专利名称：用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物及纯化与检测IgG的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离细胞群、用于分离和评价IgG的方法、用于分离IgG的Fab或Fe 片段的方法以及用于实施所述方法的试剂盒。
背景技术：
抗体的免疫球蛋白G(IgG)类在人宿主抵抗病原体的适应性免疫防御中起着重要作用。IgG由两条相同的重链和两条相同的轻链构成，而重链和轻链由可变区和恒定区组成。IgG分子经木瓜蛋白酶处理可生成识别抗原的Fab片段和作为宿主受体的识别位点和与多个效应分子相互作用的位点的Fe片段。IgG的Fe部分还含有与各重链的Ch2结构域中天冬酰胺297残基连接的保守的复合糖或聚糖。当IgG是其天然形式时，这些聚糖位于(^2结构域之间的相接处。它们由具有添加的末端及支链糖残基(例如N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、唾液酸以及半乳糖)的N-乙酰葡糖胺和甘露糖的二天线核心(biantennary core)构成。该糖的存在对于正确的抗体结构以及与细胞免疫球蛋白G Fcy受体(FcyR)和补体系统的相互作用来说至关重要。内切糖苷酶S(EndoS)由化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)分泌，通过水解与IgG重链上的天冬酰胺297残基连接的保守聚糖而对天然IgG具有特异性内切糖苷酶活性。EndoS是第一种已知对天然IgG具有专一特异性的细菌酶。相比之下,其他已知的内切糖苷酶的活性需要对糖蛋白底物进行变性，或通过对糖蛋白底物进行变性而加强。诸如IgG的抗体在基础研究以及在诊断和药物开发中具有许多应用。在一些应用中，诸如，在免疫组织化学、免疫测定、肿瘤检测、放射疗法、抗体结合位点和免疫靶向的晶体学研究中，使用Fab片段要比使用完整的IgG分子方便。使用Fab片段的一些优点是它们不会受到细胞上的Fe受体或沉淀抗原影响，它们表现出免疫原性降低和对吞噬作用较不敏感，并且放射性标记的Fab片段比完整的IgG分子被更快速地从组织中清除。对于其他应用，使用IgG的Fe片段是合乎需要的。如果要大规模制备Fab或Fe片段，可以以重组蛋白的形式进行制备。为了纯化的目的，通常制备重组IgG和血清IgG的完整分子，然后进行化学处理以获得Fab或Fe片段。最常使用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的蛋白水解酶将IgG切成Fab和Fe片段。 这些酶经常切割其他蛋白，所以切割反应通常必须对纯化的IgG级分进行。另外，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶通常在多处切割IgG。这意味着所获得的片段经常不对应于完整的Fab或Fe 片段，即使切割确实产生Fab和Fe片段，它们也通常容易进一步切割成更小的片段。通常使用蛋白A或G亲和分离柱来进行Fe片段与Fab片段的分离，该分离柱利用了细菌蛋白A和G的Fe结合特性。
发明内容
本发明人获得了下述令人惊讶的发现，使细胞与EndoS接触去除已经与Fe Y R结合的IgG。根据本发明，由此提供了一种体外解离Fe Y -受体-IgG复合物的方法，所述方法包括使该复合物与EndoS多肽接触，由此获得不与IgG结合的Fe Y -受体，其中，所述 Fe Y-受体-IgG复合物可随意地存在于含有细胞的样品中。本发明还提供了一种用于分离基本不含Fe Y -受体-结合的IgG分子的细胞群的方法，所述方法包括(a)使含有细胞的样品与EndoS多肽接触；以及(b)从所述接触过的样品中分离所述细胞；由此获得所述细胞群。本发明人还确定了用于分离IgG的改良方法。所述方法利用了缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。本发明人首次揭示了所述修饰的EndoS多肽对于功能活性形式的天然IgG糖蛋白具有专一的特异性。因此，所述方法特别有助于分离糖基化的和/或具有功能活性的IgG。通过将所述修饰的EndoS多肽与能够结合变性和/或去糖基化的IgG的另外IgG结合试剂联合使用，本发明人还确定了一种用于评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的方法。因此，根据本发明，提供了一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的方法，所述方法包括(a)使所述含有IgG的样品与缺失IgG内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽接触； (b)从所述接触过的样品中分离所述EndoS ;由此获得分离的IgG。另外，本发明提供了一种评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的方法， 所述方法包括取含有IgG的样品的第一小例样和第二小例样，其中，对所述第一小例样实施上述方法的步骤(a)和(b)，并且，其中除了使用可选的能够结合变性和/或去糖基化的 IgG的IgG结合试剂取代EndoS多肽以外，对所述第二小例样实施上述步骤(a)和(b)，并且所述方法还包括(c)对所述第一小例样中的与EndoS多肽结合的IgG的量和所述第二小例样中的与可选的IgG结合试剂结合的IgG的量进行定量；以及(d)将(c)中测定的结合的IgG的量进行比较；由此，评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性。