养基上培养，例如α-MEM、RPMI1640、ASF、S-克隆等，且单克隆抗体可从培养基上清回收。如下也是可行的事先用降植烷处理裸鼠，(杂交瘤是从裸鼠衍生的)后，细胞经腹膜内注射到动物体内引起腹水累积，然后从腹水中回收单克隆抗体。
关于从上述上清液或腹水回收单克隆抗体的方法，可采用常规方法。这里举例说明了用硫酸铵、硫酸钠等盐析、层析、离子交换层析、和使用蛋白A的亲和层析。
通过使用由上述方法纯化的本发明的单克隆抗体，可精确测定血清样品中TRACP 5b。下面阐述本发明的免疫测定方法。
例如，如下可实施本发明的免疫测定方法。首先，第一抗体和第二抗体吸附在不溶的固体支持物例如平板上，除上述吸附步骤外，该免疫测定方法可通过与常规ELISA方法相同的步骤进行。用于测定的样品首先加入具有吸附于其上的两种类型抗体的支持物。在这种情况下，由于第一抗体和第二抗体之间结合常数的差异，样品中的竞争物质主要与吸附在支持物上的第二抗体发生抗原-抗体反应，然后样品中的靶物质主要与吸附在支持物上的第一抗体有利地发生抗原-抗体反应。随后，必要时洗涤固体支持物，然后测定附着在固体支持物上的靶物质的水平，如此可测定样品中的靶物质。在这种情况下，当靶物质是完整酶例如TRACP 5b时，将与之相应的底物溶液例如pNPP(对硝基苯基磷酸)加入固体支持物进行酶反应，并测定与固体平板结合的靶物质的水平，如此可精确测定样品中的靶物质。
本发明中，吸附第一抗体的载体可以是不溶的固体支持物，而第二抗体可吸附于在液体中可分散的载体上，例如乳胶或可溶解。在这种情况下，靶物质可如下测定。首先，在液体中可分散的载体，例如乳胶用第二抗体敏化或将第二抗体溶解。另一方面，将第一抗体吸附在固体支持物上。然后，将含有这样处理的第二抗体的溶液和用于测定的样品加入固体支持物，如此样品中的竞争物质主要与第二抗体发生抗原-抗体反应，而靶物质主要与第一抗体发生抗原-抗体反应。随后，必要时洗涤固体支持物，然后测定附着在固体支持物上的靶物质的水平，如此可测定样品中的靶物质。在这种情况下，当靶物质是完整酶如TRACP 5b时，将与之相应的底物溶液例如pNPP(对硝基苯基磷酸)加入固体支持物以测定附着在固体支持物上的靶物质，这样可精确测定样品中的靶物质。
如上文所阐明的，吸附第一抗体的载体通常是不溶的固体支持物。第二抗体在吸附于不溶的固体支持物上或分散于包含乳胶等的溶液中后使用，或溶解。
不溶的固体支持物没有限制，只要它是在例如ELISA的固相免疫测定方法中使用的固体支持物。不溶的固体支持物包括，例如，用聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯等制成的固体支持物。通过物理结合、化学键合或亲和，根据本发明的单克隆抗体(抗体)直接或间接地与上述任何公知的固体支持物结合。用于敏化的抗体的量常常在1ng-100mg/ml的范围内。用于测定人TRACP 5b的样品加入通过物理结合、化学键合或亲和结合在固体支持物上的单克隆抗体(抗体)进行反应。反应一定时间后，洗涤固体支持物并加入产色底物进行反应。关于底物，可使用已知的底物例如pNPP。
作为可分散于液体中、第二抗体吸附于其上的载体，实例有乳胶颗粒、磁性颗�：椭士帕�。还可使用通过将第二抗体与化学合成聚合物、天然聚合物(例如葡聚糖)等键合并将这样处理的聚合物分散于溶液中获得的分散体。在这种情况下，测定固体平板上的靶物质可通过将能够与竞争物质结合的第二抗体加入ELISA方法中的缓冲液试剂而方便地进行。靶物质的测定可通过第二抗体与固相载体键合并使这样处理的第二抗体与吸附于固体平板上的第一抗体竞争而方便地进行。此外，靶物质的测定可通过第二抗体与化学合成聚合物、天然聚合物(例如葡聚糖)等键合，并将这样处理的抗体加入缓冲液试剂而方便地进行。
