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专利名称：小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及ー种小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
背景技术：
聚集蛋白聚糖酶在关节软骨破坏中起重要的作用，对聚集蛋白聚糖酶I和聚集蛋白聚糖酶-2的双重抑制能布效防止关节软骨的破坏。转化生长因子-β、白介素-1、肿瘤坏死因子-α活化T细胞核因子、转录因子Runx、制瘤素M、lxB激酶抑制物、金属蛋白酶抑制物、a2巨球蛋白、环孢素、雷公藤内酷、n-3脂肪酸和血小板反应蛋白结构域単元等。聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)属于带有血小板反应蛋白结构域单元的裂解素和金属蛋白酶家族，目前已经明确的聚集蛋白酶聚糖酶包括聚集蛋白聚糖酶-l(ADAMTS-4)、聚集蛋白聚糖酶-2(ADAMTS-5)和ADAMTS-8。聚集蛋白聚糖为关节软骨细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要成分之一,通常认为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在关节软骨的破坏中起决定性的作用。聚集蛋白聚糖的降解酶主要为MMPs和聚集蛋白聚糖酶。近年研究发现，在骨关节炎(osteoarthritis)软骨破坏中，聚集蛋白聚糖酶引起的关节软骨破坏比MMPs引起的聚集蛋白聚糖核心蛋白降解大约提前3周，同时抑制聚集蛋白聚糖酶-I和聚集蛋白聚糖酶_2能有效防止关节软骨破坏。基于小鼠关节炎模型的研究結果，证明无论在体内、体外实验中，取出ADAMTS-5(聚集蛋白聚糖酶-2)活性都能对抗聚集蛋白聚糖降解与保护软骨作用，而去除ADAMTS-4并不能终止软骨的破坏。这两项研究结果有力地支持了在关节炎疾病的软骨破坏中，聚糖蛋白聚糖酶_2才是主要的聚集蛋白聚糖酶。

实用新型内容本实用新型的目的是提供ー种小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒，包括盒盖、内部的酶标板和盒体，其中酶标板包括固相载体和包被层，其特征在干所述固相载体为设置有多个微孔的微孔板，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面。优选的，上述固相载体为96孔聚苯こ烯试剂板。优选的，上述包被层包被小鼠聚集蛋白聚糖抗体。优选的，上述酶标板为透明酶标包被板。优选的，上述固相载体为12孔X8条。本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，顔色的深浅与样品中小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)浓度呈正相关，450nm波长下測定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)含量。

图I是本实用新型酶标板结构示意图；图2是本实用新型试剂盒结构示意图。图中1_固相载体；2-微孔；3_包被层；4-盒盖；5_酶标板；6-盒体。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型作进ー步描述。本实用新型提供的小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒制备的主要的技术路线如下本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法測定血清或血浆样本中Agc的水平。制备过程如下使用96孔聚苯こ烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的Agc，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的Agc抗体，形成酶标板上包被的Agc和标本中的Agc竞争结合抗Agc抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人Agc的ELISA试剂盒的制备。ELISA试剂盒较RIA试剂盒有诸多优点，通过与Phoenix Pharmaceuticals, Inc.生产的RIA试剂盒进行比较，可见其操作更简单、无需特殊的实验条件且对环境和操作人员影响小，适用于普通实验室的应用。ELISA试剂盒与RIA试剂盒比较结果如表I所示。
ELISA试剂盒RIA试剂盒
样本前处理_不需__抽提样本中多肽
所需样本量50ulIml
操作时间5小时2天
灵敏度6.8pg/ml3 lpg/ml
权利要求1.一种小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒，包括盒盖(4)、内部的酶标板(5)和盒体￠)，其中酶标板(5)包括固相载体(I)和包被层(3)，其特征在于所述固相载体(I)为设置有多个微孔的微孔板(2)，所述包被层(3)附着在所述固相载体(I)的微孔表面。
2.根据权利要求I所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是，所述固相载体(I)为96孔聚苯乙烯试剂板。
3.根据权利要求I所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是，所述包被层(3)包被小鼠聚集蛋白聚糖抗体。
4.根据权利要求I所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是，所述酶标板(5)为透明酶标包被板。
5.根据权利要求2所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是，所述固相载体⑴为12孔X8条。
专利摘要本实用新型提供了一种小鼠聚集蛋白聚糖酶联免疫吸附测定试剂盒，包括盒盖(4)、内部的酶标板(5)和盒体(6)，其中酶标板(5)包括固相载体(1)和包被层(3)，所述固相载体(1)为设置有多个微孔的微孔板(2)，包被层(3)附着在所述固相载体(1)的微孔表面。本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法将标准品、待测样本加入到预先包被小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物，在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，根据标准品和样品的OD值，计算样本中小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)含量。
文档编号G01N33/545GK202583198SQ20122024732
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者励娟青 申请人:励娟青