专利名称：一种结核分枝杆菌重组蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法和应用。
背景技术：
结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis, TB )感染所致的人类疾�。欠种Ц司〉闹饕嘈停饕ü粑来�。自1882年德国科学家RrobertKoch发现TB以来，全球约有两亿人死于TB，且疫情发展日趋严重。据WHO预计，全球现有TB病人2000万，如不控制今后10年还将有9000万人发病。我国现有3. 3亿结核菌感染者，肺结核病人600多万，其中有严重传染性的病人150万，每年死于结核病的达25万人。因此，结核病的预防、早期诊断和及时治疗是高度关注的课题。MTB有H37RV与H37Ra两种标准菌株，前者为毒力株而后者为减毒突变株，它们均来源于1934年的人肺H37分离株。 与一些临床分离株不同的是，H37RV对药物敏感、利于基因工程操作并在TB动物模型中保留了完整毒力，因而该菌株被广泛应用于TB相关的生物医药研究(MTb H37RV project atSanger Institute, NCBI)。目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查(AFP)和培养法，以及分子生物学和血清学检查，这些方法多基于高特异性的抗原建立。
发明内容
本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB和其编码的一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB。一种结核分枝杆菌重组蛋白基因凡其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。一种结核分枝杆菌蛋白SocAB-murB的表达载体pET-28b-5bcy45- tfr_5,其特征在于在pET-28b中插入了其碱基序列如SEQ ID NO: I所示的基因。—种表达结核分枝杆菌蛋白的工程菌株，其特征在于它是转染了权利要求3所述的一种结核分枝杆菌蛋白的表达载体pET-28b-5bdS- /_r5的大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明的另一个目的是一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB及其编码的重组蛋白的制备方法的制备方法。一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB的制备方法，它包括以下步骤
I)提取结核分支杆菌H37RV的基因组；以其为模板，用引物
Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCARl TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGAF2 ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCTR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT进行第一轮扩增，获得基因片段^irnrB ·，2)以第一轮扩增获得的基因片段和欣/ri ，为模板，用引物
Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCAR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT
进行第二轮扩增，连接基因片段SocAB ^murB,获得目的融合基因SocABuurB。一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB的制备方法，它包括以下步骤
I)将权利要求5所述的一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB的制备方法制得的融合基因SocAB-murB,插入表达载体pET_28b中，获得质粒pET-28b-5bcy4Z - tfri 。2)将质粒pET-28b-5bdS- /r凡转染至大肠杆菌BL21 (DE3)中，诱导表达、纯化。本发明的又一个目的是，所述的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB在制备结核 分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒中作为检测抗原的应用。本发明提供的一种结核分枝杆菌重组蛋白的基因SocABiurB及其表达的一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，重组蛋白SocAB-murB具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，用本发明提供的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB作为抗原，制备的检测结核分枝杆菌抗体IgG试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了 TB感染临床诊断的需要。
图I为第二轮PCR扩增产物SocAB-murB的凝胶电泳 图2是表达质粒pET-28b- SocAB-murB的构建流程 图3是诱导后菌体12% SDS - PAGE电泳图，其中M表示Marker，I表示目的蛋白。
具体实施例方式实施例I 一种结核分枝杆菌重组蛋白基因的制备 重组蛋白基因SocAB-murB的融合
通过计算机分析TB H37RV基因组全序列，筛选出结核分枝杆菌的强抗原表位SocAB蛋白(GenBank: HM222605. I)、murB (GenBank: EU840989. I) DNA 序列，并设计扩增引物。5bc仙扩增引物
Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCA 50. 0% Tm=66. 71Rl TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGA 57. 14% Tm=64. 59murB扩增引物
F2 ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCT 60. 47% Tm=67. 79R2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 58. 33% Tm=65. 07Fl和Rl用于扩增SocAB基因的片段，F2和R2用于扩增欣/_^5基因的片段；引物Fl和R2分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物F2和Rl顺序互补，并共同对应于基因片段的5’末端序列；
结核分支杆菌H37RV(购自中国药品生物制品检定所)的菌体，加IOOmL蛋白酶K(10mg/mL),置56°C水浴消化4小时，用常规酚/氯仿法纯化，获得结核分支杆菌H37RV基因组；
以结核分支杆菌H37RV基因组为模板，以引物Fl和Rl扩增SocAB基因的片段，以引物F2和R2扩增murB基因的片段；
50 mL 扩增体系ddH20 31. 5 mL, IOXbuffer 5. O mL, 4XdNTP 4. O mL,上、下游引物混液 4.0 mL, DNA I. 5 mL, Taqplus O. 2 mL (I U)；