本发明人还确定了用于分离IgG的Fab或Fe片段的改良方法。本发明的方法利用了来自化脓性链球菌的高特异性IgG切割酶IdeS (化脓性链球菌的IgG降解酶)和Fe 结合蛋白。因此，本发明的方法不受到背景技术部分描述的现有方法的限制(例如使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)。这是因为IdeS在IgG分子的铰链区内仅有一个确定的切割位点， 因此不可能进一步切割Fab和Fe片段。在本发明的一个方法中，使含有IgG的样品与IdeS和Fe结合蛋白接触。Fe结合蛋白优选是如上所述缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。所述修饰的EndoS蛋白优选为广泛使用的可选的Fe结合蛋白，例如蛋白A和蛋白G。这是因为修饰的EndoS蛋白仅结合Fe，而本发明人发现蛋白A和蛋白G还可以结合Fab片段。因此，使用这些蛋白将Fab 片段与Fe片段分离更加困难。其他优选的Fe结合蛋白包括蛋白H。在本发明的方法中，通常IdeS将IgG切割成Fab和Fe片段，并且Fe结合蛋白结合Fe片段。然后将Fe片段与Fab片段分离。该方法特别有助于从包含纯化的IgG的样品中分离Fab或Fe片段。更特别地，使用本发明的修饰的EndoS多肽，有助于从包含纯化的IgG的样品中分离Fab或Fe片段。然而，所述方法还可适用于含有未纯化的IgG的样品，例如血清、细胞裂解物或细胞培养基。本发明还提供了实施本发明方法的试剂盒和通过本发明的方法分离的细胞群。
图I显示了 EndoS对人IgG所有四种亚类的糖苷酶活性。小图A :人IgG的聚糖结构。IgG的Y链上的聚糖与天冬酰胺297连接。GlcNAc, N-乙酰葡糖胺；Fuc,岩藻糖； Man，甘露糖；Gal，半乳糖；NeuAc，唾液酸。示出了 EndoS的切割位点和小扁豆凝集素(LCA) 的识别位点。小图B :纯化的IgGp4与EndoS —起孵育，通过SDS-PAGE进行分析，并进行染色。小图C =IgGp4与EndoS —起孵育，使用LCA凝集素印迹进行分析。图2显示了血浆环境中EndoS对人IgG亚类的水解。使用EndoS或PBS处理人血浆，然后对纯化的IgG级分进行LCA凝集素ELISA。使用LCA凝集素ELISA检测IgG聚糖水解。将结果表示为各亚类与来自未处理的血浆的信号进行比较的水解百分数。图3 显示了 EndoS(E235Q)结合所有 IgG亚类。小图 A :表示EndoS和EndoS (E235Q) 以3 μ g、I. 5 μ g以及O. 75 μ g的量与固定化至硝酸纤维素膜上的各IgG亚类结合的狭线印迹。使用针对EndoS的抗血清检测结合。小图B :使用BIAcore技术将EndoS (E235Q)与固定化的IgG亚类结合。所选择的曲线使用IgGl作为参照(扣除批变化)显示了与IgGl结合的EndoS (E235Q)。结合动力学常数示于适用的表格中。Nb表示使用BIAcore技术研究组合但显不未结合。图4显示了 IgG亚类的EndoS处理抑制IgG与Fe Y RII的结合。小图A :使用 EndoS处理或未使用EndoS处理的纯化的IgG亚类与固定化至微量滴定板的Fe y RIIa和 FcyRIIb结合。HRP标记的蛋白G用于检测结合的IgG亚类。(+)表示完整的IgG，㈠表示EndoS水解的IgG。小图B :使用BIAcore表面等离子共振观察到的IgG亚类与固定化的受体结合。曲线显示了典型的传感图(sensorgram),这里，IgGl结合Fe Y Rlla。空流动细胞用作参照(扣除的)。表2中显示的数据是结合IgG亚类的动力学常数。Nb表示使用所述技术研究的IgG受体对，但这里显示未相互作用。图5显示了 EndoS处理的IgG不与K562细胞上的Fe YRIIa结合。小图A:使用EndoS处理或未使用EndoS处理的放射性IgG与K562细胞的相对结合。将该细胞与 125I-标记的IgG(完整或EndoS处理的)一起孵育。检测所洗涤的细胞沉淀物的放射性。 125I-IgG (完整)与K562细胞结合(这里表示为100% )，表示IgG与K562细胞特异性结合可通过添加冷IgG而抑制。小图B :将K562细胞与使用EndoS或PBS处理的人血浆一起孵育。将细胞重悬浮于裂解缓冲液，使用针对人IgG的抗血清通过SDS-PAGE和蛋白质印迹 (Western blot)进行分析。图6显示了 EndoS处理的IgG不与单核细胞结合。小图A :将单核细胞与125I-标记的IgG (完整或EndoS处理的)一起孵育。在室温下孵育30分钟之后，通过10% SDS-PAGE 从细胞裂解物分离蛋白质(IOyg总蛋白)。干燥凝胶，并通过感光成像进行分析。小图B: 流式细胞计量分析显示在使用EndoS处理的血液中IgG与活化的单核细胞结合减少。在添加白细胞活化剂fMLP之前，使用EndoS处理人血液。使用小鼠抗人IgG和FITC标记的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体检测与单核细胞结合的IgG。