实施本发明免疫测定方法的试剂盒包括两种类型的抗体，即上述第一抗体和第二抗体。如上所述，如果需要，这些抗体可吸附在不溶的固体支持物或分散于液体中的载体(例如乳胶)上。如果需要，该试剂盒可进一步含有用于测定与抗体结合的靶物质的试剂。
关于本发明，如后面实施例1所详细描述的，多种血清中的TRACP 5b片段使用分别由上述杂交瘤Trk49和Trk62产生的单克隆抗体Trk49和Trk62，通过蛋白质芯片技术进行研究。结果证实在婴儿或骨质疏松症患者的血清中发现分子量约为5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的TRACP 5b片段，其中骨吸收活跃地进行。因此，发现这些TRACP 5b片段可用做诊断骨疾病(例如骨吸收活跃进行的骨疾病)的标志分子。因此，可通过检测取自患者的样品(例如血清、血浆或血液)中的这些标志分子，或测量这些标志分子的量诊断骨疾病。
可采用目前已知的所有方法检测或定量标志分子。所述方法包括，例如，质谱分析法、免疫测定法、电泳法、液相层析法和气相层析法。对于质谱分析法，举例说明了使用激光解析/电离时间飞行质谱仪(LDI-TOF MS)的方法。关于激光解析/电离时间飞行质谱仪，举例说明了表面增强的激光解析/电离时间飞行质谱仪(SELDI-TOF MS法)和基质-辅助的激光解析/电离时间飞行质谱仪(MALDI-TOF MS法)。例如，当采用SELDI-TOF MS方法时，可使用由Ciphergen Biosystems，Inc开发的蛋白质·生物·系统·II·质谱仪(Ciphergen Biosystems，Inc)。该仪器以包含SELDI(表面增强的激光解析离子化)和飞行时间质谱仪组合的蛋白质芯片技术为基准。这种仪器的详细资料公开于国际专利申请WO 01/25791A2、JP-A-2001-281222等。通常，在SELDI-TOFMS方法中，样品被预处理，吸附于芯片上，然后装载在SELDI-TOF MS质谱仪上。当样品是血清时，优选地从系统中除去清蛋白，方法是使用清蛋白吸附剂或用缓冲液清洗系统直到芯片由于离子交换导致的清蛋白所带电荷停止。这种方法中使用的蛋白质芯片没有具体限制，只要它可吸附上述标志分子。作为蛋白质芯片，举例的芯片(也称为化学芯片)，其中具有蛋白质亲和性的官能团，其经修饰产生疏水性、离子交换特性等，并且芯片(生化芯片)具有固定于其上的感兴趣的蛋白质的抗体。
关于另一种质谱分析法，举例说明了使用ESI方法(电喷射离子化)的质谱分析。在使用ESI方法的情况下，将经预处理(例如蛋白酶处理)的样品装载到与分离单元(例如高效液相层析)直接连接的质谱仪上常常是优选的。作为免疫测定方法，举例说明了一种方法，其中通过制备标志分子的多克隆或单克隆抗体测定以前已知的蛋白质。这种免疫测定方法包括酶免疫测定法(EIA法)、免疫比浊测定法(TIA法)、乳胶免疫-凝集法(LATEX法)、电化学发光法、荧光法等。免疫层析法和使用试纸的方法也是有效的。通常，所有这些方法对本领域熟练的技术人员都是已知的，并且这些通常已知的方法可为他们所采用。
除上述方法外，举例说明了电泳法、液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)等。这些方法对本领域熟练的技术人员通常也是已知的，并可采用这些通常已知的方法进行测定。
本发明参考如下优选的实施例更具体地举例说明，这并不意味着限制本发明的范围。
实施例1(1)选择和制备用于制备单克隆抗体的抗原制备衍生自人破骨细胞的TRACP 5b用做制备抗-人TRACP单克隆抗体的抗原。下面描述一种纯化方法。