进行第一轮扩增；产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后切割，将含DNA条带的胶块按DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称TAKARA MiniBEST Plasmidpurification)说明回收DNA 'SocAB目的DNA片段和■/_/·/ 目的DNA片段
以第一轮PCR扩增得到的目的DNA片段和目的DNA片段为模板，加入引物Fl和R2扩增皿ri 目的DNA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图I所示；
也就是以SocAB取murB基因片段为模板用连接PCR扩增SocAB、murB融合基因，中间以4个Gly (ggtggtggtggt)连接；得融合基因片段目的DNA片段表达载体mUSocAB-inurB的构建及鉴定
质粒DNA和 SocAB-murB均经内切酶切，50 mL体系10 x buffer 5.0 mL, DNA 12mL，Xho I和Nde I各15 U，ddH20补至50 mL;37°C水浴6 h ；50 mL酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切割DNA条带琼脂块，并用DNA快速纯化试剂盒回收DNA ；
将融合基因片段克隆至pET-28b质粒(具有Xho I和Nde I酶切位点，购自华美生物公司)，20 mL 连接体系ddH2015.0 mL, 10 x buffer 2. O mL, PET_28b 2.0 mL, Pab
I.0 mL, T4DNA连接酶20 U ;质粒自身连接对照，20 mL连接反应体系ddH2 O 16. O mL,10 X buffer 2. OmL, PET_28b 2. O mL, T4DNA 连接酶 20 U ;按上述加样后，混匀、稍离心，14°C _16°C连接过夜；转化疋coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固体培养基)并挑克隆提质粒测序，确定序列正确的克隆，质粒构建图见附图2。测序引物为Fl和R2及T7 promoter和T7 terminator的通用引物。所有扩增引物和测序引物的合成以及重组质粒序列pET-28b-5bdi - /_ri 的测定都由华大基因公司提供服务。测得目的融合基因SocABimrB的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。实施例2结核分枝杆菌重组蛋白的表达、纯化
将验证正确克隆的质粒(pET-28b-转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自华美
生物公司)宿主菌，目的蛋白在包含体内进行表达将含有pET-28b- SocAB-murB,的BL21(DE3)宿主菌培养到OD 0.6，用终浓度ImM IPTG诱导表达，4小时之后收集菌体、超声破碎、高速离心、收集沉淀。对收集的沉淀用Ni柱(Pharmcia公司chelating sephrose fastflow)进行纯化，用如下溶液洗脱300mM咪唑，20mM Tris,500Mm NaCl，8M Urea。核分枝杆菌重组蛋白融合基因表达的蛋白共477个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。实施例3结核分枝杆菌重组蛋白鉴定
I、纯度和分子量的测定经SDS - PAGE电泳检测(蛋白上样量10 μ g)，为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95. 8%。分子量约为51Kd，检测结果见附图3。浓度测定经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为 3. 2±0· 15mg/mL。
活性测定用间接ELISA方法测定。包被量2. O μ g/孔，使用内部质控血清测定OD值。结果见表I。
表1结核分枝杆菌重组融合蛋白活性测定结果
权利要求
1.一种结核分枝杆菌重组蛋白基因凡其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种结核分枝杆菌蛋白SocAB-murB的表达载体pET-28b-5bcJi - tfri ,其特征在于在pET-28b中插入了其碱基序列如SEQ ID NO: I所示的基因。
4.一种表达结核分枝杆菌蛋白的工程菌株，其特征在于它是转染了权利要求3所述的一种结核分枝杆菌蛋白的表达载体pET-28b-5bdS- /_r5的大肠杆菌BL21 (DE3)。
5.一种结核分枝杆菌重组蛋白基因的制备方法，它包括以下步骤 1)提取结核分支杆菌H37RV的基因组；以其为模板，用引物Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCARl TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGAF2 ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCTR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT进行第一轮扩增，获得基因片段^irnrB ·， 2)以第一轮扩增获得的基因片段和欣/ri ，为模板，用引物Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCAR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 进行第二轮扩增，连接基因片段SocAB ^murB,获得目的融合基因SocABuurB。
6.—种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB的制备方法,它包括以下步骤 1)将权利要求5所述的一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocABimrB的制备方法制得的融合基因SocAB-murB,插入表达载体pET_28b中，获得质粒pET_28b-5bcJi - tfri ；2)将质粒pET-28b-5bdS- /r凡转染至大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达、纯化。
7.权利要求2所述的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB在制备结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒中作为检测抗原的应用。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌重组蛋白的基因SocAB-murB及其表达的一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，重组蛋白SocAB-murB具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，用本发明提供的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB作为抗原，制备的检测结核分枝杆菌抗体IgG试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了TB感染临床诊断的需要。
文档编号G01N33/68GK102660559SQ20121013057
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者于庭, 包洪, 张宇, 李艳蕾, 肖霞, 金玉芬, 黄晶 申请人:吉林大学
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