图7显示了使用EndoS处理时，IgG与Fc Y RII解离。小图A :当与K562细胞结合的 IgG与EndoS —起孵育但不与EndoS(E235Q) —起孵育时，IgG与Fc y Rlla解离。将K562细 胞与血浆一起孵育，然后与EndoS、EndoS(E235Q)或PBS—起孵育。通过SDS-PAGE并使用针 对人IgG的抗血清的印迹来分析细胞裂解物(10 u g总蛋白)的IgG。小图B :在使用EndoS 处理之后与单核细胞结合的IgG与Fc yR解离。将单核细胞与血浆一起孵育，之后与EndoS 或PBS —起孵育。使用针对人IgG的抗血清对于重悬浮的细胞沉淀物的IgG进行分析。通 过印迹法检测IgG的聚糖，并使用LCA凝集素检测其放射性。小图C BIAcore设置显示了 EndoS影响IgGl与固定化的受体Fc yRIIa解离。在两个平行实验中，在IgGl-Fc y Rlla相 互作用的解离过程中，在相同时间点对注入EndoS(黑色曲线)与注入缓冲液(虚线)进行 比较。图8显示了来自不同化脓性链球菌血清型的马链球菌(S. equi)和兽疫链球菌 (S. zooepidemicus)的EndoS同源物的ClustalW氨基酸序列比对。菌株名称、种以及M血 清型在左侧显示。氨基酸同一性和相似性以灰色显示，共有序列在比对下显示。保守的壳 多糖酶基序被加上边框，在比对下使用星号标记活性所必需的谷氨酸。图9显示了 EndoS a -结构域与来自脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)的 EndoF2 和来自假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)的CP40的ClustalW氨基酸序列比对。蛋白质名称在左侧显示。氨 基酸同一性和相似性以灰色显示，共有序列在比对下显示。保守的壳多糖酶基序以方框表 示，在比对下方使用星号标记活性所必需的谷氨酸。序列说明SEQ ID NO : 1是从化脓性链球菌API分离的EndoS多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO 2是衍生自SEQ ID NO 1的序列的修饰的EndoS多肽(E235Q)的氨基 酸序列。SEQ ID NO 3是从化脓性链球菌API分离的EndoS多肽的氨基酸序列，包括信号 序列。该序列对应于NCBI登录号AAK00850。SEQ ID NO 4是从化脓性链球菌API分离的编码EndoS的核酸序列，包括信号序 列。SEQ ID N0S :5至7为引物序列。SEQ ID NO 8是从化脓性链球菌API分离的IdeS的氨基酸序列。SEQ ID N0 :9是从化脓性链球菌API分离的IdeS的氨基酸序列，包括推定的信号 序列。SEQ ID NO 10是从化脓性链球菌API分离的编码IdeS的核酸序列，包括信号序 列。SEQ ID NO 11是成熟的蛋白H的氨基酸序列。SEQ ID NO 12是蛋白H的氨基酸序列，包括信号序列。SEQ ID NO 13是编码蛋白H的核酸序列，包括信号序列。
具体实施例方式一般多肽特性具体实施方式
一般多肽特性
本发明提供了利用细菌蛋白质EndoS和IdeS以及其他蛋白质的多种方法。术语 “蛋白质”、肽以及多肽在本文可互换使用。可以这样理解本发明的某些方法需要具有IgG 内切糖苷酶活性的EndoS多肽，而本发明的其他方法需要缺失所述活性的修饰的EndoS多肽。下列部分涉及本发明所有多肽的一般特性，特别涉及本发明多肽的氨基酸序列的变异、改变、修饰或衍生。可以这样理解本文所述的多肽的变异、改变、修饰或衍生需要满足使这些多肽保留此说明书的后续部分所详述的任何必须的活性或特性的要求。本发明多肽的变体可通过本说明书后续部分更详细描述的氨基酸同一性的特定水平来定义。可使用任何适当的算法来计算氨基酸同一性。例如，PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或比对序列(诸如识别同等或对应序列(特别是在它们的缺省设置下)，例如在“J Mol Evol ”(Altschul S. F. (1993)，36 :290-300) ;“J Mol Biol，，(Altschul S. F.等人(1990),215 :403-10)中所述。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术中心(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中的长度W的短字段(当与数据库序列中相同长度的字段进行比对时，匹配或满足某一正阈值得分T)来识别高得分序列对(high scoring sequence pair, HSP)。T是指邻近字段得分阈值(Altschul等人，同上文)。这些初始的邻近字段命中用作起始搜索的种子，以发现含有它们的高得分序列对。该字段命中沿着各序列向两个方向延伸至累积比对得分不能增加。各方向的字段命中的延伸在下列情况停止；累积比对得分从其最大获得值降低X量; 由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分达到零或更低；或者，达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T以及X决定比对的敏感性和速度。