得到同意后，通过外科手术切除的130g人股骨头冷冻于液氮中，用锤子压碎，然后悬浮于含有蛋白酶抑制剂的200mL缓冲液中(50mMTris-HCl、0.3M KCl、1mM PMSF、1mM EDTA·2Na，0.1％Triton X-100，0.02％NaN3、1单位/ml抑酶肽，pH7.5)，然后在超声匀浆机中匀浆。匀浆4℃搅拌过夜，并在10,000rpm离心20分钟，上清液对10mM Tris缓冲液(pH8.2)透析。此后，透析液应用于CM-琼脂糖凝胶柱(Φ40mm×40cm)(SIGMA)，吸附的蛋白质用上述含有NaCl的相同的Tris缓冲液洗脱，以线性梯度增加NaCl浓度(0-0.5M NaCl)。用底物对硝基苯磷酸测定酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，合并含有高水平活性的部分。将这样获得的溶液浓缩，然后对含有0.7M NaCl的20mM Tris缓冲液(pH7.2)透析，透析液应用于Superdex 200株(Φ16mm×60cm)(AmershamPharmacia Biotech)。以上述相同的方式，测定通过洗提获得的部分中酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，合并包含活性的部分。这样获得的溶液用20mM Tris缓冲液(pH7.2)稀释2倍，应用于HiTrap Heparin HP柱(5mL)(Amersham Pharmacia Biotech)，吸附的蛋白质用上述含有NaCl的相同的20mM Tris缓冲液(pH7.4)洗脱，同时以线性梯度提高NaCl浓度(0.35-1M NaCl)。合并含有高水平的酒石酸抗性酸性磷酸酶活性的部分，然后浓缩获得0.4mg衍生自破骨细胞的纯化的酸性磷酸酶。
用A280确定蛋白质的量。对于纯化，进行SDS-PAGE(TIFCO)，随后银染色。结果，纯度通过在约35,000分子量处出现单带得以确定。对应于单带的酶被认为是纯化的TRACP 5b，并被用做免疫抗原。
(2)免疫衍生自破骨细胞的纯化的酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP 5b)用50mM柠檬酸缓冲液(pH5.5)稀释到浓度250g/ml，25μg(100μl)稀释液与100μl的弗氏完全佐剂(WAKO)充分混合直到实现乳化。这样制备的悬浮液腹膜内给予用二乙醚麻醉的6周龄的Balb/c雌性小鼠(Nippon Clear Co.，Ltd.)。两周后，相同量的上述TRACP 5b(25μg/ml)与弗氏不完全佐剂(WAKO)混合。通过与弗氏完全佐剂的情况完全相同的操作，实现乳化作用以获得悬浮液，并用悬浮液敏化小鼠。这样处置2周后，进行与上述相同的步骤。对于第四次免疫，即最终免疫，制备用50mM柠檬酸缓冲液(pH5.5)稀释的TRACP 5b(25μg/ml)，然后通过注射尾静脉给予小鼠。
(3)建立杂交瘤最终免疫后3天，在用二乙醚麻醉的情况下，经外科手术从用TRACP5b敏化的小鼠除去脾，在无菌条件下将它分散于准备的脾细胞中。根据Kohller和Milstein的方法进行融合(Nature，256，495，1975)通过使用聚(乙二醇)(PEG4000)(MERK)将脾细胞与骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)融合。关于融合比，脾细胞的数量为8×107，而骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)的数量为2×107。也就是，脾细胞与骨髓瘤细胞的融合比为4∶1。融合细胞分散于10％FCS(INVITROGEN)α-MEM(IRVINE)HAT)(Cosmo Bio Co.，Ltd)培养基中，接种于96-孔微量滴定培养板(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)，然后在37℃和5％CO2的条件下培养。