BLAST程序使用11的字段长 (W)，50 个比对(B)的 BL0SUM62 得分矩阵(参见 Henikoff 和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 :10915-10919)、10的期望值(E) ,M = 5、N = 4以及两条链的比较作为缺省值。BLAST算法进行两个序列之间相似性的统计分析,参见例如“Karlin和Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787”。由 BLAST 算法提供的一种对相似性的测量值是最小总概率(P(N))，其提供了两条多核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然存在的概率读数。例如，如果在第一和第二序列比较的最小总概率小于约1，优选小于约O. 1，更优选小于约O. 01，以及最优选小于约O. 001，则认为该序列与另一序列相似。可选地，UWGCG软件包提供了可用于计算同源性(例如根据其缺省设置使用)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12，387-395)的 BESTFIT 程序。可以这样理解本发明的多肽的变体还包括取代变体。取代变体优选包括使用一个或多个氨基酸取代相同数量的氨基酸，以及进行保守性氨基酸取代。例如，可使用具有相似特性的可选氨基酸取代氨基酸，所述可选氨基酸例如为另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电荷氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸。可用于选择适当的取代基的20种主要氨基酸的一些特性如下
权利要求
1.一种用于从含有IgG的样品中分离Fab片段的方法，所述方法包括(a)使所述含有IgG的样品与IdeS和Fe结合蛋白接触；(b)从所述接触过的样品中分离所述IdeS和所述Fe结合蛋白；以及由此分离Fab片段；其中所述Fe结合蛋白是缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽。
2.根据权利要求I所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述样品与能够结合IdeS多肽和Fe结合蛋白的磁性纳米颗粒群接触，且步骤(b)包括对所述接触过的样品进行磁场分离，和/或其中所述EndoS多肽包括(a)SEQ ID NO 2的氨基酸序列；(b)(a)的变体，该变体与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少50%同一性并具有IgG 结合活性；或(c)上述任一者的具有IgG结合活性的片段。
3.一种用于从含有IgG的样品中分离Fe片段的方法，所述方法包括(a)使所述含有IgG的样品与IdeS接触；(b)从步骤(a)获得的混合物中分离IdeS，由此分离Fab和Fe片段；(C)使所述Fab和Fe片段与Fe结合蛋白接触，由此能够形成Fe片段-Fe结合蛋白复合物；(d)从步骤(c)获得的混合物分离所述Fe片段-Fe结合蛋白复合物；以及(e)从步骤(d)获得的所述Fe片段-Fe结合蛋白复合物分离Fe片段；其中所述Fe结合蛋白是缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述样品与能够结合IdeS的磁性纳米颗粒群接触，步骤(C)还包括使步骤(b)获得的所述分离的Fab和Fe片段与能够结合Fe结合蛋白的磁性纳米颗粒群接触，且步骤(b)和(d)包括对所述接触过的样品或分离的Fab和Fe片段分别进行磁场分离，和/或其中所述EndoS多肽包括(a)SEQ ID NO 2的氨基酸序列；(b)(a)的变体，该变体与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少50%同一性并具有IgG 结合活性；或(c)上述任一者的具有IgG结合活性的片段。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，所述方法在步骤(a)之前包括(i)使得所述含有IgG的样品与所述EndoS多肽接触，由此能够形成IgG-EndoS多肽复合物；(ii)从所述接触过的样品中分离所述IgG-EndoS多肽复合物；(iii)从IgG-EndoS多肽复合物洗脱IgG，由此获得含有IgG的样品；以及其中，对在步骤(iii)获得的含有IgG的样品进行步骤(a)和(b)。
6.一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的方法，所述方法包括(a)使所述含有IgG的样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽接触，由此能够形成IgG-EndoS多肽复合物；(b)从所述接触过的样品中分离所述EndoS;以及由此获得分离的IgG。