(4)筛选约2周后，证实并筛选生长的集落。进行筛选的方法描述如下。
为了产生用于筛选的平板，在上述(1)项中纯化的TRACP 5b溶解于50mM柠檬酸缓冲液中，并以0.5μg/100μl/孔的量加到96-孔平板(Nunc)中。使平板4℃静置两夜，然后用含有0.05％Tween20的Tris缓冲液洗涤三次。各个孔中加入200μl 1.5％BSA溶液以抑制非特异性反应，使平板4℃静置过夜。这样制得的平板用含0.05％Tween20的Tris缓冲液洗涤3次后，100μl培养上清在各个孔中反应，并进一步洗涤平板。然后，加入一种第二抗体(HRP-标记的抗-小鼠免疫球蛋白抗体(Zymed))进行反应。洗涤后，柠檬酸中100μl 3mg/ml的邻苯二胺产色溶液(OPD)(Nakalai)，HRP的产色底物，加入各个孔在一定时间内引起着色。然后，100μl 1N的硫酸作为终止溶液加入各个孔，并在492nm测定波长处测定吸光度。通过上述步骤发现呈阳性的克隆通过有限稀释法再克隆，这样获得的上清再检验。
(5)抗体的确定具有纯化TRACP 5b的克隆Trk49和Trk62的反应性通过ELISA确定，以发现尽管它们亲和力不同，克隆Trk49和Trk62与具有高度敏感性的平板反应。结果，选择克隆Trk49和Trk62作为识别TRACP 5b的克隆。由这些克隆产生的抗体使用单克隆抗体分类试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)测定，获得的结果显示于下表1中。
表1克隆的特征类别 轻链克隆Trk49 IgG1 K克隆Trk62 IgG1 K(6)制备和纯化单克隆抗体10周龄的Balb/c雌性小鼠(Nippon Clear Co.，Ltd.)给予0.5ml降植烷(Aldrich)两周后，腹膜内给予1×107个上述第(5)项中获得的各个杂交瘤Trk49和Trk62的细胞。约两周后，小鼠腹腔内累积的腹水在二乙醚麻醉的情况下手术收集。通过使用逐步稀释为样品的腹水并通过上述第(4)项中为了筛选采用的ELISA法证实的结果，发现腹水含有高浓度单克隆抗体。该腹水用40％的硫酸铵处理并对PBS透析，然后单克隆抗体使用蛋白质G柱(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并通过SDS-PAGE证实。结果，在两种单克隆抗体Trk49和Trk62的情况下，当抗体处于非还原状态时，在约150,000分子量处证实具有单带，当抗体用巯基乙醇还原时，在约50,000和25,000分子量处证实具有两个带。每只小鼠中各个纯化的抗体Trk49和Trk62的量约为15mg或更多，也就是说，它对于工业利用是足够的。
(7)特异性分析为了研究单克隆抗体Trk49和Trk62的特异性，使用各种同工型(TRACP 5b、红细胞、血小板、PAP(SIGMA)，和马铃薯ACP(SIGMA))进行下列试验。测定方法简要描述如下。
使用蛋白质G纯化的各个单克隆抗体以2μg/孔的量加入固体平板中(Nunc)，使该平板4℃静置两天。该平板用20mM Tris(pH7.0)洗涤3次，洗涤液含有0.05％Tween20，然后将200μL 1.5％BSA Tris(pH7.0)加入各个孔中，随后4℃下过夜封闭。这样产生的平板用与上述相同的洗涤液洗涤一次，将各种同工型的酶活都调整到10IU/L，并将100μl这样获得的各个溶液加入抗体-附着平板的各个孔中。室温下反应进行2小时。反应完成后，平板用与上述相同的洗涤液洗涤3次，加入100μl酸性磷酸酶的底物，反应在37℃进行1小时。各个样品中酶的水平从由抗体捕获的酶引起的底物着色确定。加入50μl反应-终止溶液后，在405nm光学波长处进行测定。
结果，发现单克隆抗体Trk49和Trk62具有极高的特异性，因为它们仅与TRACP 5b反应，不具有与其它同工型的交叉反应性。
(8)利用SELDI法证实片段最近几年，包括表面增强激光解析离子化(SELDI)和飞行时间质谱仪组合的蛋白质碎片技术已由Ciphergen Biosystems Inc.，USA开发，并已开始临床应用，例如，用于检测新的肿瘤标记物。本发明人试图通过使用所述技术和利用由建立的杂交瘤Trk49和Trk62产生的单克隆抗体在实践中捕获血清中的TRACP 5b片段。
1)使用PS20芯片的试验首先，本发明人通过使用PS20蛋白质芯片阵列(Protein ChipArrays)(Ciphergen Biosystems，Inc)，在血清中搜索与抗体Trk49和Trk62反应的TRACP 5b或其片段。该PS20芯片指抗体-结合芯片并具有下列特征样品中的反应物质首先与结合在金属表面上的抗体结合，并且与抗体反应的物质用激光从抗体上解离并于真空中飞行，由此测定该物质的分子量。蛋白质芯片阵列的试验操作方法简要描述如下。首先，培养适应于合成培养基S-克隆的杂交瘤Trk49和Trk62(SankoJunyaku Co.，Ltd.)，由它们产生的各个抗体使用蛋白质G柱纯化(Amersham Pharmacia)。各个抗体的浓度调整到500μg/mL，2μl这样获得的溶液加入PS20芯片。室温下反应1小时后，加入5μl的阻断缓冲液(1M乙醇胺PBS pH8.0)(WAKO)，反应在室温下进行10分钟。阻断后，芯片用8mL的洗涤缓冲液(0.5％Triton 100 PBS)室温洗涤5分钟。这样重复洗涤两次，然后该芯片用PBS轻柔漂洗。轻轻擦去反应斑点附近的区域，并将4个样品中的每一个取3μl加入芯片，这4个样品即健康志愿者的血清、12岁或以下幼儿的血清、激素替代治疗前骨质疏松患者的血清和激素替代治疗后骨质疏松患者的血清。反应完成后，样品用Kimwipe(Jujo Kimberley)吸收，芯片用8mL洗涤缓冲液(0.5％Triton 100 PBS)室温洗涤5分钟。这样重复洗涤两次，然后该芯片用PBS轻柔漂洗。用Kimwipe(Jujo Kimberley)从芯片上擦去水滴，且0.5μl的饱和芥子酸(Ciphergen Biosystems Inc)/50％乙腈(Wako)/0.5％TFA(Wako)溶液加入两次。这样产生的蛋白质芯片阵列用Protein·Biology·System II质谱仪解读(Ciphergen Biosystems，Inc)。
2)使用PS20芯片进行试验的结果测定数据显示于图1和图2中。在此数据格式中，横坐标轴指从PS20蛋白质芯片分离的各个样品中蛋白质的分子量，纵坐标轴指反应在上述分子量处达到检波器的被分析物量的峰高。在这种情况下，纵坐标轴的单位为主观单位(AU)。在上述试验中，幼儿血清以及激素替代治疗前骨质疏松患者的血清是在进程中骨吸收活跃的血清。作为试验结果，仅当使用抗体Trk49进行实验，在上述两个试验组的情况下观察到5795Da附近的峰和6860Da附近的峰(图1，(2)和图2，(5))。在进程中骨吸收温和的成人血清的情况下没有观察到这些峰(图1，(1)和(3))。在显示高峰值的幼儿血清的情况下，除所述高峰外还可证实近5580Da的峰和近7075Da的峰(图1，(2))。经激素替代疗法治疗后，骨质疏松患者近5795Da和近6860Da的峰消失(图2，(6))。词语“近”用于表达对应于各个峰的分子量的原因是通常具有20或以下的测定误差。此外，当使用抗体Trk62进行实验时，进程中骨吸收活跃的血清中没有发现特异性片段(图1，(3)和(4))。作为实验结果，本发明人成功地发现几种类型的相当新的TRACP 5b片段，它们以前是未知的。实际上，该片段是在约5795Da、约5580Da、约6860Da和约7075Da检测到的蛋白质或其降解产物。这些片段是完全新的物质并是能反应骨吸收或发病的标记物。结合片段的量与各个抗体的结合常数紧密相关。应对抗体Trk62的反应性特别重视。抗体Trk62几乎不与结合抗体Trk49的片段反应，已证明抗体Trk62对活性酶具有高度的特异性。相反，抗体Trk49与片段反应得很好。从这些事实推测用于本发明的两种类型的单克隆抗体，即抗体Trk49和Trk62，分别对片段和酶具有高度的特异性，因此本发明中，TRACP 5b可使用两种抗体通过酶免疫测定法高度敏感地特异性测定。