7.一种用于测定样品中是否存在IgG的方法，所述方法包括(a)使所述样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽接触，由此能够形成 IgG-EndoS多肽复合物；(b)任选地，从所述接触过的样品中分离所述EndoS;以及(c)测定所述分离的EndoS是否与IgG结合，以及由此测定所述样品中是否存在IgG。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述EndoS多肽包括(a)SEQ ID NO 2的氨基酸序列；(b)(a)的变体，该变体与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少50%同一性并具有IgG 结合活性；或(c)上述任一者的具有IgG结合活性的片段。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述分离或检测到的IgG为天然的功能活性形式。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述分离或检测到的IgG包括IgG 亚类IgGp IgG2、IgG3以及IgG4中的至少一种、优选两种、三种或所有四种。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述样品与能够结合EndoS多肽的磁性纳米颗粒群接触，且步骤(b)包括对所述接触过的样品进行磁场分离。
12.—种评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的方法，所述方法包括取含有 IgG的样品的第一小例样和第二小例样，其中，对所述第一小例样实施根据权利要求6或8 至10中任一项所述的步骤(a)和(b)，除了使用可选的能够结合非糖基化和/或变性的无活性IgG的IgG结合试剂取代EndoS多肽，对所述第二小例样实施根据权利要求6或8至 10中任一项所述的步骤(a)和(b)，以及所述方法还包括(c)对所述第一小例样中的与EndoS多肽结合的IgG的量和所述第二小例样中的与可选的IgG结合试剂结合的IgG的量进行定量；以及(d)将(c)中测定的结合的IgG的量进行比较；由此，评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述可选的IgG结合试剂包括蛋白G和/或蛋白A。
14.一种用于分离IgG的Fab或Fe片段的试剂盒,所述试剂盒包含(a)IdeS；(b)Fc结合蛋白；以及(C)从样品中分离所述IdeS和所述Fe结合蛋白的工具。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括在权利要求2中定义的 EndoS多肽，和用于从样品中分离所述EndoS多肽的工具，和/或其中所述Fe结合蛋白为蛋白H或在权利要求2中定义的所述EndoS多肽。
16.一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的试剂盒，所述试剂盒包含(a)在权利要求8中定义的EndoS多肽；以及任选地(b)用于从样品中分离所述EndoS多肽的工具。
17.一种用于测定样品中是否存在IgG的试剂盒，所述试剂盒包括(a)在权利要求8中定义的EndoS多肽；以及任选地(b)用于从样品中分离所述EndoS多肽的工具。
18.一种用于评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的试剂盒，所述试剂盒包含(a)在权利要求8中定义的EndoS多肽；(b)可选的能够结合变性和/或去糖基化的IgG的IgG结合试剂；(c)用于从样品中分离所述EndoS多肽和所述可选的IgG结合试剂的工具。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述可选的IgG结合试剂包括蛋白G和/或蛋白A和/或蛋白A/G。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的试剂盒，其中所述用于从样品中分离所述 EndoS多肽、所述可选的IgG结合试剂、所述IdeS或所述Fe结合蛋白的工具为磁性纳米颗粒群，其中各群能够结合指明的多肽/试剂/蛋白质的至少一者，以及任选地所述试剂盒还包括用于对所述样品进行磁场分离的说明书。
全文摘要
本发明提供了用于用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物及纯化与检测IgG的方法和试剂盒。本发明的用于从含有IgG的样品中分离Fab片段的方法包括(a)使所述含有IgG的样品与IdeS和Fc结合蛋白接触；(b)从所述接触过的样品中分离所述IdeS和所述Fc结合蛋白；以及由此分离Fab片段；其中所述Fc结合蛋白是缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽。
文档编号G01N33/53GK102584989SQ20121002064
公开日2012年7月18日 申请日期2008年9月11日 优先权日2007年9月14日
发明者安德斯·奥琳, 玛利亚·奥霍恩, �？恕つ崮哦�, 马蒂亚斯·科林 申请人:季诺维斯公司
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