(9)测量单克隆抗体的结合常数进行下列试验用于确定各个抗原的结合常数。关于确定方法，根据“蛋白质·酶基础实验方法(Protein·Enzyme FundamentalExperimental Methods)”，Nankohdo Co.，Ltd.进行测定。制备两种类型抗原溶液，即(A)纯化的TRACP 5b和(B)通过使用Trk49亲和柱纯化的TRACP 5b片段(TRACP 5b片段的混合物，它至少含有分别具有约5580Da、5795Da、6860Da和7075Da分子量的TRACP 5b片段)，以获得浓度为5μg/mL 20mM的柠檬酸缓冲液。96-孔平板(Nunc)的各个孔用50μL的各个抗原溶液敏化。4℃静置过夜后，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris缓冲液洗涤3次，并将100μL封闭剂(20mM Tris缓冲液含有1.5％BSA和10％蔗糖)加入各孔，随后4℃静置过夜。平板的各孔再次用200μL含有0.05％Tween20的20mMTris缓冲液洗涤3次，通过分步稀释各个抗体为12个浓度(0、0.1、0.15、0.20、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.75、1.0μg/mL)获得的20μL的各个抗体溶液加入各个孔中。反应在各个条件下进行2小时(i)37℃和(ii)4℃。经这样初次反应后，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris缓冲液洗涤3次，并将50μL 1000倍稀释的第二抗体(抗-小鼠IgG-HRP标记抗体Zymed)加入各孔。反应在37℃进行2小时，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris缓冲液洗涤3次。然后，100μL 3mg/mL的OPD溶液加入各孔以引起着色。用100μL 0.1N的硫酸溶液终止着色，随后在492nm处比色。
从这样获得的结果，通过条件(i)下每1M浓度的A492，首先确定结合的单克隆抗体的量。例如，由于当TRACP 5b平板上抗体的量是0.05μg时A492为0.250，当抗体的分子量取做146,000时，结合的抗体的量可如下确定0.25/{0.05/(0.146×10-9)}＝0.731×10-9(1)接着，条件(ii)下各个抗体浓度结合的抗体的浓度(PL)从在条件(i)下获得的值确定。
＝条件(ii)下的A492/每1M浓度的A490(2)然后，从加入的抗体浓度确定游离抗体的浓度[PF]。
＝加入的抗体浓度-[PL] (3)[PL]/[PF]对结合抗体的浓度做曲线图，通过曲线的斜率(-nK)确定结合常数。
Ka＝-斜率/n作为通过上述方法测定的结果发现的两种单克隆抗体Trk49和Trk62的结合常数(ka)值显示于下表2中。
表2单克隆抗体的结合常数单克隆抗体结合常数Trk49 (TRACP 5b) Ka＝0.94×109(TRACP 5b片段) Ka＝5.25×109Trk62 (TRACP 5b) Ka＝3.73×109(TRACP 5b片段) Ka＝0.69×109当领会了上述反应系统中结果的含义时，发现反应活性，即亲和性如下Trk49与片段的反应性>Trk62与酶的反应性>Trk492与酶的反应性>Trk62与片段的反应性因此，发现如下事实由于单克隆抗体Trk49与TRACP 5b片段的反应性高于与TRACP 5b本身的反应性，而且，当与单克隆抗体Trk62对TRACP 5b的结合常数相比时该反应性更高，因此反应系统中单克隆抗体Trk49首先选择性地与TRACP 5b片段结合，单克隆抗体Trk62可在竞争片段的量减少的反应系统中与TRACP 5b更有利地结合。该结果支持了使用蛋白质芯片的试验的结果。
(10)通过ELISA进行测定的试验因此，生产下列5中类型的平板Trk49 1μg/孔/100μL、Trk49 2μg/孔/100μL、Trk62 1μg/孔/100μL、Trk62 2μg/孔/100μL、和Trk49 1μg+Trk62 1μg)/孔/100μL。除如下改变外敏化抗体溶液的体积100μL，封闭液的体积100μL、样品的体积100μL，生产平板的方法与上述第(7)项中测定单克隆抗体的特异性的生产方法相同。关于初次反应，具有高的TRACP 5b水平的合并血清(包含至少分别具有约5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的分子量的TRACP 5b片段)作为样品加入吸附在平板上的抗体，抗原-抗体反应在室温下震荡进行。然后，进行洗涤步骤，将100μL合成底物溶液加入各个孔中，37℃下进行1小时酶促反应。反应经加入0.2N NaOH溶液而终止，随后比色，借此测定酶活。获得的结果显示于图3中。
基于它的结合常数，假定与酶具有低反应性，而与片段具有高反应性的抗体Trk49对酶具有低的亲和力，因此对测定不具有必要的敏感性。另一方面，基于根据抗体Trk62的结合常数，推测与酶具有高反应性的抗体Trk62显示良好的线性关系。此外，在平板具有抗体Trk49和抗体Trk62混合物的情况下，获得更长的线性和改进的敏感性。由于即使当各个抗体的量从1μg增加到2μg时，线性和敏感性几乎没有改善，推测作为反应中涉及的各个抗体的量，1μg/孔基本上足够了。即，推测因为根据基于结合常数试验的理论线性和敏感性得以提高，反应系统中抗体Trk49实质上优势性地与片段结合，然后抗体Trk62与完整酶结合。
(11)使用乳胶试剂的片段吸收方法使用已发现能够实质上特异性吸收片段的单克隆抗体Trk49和单克隆Trk62作为对照，用这两种单克隆抗体中的每一个敏化乳胶以制备乳胶试剂。乳胶试剂的制备如下进行。
将2mL 1％的乳胶悬浮液与2mL 0.1mg/mL的抗体Trk49和Trk62的各个溶液混合，获得的混合物搅拌约1小时。离心后，沉淀悬浮于1％的BSA溶液中，并将悬浮液再搅拌约1小时。重新离心后，沉淀悬浮于PBS溶液中以获得乳胶试剂。该乳胶试剂稀释为8个浓度，即0.15％和从0.1％通过2倍稀释(0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.00313和0.00156％)获得7个浓度，共制备8种乳胶试剂。ELISA法中的操作阐述如下。
首先，取这些乳胶试剂中的每一个各50μL加入接种了抗体Trk62的平板的各个孔中(2μg/孔)。然后，将从得到其同意的患者获得的具有高水平TRACP 5b(8U/ml)的100μL合并血清加入各孔，室温下振动反应1小时。反应完成后，该平板用含0.05％Tween20的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗涤3次，并向其中加入合成底物溶液。37℃培养1小时后，50μL的反应终止溶液(0.2N NaOH溶液)加入各孔，随后在405/490nm处测定。获得的结果显示于图4中。在Trk62-敏化乳胶试剂添加实验中，引起与平板上单克隆抗体的竞争，以致随乳胶试剂浓度的增加酶着色下降。然而，在抗体Trk49的情况下，在添加0.1～0.15％乳胶试剂的试验中获得显著提高的酶着色值。这一事实，例如，表明不仅用抗体同时敏化的平板，而且使用用于吸附的载体例如乳胶等的吸收方法对于竞争片段的吸收是有效的。此外，使用通过将抗体Trk49溶解于溶液中获得的溶液代替用抗体Trk49敏化的乳胶也是有效的。
工业适用性如上文详细阐述的，本发明的免疫测定法通过使用与靶物质具有高度反应性的第一抗体和与竞争物质例如靶物质的失活片段具有高度反应性的第二抗体的组合，使特异和精确测定待测靶物质例如活性酶成为可能，以避免反应系统中竞争物质的影响。
权利要求
1.一种通过使用两种类型的抗体测定样品中靶物质的免疫测定法，所述方法包括使用两种类型的抗体，即具有如下特性的第一抗体和第二抗体(i)第一抗体具有对靶物质和竞争物质的亲和性，(ii)第一抗体对靶物质的亲和性高于对竞争物质的亲和性，(iii)第二抗体对竞争物质的亲和性高于对靶物质的亲和性，和(iv)第二抗体对竞争物质的亲和性高于第一抗体对靶物质的亲和性，使样品中的靶物质和竞争物质与吸附在载体上的第一抗体和第二抗体结合，然后测量结合的靶物质的水平以测定所述样品中的靶物质。
2.根据权利要求1所述的免疫测定法，其中更进一步，第二抗体对靶物质的亲和性高于第一抗体对竞争物质的亲和性。
3.根据权利要求1或2所述的免疫测定法，其中所述靶物质是完整酶并且测量结合的靶物质水平是测量所述完整酶的酶活。
4.根据权利要求3所述的免疫测定法，其中所述竞争物质是不具有所述酶活的物质。
5.根据权利要求3或4所述的免疫测定法，其中所述竞争物质是酶降解产物。
6.根据权利要求3-5中任何一项所述的免疫测定法，其中所述完整酶是酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的免疫测定法，其中所述载体是不溶性固体支持物。
8.根据权利要求1-7中任何一项所述的免疫测定法，其中吸附第一抗体的载体是固体支持物，而第二抗体吸附在分散于溶液中的载体上或被溶解。
9.一种通过使用两种类型的抗体免疫测定样品中的靶物质的试剂盒，其包括两种类型的抗体，即具有如下特性的第一抗体和第二抗体(i)第一抗体具有对靶物质和竞争物质的亲和性，(ii)第一抗体对靶物质的亲和性高于对竞争物质的亲和性，(iii)第二抗体对竞争物质的亲和性高于对靶物质的亲和性，和(iv)第二抗体对竞争物质的亲和性高于第一抗体对靶物质的亲和性。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述第一抗体和第二抗体吸附在载体上。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其中所述第一抗体吸附在固体支持物上，第二抗体吸附在分散于溶液中的载体上或被溶解。
12.一种诊断骨疾病的标志分子，包括分子量约为5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)的片段。
全文摘要
使用两种类型的抗体，即对靶物质的亲和性高于对竞争物质的亲和性的第一抗体和对竞争物质的亲和性高于对靶物质的亲和性的第二抗体，样品用这两种抗体处理。然后，样品中的竞争物质首先与第二抗体结合，这样样品中靶物质对竞争物质的比率扩大。结果，靶物质变得易于与第一抗体结合，依次地，与仅使用第一抗体的情况相比靶物质的反应性增加。因此，可精确测定样品中的靶物质，同时避免包含于样品中的竞争物质的影响。
文档编号G01N33/543GK1732385SQ20038010755
公开日2006年2月8日 申请日期2003年12月24日 优先权日2002年12月26日
发明者大桥建也, 三浦俊英, 五十岚吉彦, 野村文夫, 朝长毅, 片山胜博 申请人:日本纺绩株式会社
